(广西桂林市人民医院 广西 桂林 541002)
【摘要】目的：探讨缩短快速冰冻切片制片时机的新方法。方法：以一次性刀片、恒温冷冻切片机对30例患者手术切除的新鲜组织标本进行切片取材，每例患者均以常规冰冻切片方法取2片病理切片，分别作为实验切片和对照切片。实验切片制片时，以甲醇、甲醛混合液固定，碱性水返蓝；对照切片制片时梯度酒精固定，自来水返蓝；观察实验切片和对照切片的制片时间，镜下比对实验切片和对照切片的细胞表现。结果：实验切片制作时间（7min）明显短于对照切片制作时间（22min）。镜下观察，实验切片的细胞结构和形态比较完整，特别是甲状腺癌的细胞成分和病变结构显示清晰，对照切片则对比度较差，细胞核表现不佳。结论：冰冻切片制片时以甲醇、甲醛混合液固定，碱性水返蓝能显著缩短制片时间，提高部分切片染色质量，有助于病理诊断快速准确的完成。
【关键词】冰冻切片；制片时间；固定方法；染色方法
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）15-0393-02
冰冻病理是指术中切取小块活组织，包埋后冻结于-20℃左右，切成薄片并染色，进行镜下观察、诊断，以帮助临床确定手术方案的一项技术，是临床手术科室与病理科室间的一种较为特殊的紧急会诊模式[1]。一般情况下，临床医生会在病理送检后直接等待诊断结果并以此为据确定后续治疗方法，因此，在保证诊断准确的前提下缩短病理诊断时间可有效减少患者在手术台上的等待时间，对降低患者术中风险和意外具有积极作用[2]。文章现对一种新型的能够缩短制片时间的快速冰冻切片方法进行分析和研究，具体报道如下：
1.资料与方法
1.1 研究材料
样本：选取我院30例患者手术切除的新鲜组织标本，切片主要包括乳腺、甲状腺、肿瘤、卵巢、胆囊等，成分鲜活。每例患者均取2片病理切片，分别作为实验切片和对照切片。仪器：医用一次性刀片，KD-2950低温恒冷切片机。试剂：OCT冰冻切片包埋剂，酒精，Hrris苏木素染液，碱性水，伊红，盐酸酒精、二甲苯。
1.2 方法
取材：实验切片和对照切片均以常规冰冻切片方法在术中进行取材。注意要避开出血区域、坏死区域及脂肪；切割勿锉动、夹取勿过紧，以防止组织细胞变形。同时，尽量剔除毛发、钙化组织等不相关成分 。理想样本体积为（2.0×2.0×0.3）cm3，小组织取材以干纱布托底，防止脱落。
包埋：将样本平整的放在冷冻托中央上，样本边缘以适量OCT冰冻切片包埋剂封住，以保证切片时，边缘不卷曲。对于小组织样本，可先取适量OCT冰冻切片包埋剂滴在冷冻托上，待冻住以后将样本放在上面，使其垫高，再常规包埋冰冻。冰冻采用急冻模式，以保证样本能在短时间内达到较低温度，防止结晶。冰冻温度：甲状腺-(19±1)℃；卵巢、胆囊-(21±1)℃；乳腺-(26±4)℃；淋巴-18℃
切片：切片以切出样本组织最大面为宜，厚度5μg。操作要求用力均匀，刀速缓慢，以每分钟8转为宜。切片时，以捞片毛笔（预先冷冻）压住切片前缘，防止卷曲。切下后，取干净载玻片，快速将展平的切片贴附在上面。
固定：实验切片以甲醇、甲醛混合液固定，浓度比1:9，切片入混合液5s后清水冲洗即可。对照切片行梯度酒精固定，即切片依次入无水酒精（2次）、95%酒精（2次）、80%酒精（1次）和70%酒精（1次）中，持续时间分别为30s、30s、5s、5s。
染色：以Hrris苏木素染液对固定好切片实验切片和对照切片进行染核，浸入时间5min，取出冲洗，1%盐酸酒精分化5s。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆实验切片以碱性水返蓝（40℃洗衣粉水）30s，待颜色鲜艳后清水冲洗；对照切片以清水返蓝5min。随后，两组切片均0.7%伊红5-8s，清水冲洗后，常规脱水、透明、中性树胶封固。脱水采用梯度酒精法，依次入95%酒精（2次）和无水酒精（2次），实验切片持续时间分别为5s和10s，对照切片持续时间分别为1min和2min；透明采用二甲苯（2次），实验切片浸入10s，对照切片浸入2min。
