李雪梅, 姚嘉斐[1]2006年在《端粒酶抑制剂对顺铂不同敏感性卵巢癌细胞株的影响》文中进行了进一步梳理目的:通过检测顺铂(CDDP)敏感株和耐药株在经CDDP处理前后的端粒酶活性变化,了解端粒酶活性与CDDP耐药性的关系,及端粒酶抑制剂迭氮胸苷(AZT)和全反式维甲酸(AT-RA)对CDDP不同敏感性的卵巢癌细胞株的影响,试图寻找一个解决常规化疗耐药问题的新方法。方法:将卵巢癌CDDP敏感株A2780和耐药株CAOV3、OVCAR3在不同浓度的CDDP、AZT和ATRA中培养,TRAP-ELISA法检测端粒酶活性,MTT法检测药物对细胞增殖的影响。结果:未加CDDP时,敏感株和耐药株的端粒酶活性没有明显差别,经CDDP处理后敏感株的端粒酶活性明显降低,而耐药株没有明显变化。端粒酶抑制剂对CDDP敏感株和耐药株的细胞增殖都有明显的抑制作用。结论:通过不同方式抑制端粒酶活性,均可抑制CDDP敏感株和耐药株的细胞增殖。端粒酶的活性与卵巢癌细胞株对CDDP的耐药性有关。
李雪梅[2]2003年在《端粒酶抑制剂对顺铂不同敏感性卵巢癌细胞株的影响》文中指出目的 卵巢癌是严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤，其死亡率占妇科肿瘤的首位。化疗在卵巢癌治疗中占有重要地位，但耐药性的产生使得化疗对卵巢癌的总体生存率的改善并不乐观。细胞生物学认为：细胞的永生化是细胞癌变的必经之路。而端粒酶在机体不协调的活化，可以使端粒延长，这是产生细胞不死化的根源。 本实验通过检测顺铂敏感株和耐药株在经顺铂处理前后的端粒酶活性变化，并通过抑制端粒酶的活性，了解端粒酶抑制剂对于顺铂不同敏感性的卵巢癌细胞株的影响，试图从一个新的角度寻找解决常规化疗耐药问题的方法。 材料和方法 一、细胞株：采用对铂类化疗药物敏感的人卵巢上皮性癌细胞株A2780，对铂类化疗药物耐药的人卵巢上皮性癌细胞株CAOV3和OVCAR3。 二、细胞培养：使用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养液培养细胞，将细胞浓度调整至2×10~4／ml，取0.1ml细胞悬液加入96孔培养板中培养。 叁、药物：CDDP、AZT、ATRA 1、叁种细胞株分别在1×10~(-5)M、3×10~(-5)M、5×10~(-5)M、8×10~(-5)M、10×10~(-5)M CDDP中培养24小时。 2、叁种细胞株分别在3×10~(-4)M、6×10~(-4)M、10×10~(-4)M，或4×10~(-5)M、6×10~(-5)M、8×10~(-5)M AZT中培养4天。 3、叁种细胞株分另 10－’M、10－’M、10－‘M Ah培养6 X 四、药物对细胞增殖抑制作用和端粒酶活性的检测 药物对细胞增殖抑制作用使用MTh方法检测，细胞增殖抑制率用公式＊－OD删／OD＃＊ X 100表示。每个实验重复一次。 端粒酶活性采用TRAP－EllSA方法进行检测，用端粒酶产物总量O PrDdllCt geneed，TPG）来表达： TPG ＝一川h－B）／i］／［（R－B）／RI］IX 100。 TP在、TIs和RI分别代表待测样本的吸光度值、单纯的裂解缓冲液的吸光度值、待测样本的内对照、标准对照的吸光度值和标准对照的内对照。每个样本重复检测4次。 五、统计学处理 数据使用均值上标准差K土S）表示。