云南昆明解放军533医院 650224
【摘 要】目的 评价T-SPOT.TB、PPD、TB-DOT检测在结核病诊断中的临床应用价值。方法 利用T-SPOT.TB技术，测定36例确诊结核病患者，24例非结核疾病患者外周血单个核细胞中结核感染特异的效应T淋巴细胞的频率。同时检测两组患者的PPD和TB-DOT。结果 T-SPOT.TB敏感性、特异性分别为94.4%、84.7%，PPD敏感性、特异性分别为72.3%、58.3%，TB-DOT敏感性、特异性分别为80.6%、62.5%。结论T-SPOT.TB较其它传统方法PPD、TB-DOT对结核病诊断有高度的敏感性和特异性，值得临床推广。
【关键词】T-SPOT.TB；PPD； TB-DOT；结核病；诊断
结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。根据世界卫生组织的统计，我国是世界上22 个结核病高负担国家之一， 结核感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2 倍以上【1】，因此提高结核感染的诊断率尤其重要。目前临床应用于结核诊病诊断的金标准只有结核菌培养，但对菌阴肺结核、儿童结核及肺外结核实验室诊断仍比较困难，本文通过对36例确认结核病人及24例非结核病患者同时行T-SPOT.TB、PPD、TB-DOT等检测，探讨其对结核病的诊断临床价值，现报告如下：
1 资料与方法
1.1临床资料 确诊病例组（肺结核以肺结核诊断标准（WS288－2008）为标准；
肺外结核以症状体征及涂片抗酸杆菌和结核分支枝杆菌培养阳性为标准）36例，平均年龄32.1±10.4，男性21例，女性15例。其中骨结核、结核性脑膜炎、结核性胸膜炎、结核性腹膜炎各1例，均为结核菌培养阳性，其余为肺结核病例。对照组24例，为我科经相关检查及治疗后排除结核感染的肺部疾病，平均年龄25.3±12.4，男性18例，女性6例。
1.2仪器和试剂
中科生物的CO2培养箱，上海力申生物安全柜，科大创新低温离心机，库尔特血球分析仪，T-SPOT.TB试剂盒（英国 牛津），淋巴细胞分离液（GE）、AIM V培养基（GIBCO）、RPMI 1640（GIBCO）培养基由上海复星长征医学科学有限公司提供。PPD试验试剂（结核菌素纯蛋白衍生物的稀释剂）由成都生物制品研究所提供。TB-DOT试剂盒由上海奥普公司提供。
2 检测方法
2.1 T-SPOT.TB试验方法
2.1.1、外周血单个核细胞的分离和计数：
（1）外周抗凝全血与RPMI 1640 1：1混匀后按体积比3：1加在Ficoll淋巴细胞分离液上层，不要与Ficoll淋巴细胞分离液混合，放入水平离心机， 18℃，1000g离心22分钟。
（2）离心后用吸管（或移液加样器）将含外周血单个核细胞的液体层转移到无菌15mL尖底离心管内，加37℃预温的无血清培养液（RPMI1640）至10mL，18℃，600g离心7分钟。
（3）弃去上层液体后，将细胞沉淀重悬于1mL 37℃预温的无血清培养液（AIM V），再加37℃预温的无血清培养液（AIM V）至10ml，18℃，350g离心7分钟。
（4）弃去上层液体，加0.7ml37℃预温的无血清培养液（AIM V）重悬细胞沉淀后用血细胞记数仪进行细胞记数，按照计数结果用37℃预温的无血清培养液（AIMV）调节细胞浓度到2.5X106/mL，配成标准溶液。
2.1.2、实验过程：