1.3 观察指标
观察实验切片和对照切片的制片时间，镜下比对实验切片和对照切片的细胞表现。
2.结果
2.1 制片时间
实验切片：混合液固定5s，苏木素染核5min，碱性水返蓝30s，酒精脱水30s，二甲苯透明20s，分化、伊红、冲洗等数秒，耗时约7min。
对照切片：酒精固定2min以上，苏木素染核5min，清水返蓝5min，酒精脱水6min，二甲苯透明4min，分化、伊红、冲洗等数秒，耗时超过22min。
2.2 两组切片镜下细胞表现
镜下观察可见，实验切片细胞结构明显比对照切片清晰，形态表现也更为完整。细胞核与细胞质呈现出对比鲜明的蓝色和粉色，细胞成分与病变结构特点清晰可见，尤其甲状腺癌中表现明显，与苏木精—伊红染色观感相似。而甲状腺癌实验切片所对应的对照切片则染色模糊，对比度差，细胞核表现不佳，两者表现差异明显。另外，镜下观察乳腺癌细胞，实验切片和对照切片中细胞形态和组织结构未见明显差异。
3.讨论
在快速病理诊断中，切片质量是影响病理诊断准确性的最直接因素[3]，而病理诊断时间是患者临床手术时间的重要组成，病理诊断耗时长，会延长患者在手术台上的时间，增加患者痛苦。由此可见，提高切片质量、缩短诊断时间是提高诊断准确性、保证有效疾病治疗的关键。
在病理诊断中，制片工作消耗了大部分的时间，为提高切片制片完成速度，本研究采用1:9甲醇、甲醛混合液进行冰冻切片固定，其主要机制在于甲醇对组织具有很强的穿透力，以此辅助对组织具有良好固定作用的甲醇，能够在保证固定质量的同时缩短固定时间。不仅如此，甲醇还具有较强的脱水能力，可以增加细胞结构表明极性，从而增强对染料的吸附作用，提升染色效果[5]。在返蓝方法上，本研究参照酸碱中和原理，以碱性水代替清水去酸来中止分化，其去酸速度不仅比自来水快，而且蓝化作用强，能提高苏木精染上的细胞核变的蓝色效果，使细胞核颜色更鲜明，与细胞质比较更突出，便于镜下观察。此外，由于甲醇吸附染色液中的水，试验切片以1:9甲醇、甲醛混合液固定后，脱水、透明等流程耗时均能缩短且不影响染色效果。
本次试验结果显示，实验切片制作时间（7min）明显短于对照切片制作时间（22min）。镜下观察，实验切片的细胞结构和形态比较完整，特别是甲状腺癌的细胞成分和病变结构显示清晰，切片治疗优于对照切片,与王玉芳[6]等人的研究结论相符，提示冰冻切片制片时以甲醇、甲醛混合液固定，碱性水返蓝能显著缩短制片时间，提高部分切片染色质量，有助于病理诊断快速准确的完成，具备临床使用价值。
【参考文献】
[1]孙海斌，孙永武，王旭东等.冰冻切片联合细胞病理学检查应用于乳腺肿块诊断的临床分析[J].中国老年学杂志，2013，33(1):200-201.
[2]吴王飞，陈迅，程雪等.加热法预防快速冷冻切片脱片的应用体会[J].医学信息，2015，28(7):45-46.
[3]许平，王筱璨，陈奎生等.快速冰冻切片制备方法的改进[J].郑州大学学报（医学版），2010，45(2):241-243.
[4]胡亚轩，刘建忠，高夫燕等.基于冰冻切片法的固液悬浮浆体稳定性分析[J].中国电机工程学报，2015，35(13):3345-3350.
[5]李静，孙保存，刘增辉等.2839例术中冰冻切片诊断与术后石蜡切片诊断的对比研究[J].天津医科大学学报，2013，19(6):471-473.
[6]王玉芳，徐晓艳.缩短快速冰冻切片制片时间的新方法[J].山西医科大学学报，2014，45(5):431-433，封3.
论文作者:谭夏明,袁莲香
论文发表刊物:《医药前沿》2017年5月第15期
论文发表时间:2017/6/1
标签：切片论文; 冰冻论文; 时间论文; 制片论文; 苏木论文; 病理论文; 酒精论文; 《医药前沿》2017年5月第15期论文;