用析因设计的方差分析检验药物对不同种细胞作用的差异性。用直线回归分析方法检测药物的剂量效应关系。P＜o．防为有统计学意义 结 果 一、未加处理因素时，敏感株A2780和耐药株CAOV3。OVCAR3的端粒酶活性没有明显差别，经 5 X 10十M CDDP处理后敏感株A2780的端粒酶活性明显降低，而耐药株CAOV3和OVCAR3的端粒酶活性没有明显变化。 二、对于 A2780和 CAOV3，3 X 10－‘M、6 X 10－‘M、10 X 10’‘M的Ay’可以明显的抑制其细胞增殖和端粒酶活性，且存在剂量效应关系。该药对敏感株A2780和耐药株CAOV3的作用没有差别。而对于 OVCAR3，4 X 10‘’M、6 X 10－’M、8 X 10－’M的 Ay’就可以明显抑制细胞的增殖，但此浓度的Ai’对OyCAR3的端粒酶活性无明显作用。 叁、对于 A2780和 CAOy3／＊M＊一M的 ATRA可以明显 ·2·的抑制细胞的增殖和端粒酶活性。并且该药对敏感株A2780和耐药株OyCAR3的作用没有差别。 结 论 l、CDDP对敏感株和耐药株细胞的增殖抑制作用有显着差异。 2、CDDP处理前敏感株和耐药株的端粒酶活性没有明显差异。经CDDP处理后，敏感株的端粒酶活性明显降低，而耐药株的端粒酶活性没有明显变化。 3、反转录酶抑制剂AZT可以抑制卵巢癌细胞株的端粒酶活性和细胞的增殖，并且存在剂量效应关系。 4、分化诱导剂ATRA可以抑制卵巢癌细胞株的端粒酶活性和细胞的增殖。 5、通过抑制端粒酶活性，可以抑制CDDP敏感株和耐药株的细胞增殖，并且对敏感株和耐药株的影响没有明显的差别。
胡嘉[3]2005年在《SeO_2对人卵巢癌耐药细胞株耐药性的影响》文中研究指明目的:探讨SeO_2(二氧化硒)对体外培养的人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP 细胞耐药性的影响及其可能的作用机制。方法:用MTT 法检测体外培养的COC1、COC1/DDP细胞在单独SeO_2作用下及在SeO_2与DDP(顺铂)不同顺序联合作用下的增殖抑制,并以VRP(异搏定)为对照剂,对比SeO2与DDP 不同顺序联合作用对COC1/DDP 细胞的增殖抑制作用;用流式细胞术检测单独SeO_2作用及在SeO_2与DDP不同顺序联合作用下COC1/DDP 细胞的凋亡程度;用电镜检测COC1/DDP 细胞在单独SeO_2及与DDP 联合作用下的凋亡现象;用间接免疫荧光标记法在流式细胞仪上检测COC1/DDP 细胞在SeO2 单独及与DDP 联合作用下的Survivin 蛋白的表达水平。结果:(1)SeO_2单独作用时对COC1、COC1/DDP 细胞的增殖抑制作用随SeO_2浓度升高而明显增强,COC1 细胞的抑制率由22.52%渐增至70.83%,COC1/DDP 细胞的抑制率由2.7%渐增至46.17%,其最适作用浓度约为10 umol/L;在各浓度下SeO2对COC1细胞的增殖抑制作用明显大于其对COC1/DDP细胞的增殖抑制作用,差异有显着性(P<0.05);15 umol/LSeO_2、30 umol/LSeO_2与10μg/mlDDP 对COC1、COC1/DDP 细胞的抑制作用差异无显着性(P>0.05)。(2)在SeO_2 与DDP(顺铂)联合作用时,所有给药顺序中COC1/DDP 细胞的抑制率由高到低依次为:SeO2+DDP 组>DDP+间隔24h+SeO2组>SeO2+间隔24h+DDP 组,其中前两组抑制率差异无显着性(P>0.05),且SeO2与DDP 同时给药时可使COC1/DDP 细胞与COC1 细胞对顺铂有相同的敏感性。(3)与逆转剂对照组VRP+间隔24h+DDP 组相比,SeO_2+DDP 组及DDP+间隔24h+SeO2 组抑制率明显高于逆转剂对照组(P<0.05),SeO_2+间隔24h+DDP 组抑制率与逆转剂
