曹阳[1]2001年在《烟草细胞和发状根培养体系的建立及烟碱生物合成研究》文中指出烟碱是世界上公认的植物源杀虫物质之一，在植物源农药的开发与应用方面具有广阔的发展前景。本实验开展了以通过植物生物工程途径生产烟碱为最终目的烟草细胞与发状根培养生产烟碱的实验室研究，拟在对今后通过植物生物工程途径生产生物源烟碱及其它植物源杀虫活性物质提供实验室小试的理论依据及基础性资料。 以从俄罗斯引进的高烟碱产量黄花烟草（Nicotiana rustica L.）为实验材料，通过无菌种子苗、无菌种子苗营养繁殖苗及体细胞胚再生苗叁种途径实现其无菌外植体的连续供应； 以获得的无菌外植体，在MS、NT、B_5、F基本培养基中添加2，4-D、KT、NAA、6-BA等不同植物激素的浓度配比与组合进行愈伤组织的诱导，诱导出了适合建立烟草细胞是浮培养的胚性愈伤组织，同时得到了建立烟草液体细胞悬浮培养的生长培养基配方（NT+2，4D2mg/L+KT0.25mg/L），将获得的胚性愈伤组织转入液体生长培养基中，经多次的液体继代培养建立起了烟草细胞液体悬浮培养体系； 用A_1发根农杆菌对烟草无菌外植体下胚轴、茎段和叶片进行离体侵染与共培养以诱导发状根的产生，通过发状根的叁项重要的生物学特征初步判断为Ri-质粒转化的发状根。通过抗生素与温度的结合除菌方式除去发状根中的细菌。经过生长状况的筛选淘汰在无激素MS_o培养基中建立起了烟草发状根系列培养体系3、4、47； 在开展烟草细胞悬浮培养体系和发状根培养体系生物合成烟碱研究中，采用国际认证标准规定的（ISO2881）水蒸气蒸馏—紫外分光光度烟碱提取分析测定方法，对其烟碱进行定性的分析和含量的测定。通过在MS、NT、B_5、F基本培养基中添加不同浓度配比与组合的植物激素，及改良基本培养基中的某些营养成分，对生长已达到指数末期的悬浮培养细胞进行培养基的更换，摸索出了通过烟草细胞悬浮培养产生烟碱的生产培养基配方MS_(129)。在生产培养基中培养到约第22天、培养混合液中烟碱含量达最大值为0.358％，培养液中烟碱含量达0.23％，培养细胞烟碱干重含量高达2.05％； 筛选出了烟碱含量最高的发状根株系4，并对发状根培养高效生产烟碱的培养基进行了初步筛选，得到改良MS_o培养基配方。在该培养基中对烟草发状根系4进行培养，最终培养液中的烟碱含量达0.425％，培养发状根中最高的烟碱含量为干重的4.05％； 在发状根培养体系建立的过程中得到了激素自养的烟草愈伤组织培养株系Y_R，此株系不仅激素自养而且愈伤组织烟碱含量为鲜重的0.332％，干重的4.16。％； 研究表明，培养液中N营养的供应形式、氨基酸营养的供应、培养液中的激素调控（即培养细胞的分化控制）和培养基中的蔗糖浓度等几个指标及其相互合理的配方为烟草细胞培养中生物合成烟碱的决定因素为；通过烟草细胞与发状根培养途径得到的烟碱与常规方法生产得到的烟碱在桃蚜的触杀活性上无明显的差异；通过实验证明，通过植物生物工程途径生产植物源烟碱是可行的。
卓文强[2]2004年在《发根农杆菌对烟草的转化及发根培育和烟碱合成条件的优化》文中指出本试验研究了发根农杆菌Ri质粒转化烟草的各种影响因素,确定了最佳的转化条件,建立了烟草发根培养系统;对发根与非转化根的形态结构、生长动态进行了研究,并在悬浮条件下,进行了不同理化因子对烟草发根生长和烟碱合成调控的研究。主要结果如下: 1.本研究通过发根农杆菌工程菌Ar1334(含有野生型pRi1855质粒和pIG121HM双元载体质粒,编码NPT Ⅱ基因和GUS基因)转化烟草沙姆逊,获得了具有卡那霉素抗性烟草发状根,该发状根具有典型的发状根特性(多根毛、多分支、在无激素培养基上快速生长),通过根尖压片分析,烟草发状根不具备典型的根冠;发状根向培养液中释放烟碱,释放量最多时占总烟碱量的96.3%;在无激素的培养基上获得了再生植株。 