（1）分别加入50μl无血清培养液（AIM V），植物血凝素PHA对照，结核菌特异抗原A（ESAT-6）和抗原B（CFP 10）于相对应的阴性对照孔、植物血凝素（PHA）对照孔、A和B检测孔。对于每份标本，加入100μl包含2.5 xl05 PBMCs的标准溶液到每个阴性对照孔、阳性对照孔和A、B两个检测孔。
（2）37℃ 5％CO2培养箱孵育16～20 小时。PBS洗板4次拍干后加入50μl稀释后的酶标抗体溶液（1：200稀释）至每个孔中。
（3）2～8 ℃孵育60 min。 200μl PBS洗板4次拍干后加入50μl底物显色溶液至所有孔中。室温孵育7 分钟。
（4）用蒸馏水或去离子水充分洗涤孔的内部并拍干。反应板置于背光、通风、干燥的环境，或置37℃孵箱。用放大镜计数每个孔中有颜色斑点。
2.1.3、结果判定标准：
阴性对照孔斑点数为0-5个，任何一个检测孔（抗原A孔、抗原B孔）计数减去阴性孔计数≥6判断为阳性。如果阴性对照斑点数≥6，任何一个检测孔（抗原A孔、抗原B孔）斑点数≥2倍阴性对照孔斑点数，判定为阳性。
2.2 PPD试验 取受试者左或右前臂掌侧下1/3处皮内注入PPD稀释液0.1ml，72h后检查注射部位的反应，测量浸润硬结横径及垂直径的平均值，浸润硬结平均直径＜5mm为阴性，＞5mm为阳性。
2.3 TB-DOT检测采集患者静脉血2-3ml，具体按试剂盒说明书操作。
3 统计学分析
检测结果均用阳性率表示，应用SPSS11.5软件进行统计学分析。
4 结果
4.1 结核分枝杆菌抗原特异T细胞反应频率与PPD、TB-DOT比较见表1
5 讨论
本研究结果显示： T-SPOT.TB、PPD、TB-DOT检测在结核病诊断中敏感性分别为94.4%、72.3%、80.6%，在特异性方面，T-SPOT.TB、、PPD、TB-DOT特异性分别为84.7%、58.3%、62.5%。在以上结果中T-SPOT.TB具有较高的敏感性（94.4%）和特异性（84.7%），国内文献报道基本一致[2]，并且T-SPOT.TB的敏感性与其它两项检查统计学有显著差异或差异。在本研究中，敏感性和特异性最低的为PPD，PPD是诊断肺结核的传统方法， 阳性者表示受试者已感染过结核杆菌，并不一定有发病，我国城市居民的结核感染率在60%以上，如PPD结果是一般阳性，其诊断意义不大【3】。
综上所述，T-SPOT.TB、PPD、TB-DOT检测在结核病诊断中T-SPOT.TB显示出高度敏感性和特异性。T-SPOT.TB试验是利用ELISPOT技术基本原理从单细胞水平检测细胞因子的一种细胞免疫学技术，其特点为检测标本易采集，检测时间短（一般2天），特别适用于儿童结核、肺外结核、菌阴肺结核、临床诊断困难病例的辅助诊断， T-SPOT.TB较其它传统方法PPD、TB-DOT对结核病诊断有高度的敏感性和特异性，值得临床推广。
参考文献：
[1]中华人民共和国卫生部.2000 年全国结核病流行病学抽样调查报告[ J ].中国防痨杂志， 2002， 24 （ 2 ） ： 65-108
[2]邹盛华，张丽水，黄明翔，毛文捷等.结核感染T 细胞斑点实验临床检测研究[ J ].中国防痨杂志，2009 ，31（9）：539
[3]成诗明，马玙.痰涂片阴性活动性肺结核的诊断治疗与管理（第1 版） [M] . 北京：人民卫生出版社，2009：32
论文作者:侯辉,张书龙,施庚寿,杜国維
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2016年6月第14期
论文发表时间:2016/11/23
标签：结核论文; 结核病论文; 特异性论文; 敏感性论文; 阴性论文; 培养液论文; 抗原论文; 《中国医学人文》(学术版)2016年6月第14期论文;