赵素芬[4]2010年在《破壁灵芝孢子粉提取物抑制人卵巢上皮性癌细胞生长、转移及逆转顺铂耐药的研究》文中进行了进一步梳理目的:卵巢癌是危害女性健康的叁大妇科恶性肿瘤之一,而卵巢上皮性癌占卵巢癌的90%,由于缺乏有效的早期诊断及治疗方法,75%的患者就诊时已属晚期。目前彻底的肿瘤细胞减灭术和新型化疗是治疗卵巢癌的主要手段。约有70%的晚期患者可因化疗耐药而导致治疗失败使得卵巢癌易复发、转移和产生多药耐药性,导致卵巢癌的5年存活率尚不到30%,病死率仍居妇科恶性肿瘤的首位,成为严重威胁妇女生命的疾病。因此,寻找有效的抑制肿瘤生长、转移以及逆转耐药的有效制剂,并研究其抗肿瘤及逆转铂类化疗药耐药的机制成为当前卵巢癌治疗研究的重要课题。近年来,天然药物以其低毒、高效的独特优势越来越受到国内外学者的广泛关注,从中草药和天然植物中提取抗肿瘤成分已成为获得有效抗癌制剂和耐药逆转剂的重要途径。灵芝孢子是一种已被广泛应用于肿瘤治疗的天然植物产品。体内外实验表明灵芝孢子具有明显抗肿瘤活性。国内外研究报道灵芝孢子对乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、直肠癌、前列腺癌、白血病、肝癌、黑色素瘤等肿瘤细胞的生长、侵袭、转移能力有明显的抑制作用,而且能增强顺铂的抗肿瘤效应。但至目前为止灵芝孢子在卵巢癌治疗方面的研究国内外均未见报道,为探讨灵芝孢子对人卵巢癌细胞生长、转移以及对顺铂化疗耐药的影响,本课题以多个卵巢上皮性癌细胞系为研究对象,以破壁灵芝孢子粉提取物为处理因素,应用细胞增殖抑制实验(WST-1比色法)、光学显微镜观察法、细胞计数法、Hoechst-33258染色方法、流式细胞技术、克隆形成实验、多细胞球体形成实验、细胞迁移实验、细胞侵袭实验以及western blot方法等,对其进行研究。目的在于①研究破壁灵芝孢子提取物对卵巢上皮性癌细胞的生长抑制作用、诱导凋亡作用及其机制。②研究破壁灵芝孢子提取物对卵巢上皮性癌细胞的粘附、侵袭、转移能力的抑制作用及相关机制。③探讨破壁灵芝孢子提取物对人卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞化疗耐药的逆转作用及其机制。为灵芝孢子的进一步开发以及在卵巢上皮癌的临床应用提供理论依据。方法:1细胞培养:体外常规培养人卵巢上皮癌细胞株OV2008、C13*、A2780S、A2780CP、SKOV3以及人卵巢上皮细胞株IOSE398。2破壁灵芝孢子粉工作液制备:加拿大energene天然药品有限公司提供的破壁灵芝孢子粉溶于DD-H2O配制成50mg/ml的灵芝孢子储存液。高温灭菌、离心后取上清,用0.20μm微孔滤膜过滤器过滤除菌,保存于4℃冰箱。实验前以细胞培养液稀释成相应浓度的灵芝孢子液。