2.对烟草发状根诱导的影响因子(诸如发根农杆菌菌株、烟草品种、叶片程度、菌液浓度、稀释倍数、浸染时间、共培养时间等)进行了研究,确定出最佳的组合条件。 3.悬浮培养中发根的生长和物质合成受多种理化因子的影响(培养基、pH值、装液量、蔗糖浓度、添加物等)的影响,本实验中,以1/2 MS液体为培养基,蔗糖20-30g/L,pH值6.0,装液量为容器体积的2/5,可添加水解酪蛋白(2g/L)和吲哚乙酸(IAA)(1mg/L),在27℃,110rpm下暗培养,25天左右收获,可达最佳效果。 4.烟草发状根培养中,激素对发状根生长和烟碱合成有较大影响。赤霉素(GA3)可显着增加发状根的生长量,但抑制烟碱的生成:IAA在合适浓度(1mg/L)既能增加发状根的生长又能促进烟碱的合成;萘乙酸(NAA)对发状根生长量和烟碱的生成无明显促进作用。
宋志红[3]2003年在《Ri质粒转化的烟草发状根培养及其烟碱生物合成调控的研究》文中认为本试验研究了发根农杆菌Ri质粒转化烟草的各种影响因素，确定了最佳的转化条件，建立了烟草发根培养系统：对发根与非转化根的形态结构、生长动态进行了研究，并以Ri质粒T-DNA上的rolC基因设计引物，对发根进行了分子检测，利用GUS报告基因检测了外源基因在发根和再生植株上的表达，为发根遗传转化提供了可靠的分子证据；并在悬浮条件下，进行了不同理化因子对烟草毛状根生长和烟碱合成调控的研究。主要结果如下： 1．本研究通过发根农杆菌工程菌LBA1334(含有野生型pRi1855质粒和pIG121HM双元载体质粒，编码NPTⅡ基因和GUS基因)转化烟草沙姆逊，获得了具有卡那霉素抗性烟草发状根，并筛选出良好的单克隆株系，该发状根具有典型的发状根特性(多根毛、多分支、在无激素培养基上快速生长)，通过根尖压片分析，烟草发状根不具备典型的根冠；发状根中烟碱含量1.61％稍高于与天然栽培品种母体根的含量(1.5％左右)，发状根向培养液中释放烟碱，释放量最多时占总烟碱量的81.1％；在无激素的培养基上获得了再生植株。 2．以Ri质粒T-DNA上的rolC基因设计特异引物，对发状根进行PCR扩增，得到了560bp的目的基因片段，证明了Ri质粒在烟草发状根的基因组中得到了整合：本试验还对烟草发状根和再生植株叶片进行了GUS组织化学检测，在烟草发状根中和再生植株叶片中检测到兰色反应，说明了GUS基因在烟草发状根和再生植株中得到表达。以上检测结果表明烟草发状根体系作为载体进行外源基因表达生产目的产物以及进行烟草品种改良的可能性。 3．对烟草发状根诱导的影响因子(诸如发根农杆菌菌株、烟草品种、叶片程度、菌液浓度、稀释倍数、浸染时间、共培养时间等)进行了研究，确定 出最佳的组合条件：以发根农杆菌工程菌株LBA1334和沙姆逊为转化体 系，选取上部幼嫩的组培苗叶片，在稀释5上0倍的对数生长期菌液 （OD60斤0个0．8）中浸泡5分钟，共培养2大，进行脱菌筛选培养，可获 得高的转化效率。 4．悬浮培养中发根的生长和物质合成受多种理化因子的影响（培养基、pH 值、装液量、蔗糖浓度、添加物等）的影响，本实验中，以 1o 液体为Z 培养基，蔗糖20上0g／L，pH值6刀，装液量为容器体积的2／5，可添加水 解酪蛋白Q）和 IAA门 人在 27”C，11 orpm下暗培养，25天左 右收获发状根，可达最佳效果。 5．烟草发状根培养中，激素对发状根生长和烟碱合成有较大影响。赤霉素 （GA3）可显着增加发状根的生长量，但抑制烟碱的生成；u跺乙酸uAA） 在合适浓度门mg／L）即能增加发状根的生长又能促进烟碱的合成；＃乙 酸（NAA）对发状根生长量和烟碱的生成无明显促进作用。 6．通过对烟草发状根培养液pH值的研究，表明烟草发状根在培养的最初8 大内，培养液pH值变化到5刀左右，一直维持到悬浮培养后期；收获时 培养液pH值与发状根生物总量呈显着的正相关。
