摘要：目的 采用高效液相色谱技术，建立同时测定金丝皇菊中绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含有量的方法。方法 采用Waters sunfire-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（ 0～11 min，10%→18% A；11～30 min，18%A→20% A；30～40 min，20%A→40% A；40～40.1min，40% A→10%A；40.1～45 min，10%A），检测波长： 327 nm（绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸）、348 nm（木犀草苷）流速：1.0 mL·min -1，柱温：35 ℃。 结果 绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸分别在4.34～52.04 μg·mL-1、8.82～105.79 μg·mL-1、5.91～70.87 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。平均加样回收率（n=6）分别为98.25%、97.94%、97.82%；RSD分别为2.00%、0.95%、1.12%。结论 实验方法准确、重现性好，可用于金丝皇菊中3个有效成分的测定，为金丝皇菊药用价值的开发提供科学依据。
关键词：金丝皇菊；高效液相色谱法；绿原酸；木犀草苷；3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸；含量测定
Simultaneous Determination of three Components for Imperial Chrysanthemum by HPLC
HU Xiaoxiang, ZHANG Xia *, HU Wenting , TAN Xianying, HUANG Canhua
(Chen Zhou Institute Center for Food and Drug Control, Chenzhou, 423000, China)
Absrcat: Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid, luteoloside and 3-5-O-dicaffeoylquinic in Imperial Chrysanthemum. Methods The determination of chlorogenic acid, luteoloside and 3-5-O-dicaffeoylquinic was performed on an Waters Sunfire-C18 column (250 mm×4.6 mm,5 μm), and the mobile phase was consisted of acetonitrile (A) and 0.1% phosphoric acid (B) with gradient elution (0～11 min, 10%→18% A; 11～30 min, 18%A→20% A; 30～40 min, 20%A→40% A; 40～40.1min, 40% A→10%A; 40.1～45 min, 10%A) at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The column temperature was set at 35 ℃, and the detection wavelength was set at 327 nm for chlorogenic acid and 3-5-O-dicaffeoylquinic, 348 nm for luteoloside. Results A good linearity of chlorogenic acid, luteoloside and 3-5-O-dicaffeoylquinic was in the range of 4.34-52.04 μg·mL-1, 8.82-105.79 μg·mL-1, 5.91-70.87 μg·mL-1, respectively. The average recoveries were 98.25%(RSD＝2.00%) for chlorogenic acid, 97.94%(RSD＝0.95%) for luteoloside and 97.82%(RSD＝1.12%) for 3-5-O-dicaffeoylquinic. Conclusion The accurable and reproducible method can be used for the content determination of Imperial Chrysanthemum and provide scientific basis for the development of medicinal value of Imperial Chrysanthemum.
Key words: Imperial Chrysanthemum; HPLC; chlorogenic acid; luteoloside; 3-5-O-dicaffeoylquinic; content determination
金丝皇菊是菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序，其具有很高的饮用价值、药用价值、食用价值、观赏价值。金丝黄菊作为茶饮，其气味芳香、淡雅，可消暑、清热，生津、养目。金丝皇菊性味甘，凉，不仅有清热祛风，明目解毒，还能抑制毛细血管的通透性，发挥良好的抗炎作用；对口干、火旺或寒、湿引起的肢体疼痛、麻木的疾病均有一定的疗效[1]。目前，关于金丝皇菊的研究在国内还很少见，且研究的内容基本是关于金丝皇菊的种植[2-3]和金丝皇菊中活性成分提取分离及抗氧化[4-5]，未见有效成分含量测定的报道。本研究建立的金丝皇菊中3个有效成分的含有量测定的方法，为金丝皇菊药用价值的进一步开发提供科学依据。
1仪器与试药
Agilent 1260高效液相色谱仪（配有DAD检测器，美国Agilent公司），AUW-220D电子天平（岛津公司，感量：0.01 mg），超声清洗器（昆山超声仪器有限公司），电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗器械有限公司）。
绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为：110753-201817、110720-201609、111782-201706，含量分别为：96.8%、94.9%、97.3%）。金丝皇菊分别来源于郴州市安仁县永乐江镇排山村（S1）、郴州市汝城县大坪镇堆上村（S2）、郴州市永兴县龙形市乡刘家村（S3），经中国食品药品检验研究院张继研究员菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序，甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂、试药均为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为Waters sunfire-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～11 min，10%→18% A；11～30 min，18%A→20% A；30～40 min，20%A→40% A；40～40.1min，40% A→10%A；40.1～45 min，10%A），检测波长： 327 nm（0～15 min）、348 nm（15～20 min）、327 nm（20～45 min），流速：1.0 mL·min-1，柱温：35 ℃。进样量：10 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品适量，用甲醇定容至刻度，制成混合对照品储备溶液（分别为86.73 μg·mL-1、176.32 μg·mL-1、118.12 μg·mL-1)。
2.2.2供试品溶液 取本品粉末（过三号筛）约0.25 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、溶剂空白各10 μL，注入高效液相色谱仪。结果表明，供试品中绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰达到较为理想的分离效果；空白溶剂色谱与对照品色谱相应的位置上未出现保留时间相同的色谱峰，表明无干扰，结果见图1。
2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，6.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。以进样质量浓度（μg·mL-1）为横坐标（X），峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸线性回归方程分别为：Y =31.244X+19.935（r=0.9992）、Y =28.177X+49.921（r=0.9992）和Y=35.266X+54.103（r=0.9993）。结果绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸分别在4.33～52.02μg·mL-1、8.82～105.82 μg·mL-1、5.91～70.88 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液5 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪中，连续进样6 次，测得峰面积。绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD分别为0.58%、0.37%和0.27%，实验结果表明该方法的精密度良好。
2.3.4 稳定性试验 精密吸取同一份供试品（编号S1）溶液10 μL，分别在0、4、8、12、16、24 h依次进样，测定峰面积，绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD分别为2.28%、1.34%和1.35%，结果表明供试品溶液24 h 内稳定。
2.3.5 重复性试验 精密称取同一批样品（编号S1）6份，照“2.2.2”项下制备，得供试品溶液，进样10 μL测定峰面积。绿原酸平均含量为3.3915 mg·g-1、木犀草苷平均含量为8.0453 mg·g-1、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸平均含量为6.5559 mg·g-1，RSD分别为1.56%、1.17%、1.75%。
2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的样品（编号S1）6份，约0.25 g，精密称定，置锥形瓶中，分别精密加入50 mL含绿原酸对照品溶液（16.30 μg·mL-1）、木犀草苷对照品溶液（30.72 μg·mL-1）20 mL、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品溶液（27.57 μg·mL-1）甲醇溶液，按“2.2.2”项下方法，制备供试品液，进样10 μL，记录峰面积，计算得平均回收率（n=6）分别为98.25%、97.94%、97.82%；RSD分别为2.00%、0.95%、1.12%。结果见表1。
2.4 含量测定 取不同产地的样品，取约0.25 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，测定峰面积，计算含量，结果见表2。
3 讨论
3.1色谱条件的选择
采用二极管阵列检测器在波长200～400 nm 分别对绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品溶液进行紫外扫描，它们最大吸收波长分别为327 nm、 348 nm和327 nm。故本文选用327 nm作为绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的检测波长，348 nm作为木犀草苷的检测波长。中药材成分多而复杂，对多指标成分同时测定时，流动相的选择尤为重要。依据文献方法[6-7]，本文比较了甲醇-0.2%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液，分别进行梯度洗脱。实验结果表明，采用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱，绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的分离效果好，分离度达到要求，峰形较好。
3.2提取条件的选择
本文比较了不同溶剂（乙醇、70%乙醇、甲醇、70%甲醇），不同提取方法（超声和加热回流提取），不同提取时间（0.5h、1h、1.5h）对目标物提取的影响，实验结果显示，以甲醇作为提取溶剂，加热回流1 h时，绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸提取率为最高。故本文选择了甲醇，加热回流1 h作为金丝皇菊供试品提取的条件。
3.3 结论
本研究建立了 HPLC 法测定金丝皇菊3个成分的含量，方法简便、准确，为金丝皇菊药用价值的开发提供科学依据。
参考文献
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论文作者:胡小祥,张霞，胡雯婷，谭贤英，黄灿华,
论文发表刊物:《中国结合医学》2019年第07期
论文发表时间:2019/9/10
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