3破壁灵芝孢子粉提取物对人卵巢上皮性癌细胞增殖的抑制作用:以合适的密度接种细胞,待细胞贴壁后加入不同终浓度的破壁灵芝孢子液,48h用WST-1比色法及人工计数活细胞法检测灵芝孢子粉对人卵巢上皮性癌细胞增殖的抑制作用,显微镜下观察细胞形态的改变。利用WST-1比色结果的OD值计算药物对细胞生长的抑制率,细胞抑制率=1-实验组平均OD值/对照组平均OD值×100%。IC50用Logit法计算。4流式细胞术测定破壁灵芝孢子提取物对人卵巢上皮性癌细胞凋亡及细胞周期分布影响:接种细胞于6cm培养盘,细胞贴壁后分别加入终浓度为0.5,1,2mg/ml的灵芝孢子粉溶液,对照组为不含药物的细胞培养液。处理48h以不同的方法分别收集细胞,用流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期改变。5 Hoechst-33258染色法评估破壁灵芝孢子对人卵巢上皮性癌细胞凋亡的影响:细胞分为对照组和处理组,处理组分别加入终浓度为0.5,1,2mg/ml的灵芝孢子粉溶液,对照组加入不含药物的细胞培养液,培养细胞48h后,Hoechst-33258染色法观察细胞核变化,判断凋亡情况。6破壁灵芝孢子提取物抑制人卵巢上皮性癌细胞生长能力测定:不同浓度破壁灵芝孢子处理人卵巢上皮性癌细胞,利用克隆形成实验、悬滴培养多细胞球体形成实验检测灵芝孢子对人卵巢上皮性癌细胞生长抑制情况,同时设不含药物的对照组进行实验。7破壁灵芝孢子提取物抑制人卵巢上皮性癌细胞侵袭和转移能力测定:在体外用不同浓度灵芝孢子处理不同的人卵巢上皮性癌细胞,利用细胞黏附实验、细胞迁移运动(划痕)实验、细胞侵袭实验,检测人卵巢上皮性癌细胞粘附、侵袭和转移能力的变化,同时设不含药物的对照组进行实验。8人卵巢癌顺铂耐药细胞株的顺铂耐药性及破壁灵芝孢子提取物逆转其耐药作用的测定:实验分为单独应用顺铂、单独应用破壁灵芝孢子提取物以及顺铂与灵芝孢子联合应用叁组,采用WST-1方法、人工计数细胞法及显微镜观察法检测人卵巢上皮性癌细胞顺铂敏感细胞和耐药细胞增殖的抑制作用。分别计算抑制率、耐药倍数及逆转倍数,以判定顺铂的耐药性以及破壁灵芝孢子能否逆转其耐药性。耐药倍数=耐药细胞的IC50/非耐药细胞的IC50。逆转倍数=顺铂单独处理组的IC50/灵芝孢子联合顺铂处理组的IC50。9 Western blot技术检测相关蛋白表达:细胞接种于6孔板,分成不同的实验组进行处理。第一组:不同浓度破壁灵芝孢子液(0、1、2mg/ml)处理细胞48h后提取总蛋白蛋白样品经12%SDS -聚丙烯酰胺凝胶(检测cleaved casep- ase-3用15% SDS -聚丙烯酰胺凝胶)90V电压进行电泳分离,之后电转移至硝酸纤维素滤膜上,测定bcl-2和Bax,cleaved- caspase3 , P27凋亡相关蛋白表达情况以探讨破壁灵芝孢子抑制人卵巢上皮性癌细胞凋亡机理。第二组:不同浓度破壁灵芝孢子液(0、0.5、1、2mg/ml)处理人卵巢上皮癌细胞48h后提取总蛋白测定粘附及转移相关蛋白E-cadherin, N-cadherin、vimentin、MMP9以及TIMP-1的表达情况了解灵芝孢子抑制人卵巢上皮癌细胞侵袭、转移的机理。第叁组:bcl-2、Akt、P-Akt、P53蛋白在人卵巢上皮癌顺铂耐药细胞株A2780CP及敏感细胞株A2780S的表达测定。细胞接种于6孔板,培养48h提取总蛋白,比较两种细胞bcl-2、Akt、P-Akt、P53蛋白的表达情况,明确顺铂耐药细胞株和敏感细胞株耐药相关蛋白的不同表达。