慕萍丽, 崔红, 宋志红, 刘国顺[4]2004年在《不同理化因子对烟草发状根生长及烟碱合成的影响》文中研究表明烟草发状根的生长及烟碱合成受到光照条件、基本培养基浓度、初始pH值、激素种类和浓度等诸多因素的影响。固体培养条件下,发状根在黑暗中比在光下生长更为旺盛,但烟碱含量相对较低;液体悬浮培养条件下,1/2 MS培养基中生长的发状根细长柔软,与MS、1/4MS培养基中的发状根相比,具有较高的烟碱合成能力;激素浓度和组合以及初始pH值对发状根生长和烟碱合成也有较大影响,一个5cm长的根尖,悬浮在40 ml pH值为6.0、附加1 mg/L IAA的的1/2 MS液体培养基中,28℃、散光条件下培养30d,烟碱产量可达0.241 mg/ml。
缪国鹏[5]2014年在《基于离体培养体系的雷公藤活性次生代谢物生物合成研究》文中研究表明雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）是我国一种传统的杀虫植物，体内含有多种重要的农用活性物质，但由于该种植物资源稀缺、活性物质含量低、化学合成难度大等因素，严重制约着雷公藤杀虫植物在农药研究领域中的广泛应用。稳定高产离体培养体系的优化与放大以及通过代谢途径工程调控活性物质生物合成是解决上述问题的有效途径。在前期研究中，一方面雷公藤离体培养缺乏深入优化且没有进行放大，而另一方面雷公藤活性次生代谢物生物合成及其调控相关基因的缺失限制着代谢途径工程的实施。本研究针对上述两个问题进行了较为系统的研究，得到如下结果和结论：1.通过建立雷公藤悬浮细胞团培养体系，对其中不同大小和类型细胞团的生长和次生代谢物的累积进行了研究，结果发现，生长缓慢的细胞团（如绿色细胞团）体内的次生代谢物含量相对较高，而生长较快的细胞团（如2mm细胞团）体内次生代谢物含量远低于自然植株，因而，该细胞团培养体系不适用于工业化生产。2.通过建立雷公藤不定根离体培养体系以及对其生长和生产特性进行研究，发现其内酯醇、吉碱和次碱的含量较悬浮细胞团高。茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）诱导后3种次生代谢物的产量显着增加；XAD-7树脂对3种次生代谢物的吸附效率均较高。试验结果进一步证明，树脂不但保护了生物碱免于分解，并且由于消减了反馈抑制调节，从而进一步增加了3种代谢物的产量。结合诱导与吸附，不定根培养体系中内酯醇和吉碱的产量（652.14，1378.70μg/flask）比自然根（132.77，454.00μg/g）高出数倍，使这种培养体系具有用于工业化生产雷公藤内酯醇和吉碱的潜力。基于以上结果，将不定根置于一种改良的冒泡柱式反应器中培养，其含量与摇瓶相当，但是不定根的生长较差，仍需后续试验对培养条件进行优化。3.雷公藤抑制差减杂交cDNA文库成功富集了与MeJA诱导相关的基因。长时间MeJA处理使差减文库富集了大量有价值的途径下游的基因，如CYP450等。从文库中共发现11个推测与萜类和生物碱生物合成相关的基因，9个推测与调控相关的转录因子以及2个推测与次生代谢物转运相关的转运蛋白基因。通过对MeJA处理样品中基因表达量的测定，进一步验证了这些基因与MeJA及次生代谢物生物合成的相关性。MeJA诱导文库的构建有利于发现与次生代谢物合成相关的基因，排除不相关的旁系同源基因，从而为后续通过代谢途径工程提高目标物质产量提供了宝贵信息。4.原核表达TwHf714得到了融合有HIS尾链的融合蛋白。