曹君（沈阳市和平区疾病预防控制中心结核病防治所 110000）
【摘要】 为探讨聚合酶链反应（PCR）DNA 扩增对诊断活动性肺结核的临床价值，本文用PCR 技术扩增结核杆菌特有的MPB64 蛋白基因序列，对121 例病人临床标本进行检测，发现34 例活动性肺结核中有28 例P C R 阳性，疑诊为肺结核者33 例中有18 例阳性，非结核肺疾患54 例中有10 例阳性，其中有肺结核既往史者阳性6 例，有结核接触史者阳性3 例。提示PCR 阳性并非为活动性肺结核所特有。
【中图分类号】R521 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）32-0131-02
结核菌属生长缓慢菌，培养分离大约需8 周，B A C T E C 系统虽可能缩短培养时间， 也需1-2 周。P C R 技术结核杆菌（T B）D N A 扩增可缩短检出时间，但是在实际检测临床标本时，P C R 结果对肺结核诊断的价值尚未确定。本文用P C R 方法扩增结核杆菌M P B64 蛋白D N A 序列，对121 例患者的痰、支气管冲洗液、支气管肺泡灌洗液和胸水等标本进行检测，以评价P C R 结果对肺结核临床的诊断的意义。
一、资料和方法
1 病例及临床标本
121 例住院病人，根据结核菌检测阳性，胸部X 线检查有活动性结核病变的特征表现，肺或胸膜标本病理诊断为结核及临床已排除其它原因引起的胸膜炎等，共确诊肺结核34 例( 继发性肺结核19 例；粟粒型肺结核1 例；结核性胸膜炎14 例)；依据胸部X 线检查怀疑活动性肺结核或有异常阴影伴低热、咳嗽、盗汗等按肺炎治疗2 周观察，未见吸收， 疑似肺结核33 例。除外肺结核54 例（肝癌18 例；支气管哮喘2 例；肺炎15 例；癌性胸水19 例），其中既往有肺结核史者10 例，结核接触史者7 例，入院后取晨痰，纤支镜下取支气管冲洗液或支气管肺泡灌洗液， 经胸穿取胸水标本，用结核杆菌标准菌株D N A 作为阳性对照，无菌生理盐水作为阴性对照。
2 PCR 检测
标本经前处理后，D N A 提取按H e r m a n s 介绍的方法进行，引物按Manjunath 等报告的寡核苷酸序列。
引物Ⅰ：5′ -GCTCTCGCGAGTCT-AGGCCA-3′
引物Ⅱ：5′ -TCCGCTGCCAGTCGTC-TTCC-3′
D N A 扩增在25 m l 反应体系内含10X 扩增缓冲液2.5 m l，引物混合物2 ml，4X 核苷酸2 ml，标本DNA 模板5 ml，Tag 聚合酶1.5u, 置扩增仪内扩增，92℃变性30 秒，55℃退火50 秒，72℃延伸40 秒，循环30 次，最后延伸300 秒。取扩增产物5m l ,2% 琼脂糖凝胶电泳，紫外线下检测，阳性者可见240bp 区带。
3 抗酸染色。
各标本涂片按萋尼氏法进行抗酸染色，在油镜下观察300 个视野， 3 个菌以上为阳性。
三、结果
1.PCR 检测结果
121 例中，活动性肺结核34 例，PCR 阳性28 例，疑似肺结核33 例， 有18 例阳性，除外肺结核54 例有10 例阳性（表一）
不同病种PCR 扩增结果（%）
2. 抗酸染色与PCR 结果的关系
121 例抗酸染色阳性11 例，同时PCR 阳性10 例。
三、讨论
本组研究用结核分枝杆菌M P B64 蛋白编码基因部分序列为引物进行P C R 检测。M P B64 蛋白为结核分枝杆菌复合群（M T B C）所特有的蛋白质，用其编码基因部分序列作为引物，对M T B C 的细菌具有很高的特异性，可将M T B C 与其他分枝杆菌区别开来，可检出相当于10 个结核杆菌的D N A，而涂片抗酸染色标本含菌须在5000-10000 个/ m l , 才能出现阳性。本研究活动性肺结核34 例标本抗酸染色阳性11 例，占32.4%（11/34）， 而P C R 阳性82.4% ( x2 检测，P ＜ 0.05)， 可见P C R 技术作为更敏感的方法可明显地提高结核菌的检出率。临床疑似肺结核患者P C R 检测阳性占54.5%（18/33），提示P C R 检测在疑似肺结核病的诊断中有一定意义，但该部分P C R 阳性病例是否就可确诊为活动性肺结核尚需进一步研究。
非结核组54 例有10 例PCR 呈阳性，此中有结核病既往史者10 例， P C R 阳性6 例，有结核密切接触者7 例，P C R 阳性3 例。这些患者P C R 阳性的出现显然会给临床诊断活动性结核带来一定困惑。根本原因可能与以下因素有关：①肺结核临床治愈后，结核菌仍可在肺内残留， 并可少量间断地排除体外，用常规细菌学方法很难检出，而用非常敏感的P C R 方法有可能检出；或治愈后肺内有结核死菌和D N A 残留，其基因片断可被P C R 方法扩增出现阳性；②临床无症状或症状很轻的结核菌L 型感染所致“无反应性结核病”，临床上未诊断为肺结核，但其细菌D N A 可被P C R 方法检出；③本研究虽使用了防止检测交叉污染措施， 但也难免有检测污染所致的假阳性。故如何排除假阳性是P C R 结果分析所面临的一个重要课题。
本组活动性肺结核有17.6% P C R 阴性，原因尚不清楚，可能是排菌极少或间断排菌；标本中含有T a g 酶抑制剂；L 型结核菌胞壁缺陷及细胞膜代偿性增厚等致D N A 提取困难。另有1 例抗酸染色阳性但P C R阴性，除以上因素外，可能与非典型分枝杆菌感染有关。
本研究发现，P C R T B - D N 扩增诊断活动性肺结核较涂片抗酸染色阳性率高但特异性差，且其阳性并非活动性结核所特有。总之，用结核菌P C R - D N A 扩增作为临床诊断活动性肺结核的常规项目，目前尚存在一些问题，需在检测技术上改进以减少交叉污染，同时也应在结核病基础理论方面进一步研究，从而更好地用P C R 结果来解释临床现象。
参考文献
[1] 屠德华.《关于制订肺结核病诊断标准的意见》. 中国防痨通讯， 1990，12：86.
[2] 侯淑莲， 孙秀娟，张惠荣，等.《应用PCR 检测脑脊液中结核杆菌的研究》. 中国防痨杂志，1994，16：121.
[3] 黄谷良，林特夫，郭秉兰等编著.《细菌L 型与疾病》. 北京: 学苑出版社，1991：40.
论文作者:曹君
论文发表刊物:《中外健康文摘》2013年第32期供稿
论文发表时间:2014-1-7
标签：阳性论文; 肺结核论文; 活动性论文; 结核论文; 结核菌论文; 标本论文; 引物论文; 《中外健康文摘》2013年第32期供稿论文;