第四组:不同浓度破壁灵芝孢子液(0、0.5、1、2mg/ml)处理A2780CP和A2780S细胞48h后提取总蛋白测定bcl-2、Akt、P-Akt、P53蛋白的表达情况,了解单独应用破壁灵芝孢子对耐药相关蛋白的表达影响。第五组:接种A2780CP细胞后分为破壁灵芝孢子单独处理组(破壁灵芝孢子浓度为0.5mg/ml)及破壁灵芝孢子(0.5mg/ml)与顺铂(浓度为5umol/L)联合处理组进行处理。提取处理人卵巢上皮性癌细胞48h的总蛋白测定bcl-2、Akt、P-Akt、P53蛋白的表达,以判定灵芝孢子逆转耐药的机理。均以β-actin为内参照。?结果:1破壁灵芝孢子粉提取物抑制人卵巢上皮性癌细胞增殖:不同浓度的破壁灵芝孢子处理人卵巢上皮性癌细胞后倒置显微镜下观察到活性细胞数目减少,并呈浓度依赖性,高浓度(大于2mg/ml)破壁灵芝孢子组可见细胞脱离培养皿壁成悬浮状态,致贴壁存活细胞数目极少。采用WST-1比色法及人工细胞计数法检测的结果与显微镜下观察到的结果相似。经WST-1结果确定0.5mg/ml的灵芝孢子可以作为低毒剂量(细胞生长率大于80%)用于逆转耐药实验。2破壁灵芝孢子提取物诱导人卵巢上皮性癌细胞凋亡并造成细胞周期G1期阻滞:Hoechst-33258染色后可以观察到人卵巢上皮性癌细胞凋亡现象,表现为细胞核缩小,染色质浓缩,药物浓度越大凋亡细胞越多。并且流式细胞技术可以检测到破壁灵芝孢子处理人卵巢上皮性癌细胞72h后可以出现凋亡峰,凋亡率随浓度增加而升高。流式细胞技术检测结果表明破壁灵芝孢子作用人卵巢上皮性癌细胞后多数细胞聚集于G1期,并且G1期细胞数目随作用时间延长而增加。而G2/M期细胞数目较少,且G2/ M细胞随作用时间延长而减少,S期细胞数目随作用时间无明显改变。3破壁灵芝孢子提取物抑制人卵巢上皮性癌细胞克隆形成能力:经破壁灵芝孢子处理的人卵巢上皮性癌细胞克隆形成数目明显少于对照组,并呈浓度依赖性,即随着灵芝孢子浓度逐渐增加克隆数目逐渐减少,计算克隆形成率逐渐降低,而且单个细胞克隆的大小及组成克隆的细胞数也随灵芝孢子浓度的增加而递减。4破壁灵芝孢子粉提取物抑制人卵巢上皮性癌细胞粘附能力:不同浓度灵芝孢子处理人卵巢上皮性癌细胞3h及6h后的粘附细胞数量较对照组均有减少。5破壁灵芝孢子粉提取物抑制人卵巢上皮性癌细胞多细胞球体形成:在悬滴培养条件下,对照组人卵巢上皮性癌细胞呈聚集生长,于悬滴形成后24h细胞即可聚集成团,之后细胞呈立体生长形成多细胞球体,至第四天球体体积最大,呈圆形,外形规则,细胞间粘附紧密。实验组细胞间粘附性降低,形成的多细胞球体较松散,形状不规则,随灵芝孢子浓度增加形成球体的能力减低。6破壁灵芝孢子粉提取物抑制人卵巢上皮性癌细胞迁移能力:不同浓度的破壁灵芝孢子处理人卵巢上皮性癌细胞后可观察到对照组SKOV3细胞迁移活跃,划痕后24h几近完全愈合;而灵芝孢子处理组细胞迁移能力明显受到抑制,随着药物浓度的增加抑制作用增强,即划痕的愈合面积逐渐降低,并呈一定的剂量依赖关系,2mg/ml的高浓度组显示不仅划痕的宽度无明显变化,且细胞呈现明显受抑制状态。实验组24h迁移面积较对照组明显减低,差异有统计学意义,P<0.05。