TwHf714可以催化二氯甲烷和甲醇（9:1, v/v）段提取物中的一种化合物生成另一种保留时间稍长的产物。由于两种化合物的保留时间与内酯醇的不符，故推测TwHf714可能没有参与内酯醇的生物合成。进一步尝试运用LC-MS鉴定底物和产物的结构时发现，两种物质均具有五环叁萜类化合物的特征离子峰，但是由于不能将复杂多样的五环叁萜类化合物有效分离，致使不能准确找出两种化合物的分子离子峰。雷公藤体内的五环叁萜salaspermic acid具有五元内酯环结构，因此，TwHf714可能参与到了催化polpunonic acid的反应中。后续可以通过选用更高效的分离技术或植物化学制备分离得到雷公藤萜类合成中间体的方法进一步揭示TwHf714基因的功能。5.利用RNAi干扰鉴定与TwHf362同源的基因TwHfCYP-1时发现，TwHfCYP-1干扰系中基因表达量的下降程度与两种生物碱含量的下降程度均呈正相关，证明了TwHfCYP-1参与着不同倍半萜吡啶生物碱所共有的生物合成步骤。本研究一方面可以帮助揭示雷公藤倍半萜吡啶生物碱的生物合成机理，另一方面也提供了一种研究雷公藤基因功能的方法。6.生物信息学分析初步证明TwMDR1（TwHf70）转运蛋白定位于根组织的质膜上并具有将生物碱转入细胞的功能。与雷公藤不定根培养体系相比，雷公藤发状根培养体系中次碱的释放率较低。通过qRT-PCR分析得出，TwMDR1在发状根中的表达量是不定根中的3.56倍，而另一种推测为生物碱运出蛋白的TwMATE1在两种组织中的表达量差异不显着。这些结果可以初步证明低释放率是较高表达水平的转入蛋白TwMDR1所引起，而非较低水平的转出蛋白TwMATE1。另外，TwMDR1与TwMATE1可以同时被MeJA所诱导，其表达增量的比值与次碱的释放率呈相关关系，初步证实两种不同类型的转运蛋白共同影响着代谢物的转运。本研究建立了一种较为适合雷公藤工业化生产的方案，初步揭示了内酯醇和倍半萜吡啶生物碱生物合成、合成调控及转运的机理，对利用离体培养来工业化生产雷公藤活性次生代谢物具有一定的指导意义，且为后期代谢途径工程提供了相关的信息和方法。
胡忠, 李庆云, 曹军[6]2002年在《药用植物基因工程的研究进展》文中提出从农杆菌诱导的转基因器官的培养、模式基因工程、目的基因的遗传转化等方面概述了药用植物基因工程研究及应用中的最新进展,并展望了今后发展的方向及前景。
李天航, 杨晶, 王艳芳, 郭咏昕, 李昌禹[7]2010年在《发状根在药用植物基因工程研究进展》文中研究表明利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)转化药用植物得到的发状根(hairy roots)具有激素自养,生长迅速,富集次生代谢产物和遗传稳定性高等特点,广泛应用于各种药用植物,为含量稀少的的中药材有效成分提供了一个高效、迅速以及大规模的生产途径,解决了天然药用植物资源短缺,有效成分含量低等缺点。本文综述了近年来发状根在药用植物基因工程中的应用,列举了目前国内外利用发状根基因工程生产次级代谢产物及表达外源蛋白的实验进展及发状根应用的其他状况。
王桂清, 姬兰柱, 张弘, 王晓伟[8]2006年在《中国植物源杀虫剂研究进展》文中提出植物源杀虫剂是当前农药研究的热点。本文介绍了中国2000年以来植物源杀虫剂最新研究进展,内容包括杀虫植物筛选、杀虫活性成分鉴定、杀虫物质的生物合成(组织培养、发状根培养和利用内生真菌)、植物源杀虫剂的作用机理、对非靶标生物的毒性和应用技术等;并就其发展趋势作了展望。
刘娟娟[9]2016年在《基于中药材抑菌杀虫作用防治当归病虫害制剂的制备》文中研究表明目的:病虫害是目前造成当归产量下降的主要原因,使用传统的化学农药抑制病虫害会带来农药残留等问题,本课题旨在研究一种新型植物源中药微乳剂来替代传统农药。实验主要对抑菌杀虫单味中药筛选以及中药以任意比例混配抑制病虫害的活性进行了研究。首先采用抑菌杀虫实验筛选出具有抑菌杀虫作用的单味中药,并进行配伍比例的筛选,得到最佳配伍比例。然后采用单因素和正交设计实验方法对提取工艺进行研究,优选出最佳提取工艺。再通过辅料的筛选对中药微乳剂的成型工艺进行研究,并根据指标性成分含量测定初步制定了简单的质量标准。最后通过高温强光实验进一步验证微乳剂的初步稳定性,以达到本课题实验设计的目的。方法:中药抑菌杀虫作用的筛选当中,抑菌实验主要是筛选抑菌较好的中药,主要采用抑菌圈法和96孔板法,其中96孔板法主要筛选具有抑菌作用的中药最小抑菌浓度,然后以同样的方法进行配伍比例的筛选。杀虫试验主要是用微量点滴法,载玻片浸渍法和虫体浸渍法对危害当归的甘蓝蚜,朱砂夜螨,粘虫进行中药活性筛选,筛选出具有杀虫活性的中药进行配伍研究。优选出最佳配伍比例之后,通过正交实验的方法筛选出最佳提取工艺,在微乳剂的成型工艺中也主要是通过正交设计选择最佳表面活性剂,配比,助溶剂以及消泡剂。采用高效液相色谱法测定复方制剂中苍术素的含量来制定简单的质量标准,通过高温强光实验测定微乳剂的稳定性。结果:通过实验确定具有抑菌杀虫作用的六味中药为苍术,百度,苦参,苍耳子,丁香,熏倒牛,且其最佳配伍比例为1:1:1:0.5:0.5:0.25,选择的主要提取溶剂为95%乙醇,最优条件为组方用6倍量的95%乙醇,提取3次,每次提取1.5小时;微乳剂组成主要是中药混合提取液,表面活性剂的量为18%,分别是十二烷基苯磺酸钙,OP-10,NP-15的配比为1:0.5:0.5,助溶剂乙醇量为7.0%,消泡剂为1.0%;通过高效液相色谱法制定的微乳剂质量标准稳定可靠,数据整齐稳定,易保存在避光阴凉的环境。
吴英, 郭安平, 孔华, 刘恩平, 郭运玲[10]2005年在《药用植物基因工程研究进展》文中进行了进一步梳理从农杆菌诱导的转基因器官的培养、模式基因工程、目的基因的遗传转化等方面概述了药用植物基因工程研究及应用中的最新进展,并展望了今后的研究方向和前景
参考文献：
[1]. 烟草细胞和发状根培养体系的建立及烟碱生物合成研究[D]. 曹阳. 西北农林科技大学. 2001
[2]. 发根农杆菌对烟草的转化及发根培育和烟碱合成条件的优化[D]. 卓文强. 中国农业大学. 2004
[3]. Ri质粒转化的烟草发状根培养及其烟碱生物合成调控的研究[D]. 宋志红. 河南农业大学. 2003
[4]. 不同理化因子对烟草发状根生长及烟碱合成的影响[C]. 慕萍丽, 崔红, 宋志红, 刘国顺. 中国烟草学会2004年学术年会论文集. 2004
[5]. 基于离体培养体系的雷公藤活性次生代谢物生物合成研究[D]. 缪国鹏. 西北农林科技大学. 2014
[6]. 药用植物基因工程的研究进展[J]. 胡忠, 李庆云, 曹军. 热带亚热带植物学报. 2002
[7]. 发状根在药用植物基因工程研究进展[C]. 李天航, 杨晶, 王艳芳, 郭咏昕, 李昌禹. 2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集. 2010
[8]. 中国植物源杀虫剂研究进展[J]. 王桂清, 姬兰柱, 张弘, 王晓伟. 中国农业科学. 2006
[9]. 基于中药材抑菌杀虫作用防治当归病虫害制剂的制备[D]. 刘娟娟. 甘肃中医药大学. 2016
[10]. 药用植物基因工程研究进展[J]. 吴英, 郭安平, 孔华, 刘恩平, 郭运玲. 热带农业科学. 2005
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