7破壁灵芝孢子提取物抑制人卵巢上皮性癌细胞侵袭能力:侵袭实验表明破壁灵芝孢子处理人卵巢上皮性癌细胞skov3后实验组与对照组比较侵袭至微孔滤膜上的细胞数明显不同,浓度为0、0.5、1和2mg/ml的破壁灵芝孢子处理后其侵袭的细胞数分别为162.8±8.1, 132.8±6.5, 65.2±3.9 and39.2±1.3,可见实验组侵袭细胞数明显低于对照组,且实验组中随灵芝孢子浓度的增加侵袭细胞数逐渐减少,即侵袭率逐渐减少,差异具有统计学意义,(P<0.05)。8顺铂对敏感细胞株A2780S和耐药细胞株A2780CP的抑制作用:为了解顺铂对卵巢癌敏感细胞株和耐药细胞株的抑制作用,用浓度比例为4:1的顺铂分别处理A2780CP和A2780S细胞48h,经WST-1测定和倒置显微镜下所观察到两种细胞的抑制率相似,提示A2780CP对顺铂的敏感性较A2780S明显降低。采用同一浓度(5umol/L)的顺铂处理两种细胞48h后A2780S数目明显少于A2780CP,经计算顺铂对A2780S细胞的抑制率显着高于对A2780CP的抑制率,其IC50分别为10.32和29.94mg/ml,提示A2780CP对顺铂具有耐药性,耐药倍数约为2.9倍。9破壁灵芝孢子粉提取物增强顺铂的抗肿瘤作用并逆转A2780CP细胞对顺铂的耐药性:WST-1结果显示灵芝孢子和顺铂联合应用组较单独应用顺铂组对A2780CP细胞的抑制率明显提高,其IC50由单用顺铂的29.94降低至12.16umol/L,表明灵芝孢子可以逆转A2780CP对顺铂的耐药性,逆转倍数为2.46。该结果与细胞计数及显微镜观察的结果相似。10破壁灵芝孢子对人卵巢上皮性癌细胞凋亡、侵袭及耐药相关蛋白表达影响:第一组:Western blot方法检测到凋亡抑制蛋白bcl-2、bcl-xl随破壁灵芝孢子浓度增加而下降,而促凋亡蛋白bax及P27、casepase-3逐渐升?高,并且35KD的Casbase-3被激活成活化的19,20KD的cleaved-casep- ase3,并随破壁灵芝孢子浓度增加表达呈升高趋势。第二组:破壁灵芝孢子作用细胞后实验组E-cadherin、TIMP-1的表达水平均高于对照组;而N-cadherin、vimentin及MMP-9的表达水平均低于对照组,并且随灵芝孢子浓度的增加而呈浓度依赖性改变。第叁组:Western blot结果表明耐药细胞A2780CP bcl-2、AKT、P-AKT的表达明显高于A2780S,而P53的表达则低于A2780S细胞。不同浓度破壁灵芝孢子处理A2780CP后P53蛋白水平随灵芝孢子浓度增加而增加;而bcl-2、Akt、P-Akt水平则逐渐降低。破壁灵芝孢子联合顺铂处理耐药细胞较单独应用顺铂bcl-2、Akt、P-Akt的表达水平明显降低;而P53的表达水平明显升高。结论:本文在国内外首次研究了破壁灵芝孢子提取物对人卵巢上皮性癌细胞的多种抗癌作用以及逆转人卵巢上皮癌顺铂耐药细胞株对顺铂的耐药性并初步探讨其机理。1破壁灵芝孢子粉提取物具有抑制人卵巢上皮性癌细胞生长及诱导凋亡的作用,其机制是作用于细胞周期的G1期,造成G1期阻滞,并可以通过上调bax、P27,下调bcl-2并活化casepase-3而发挥其作用。2破壁灵芝孢子粉提取物在体外可抑制人卵巢上皮性癌细胞侵袭和转移,其可能的机制是抑制细胞粘附、上调E-cadherin及TIMP-1表达、降调N-cadherin、vimentin及MMP-9的表达。3破壁灵芝孢子提取物能增强人卵巢上皮癌细胞对顺铂的敏感性,有效逆转卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780CP的耐药性,其可能的机制是抑制Akt、P-Akt及bcl-2,增强P53蛋白的表达。综上所述,本研究证明了破壁灵芝孢子提取物对人卵巢上皮性癌细胞具有多种抗癌作用,可以抑制卵巢癌细胞生长、侵袭和转移,诱导细胞凋亡,增强卵巢癌细胞对顺铂化疗的敏感性并能逆转人卵巢癌顺铂耐药细胞株对顺铂的耐药性。因此,具有抗癌效应的灵芝孢子可以作为卵巢癌常规化疗手段的有益补充,联合新辅助化疗可以提高疗效利于更彻底的肿瘤细胞减灭术。用于术后化疗可以协同化疗药物提高化疗效果,预防及逆转对卵巢癌化疗药物顺铂的耐药,可以作为有效的辅助治疗卵巢上皮癌的抗癌制剂。本研究为灵芝孢子在卵巢上皮癌的临床应用提供了理论依据,填补了灵芝孢子在卵巢癌应用方面的空白。
王燕利[5]2016年在《XAV939对卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制及顺铂增敏作用》文中研究表明背景与目的卵巢癌,以卵巢上皮性癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)为主,是女性妇科肿瘤相关死亡的主要原因,也是妇科最致命的恶性肿瘤。据统计,1999-2010年间我国卵巢癌的总体粗死亡率为7.91/10万,年龄校正总死亡率为5.35/10万[1]。由于缺乏用于早期诊断的特异性指标及该病发病的隐匿性,大部分卵巢上皮性癌患者因症状出现而就诊时已处于临床晚期,而传统的化疗方案则因癌细胞化疗药物抗性的产生难以达到治疗效果,使得该病的治疗遇到了前所未有的挑战[2]。因此,更好地研究与卵巢癌发生发展及耐药性获得相关的分子机制,从而找到早期诊断灵敏度高的特异性指标和针对性强且副作用小的分子靶向治疗药物已迫在眉睫。最近一些国内外学者均发现,目前在肿瘤治疗方面研究相当火热的Wnt/β-catenin通路的活化可能参与了卵巢癌的发生发展及其化疗药物的耐受[3;4]。研究证明在卵巢上皮性癌中存在一些表达上调的Wnt/β-catenin通路成员蛋白,例如细胞外信号蛋白Wnt-1、通路核心蛋白β-catenin及下游靶基因转录蛋白c-myc、cyclinD1,其中β-catenin参与了卵巢癌细胞的异常增殖和转移。因此,如果找到可以抑制该通路中任意环节的靶向性药物,我们便有望解决化疗药物毒副作用大和肿瘤耐药这两大世界性难题,为每一位肿瘤患者带来希望。端粒酶作为端粒长度的“守卫员”,早在上世纪末就被证明在许多恶性肿瘤中表达上调,其中也包括妇科死亡率最高的卵巢癌,murakami等[5]通过对卵巢良性、交界性及恶性肿瘤组织的分析发现,92%的组织中端粒酶呈现高表达,且肿瘤分化程度与酶的活性呈现负相关。目前,有不少学者正在尝试将端粒酶的特异性抑制剂应用于肿瘤的治疗中,主要集中于肝癌、鼻咽癌、胃癌及卵巢癌等方面,也取得了一定的成效,但并没有为肿瘤的获得性药物耐受问题带来帮助。端锚聚合酶(tankyrase)是一种多功能蛋白酶,其一方面利用糖基化功能抑制tankyrase1/2的活性,为端粒酶提供作用位点并维持染色体末端稳定性;另一方面则可增加锚蛋白的稳定性,进而加速β-catenin降解,介导wnt/β-catenin通路的正向运行。xav939是huang,s.m等[6]学者于2009年基于抑制β-catenin转录而筛选出的wnt/β-catenin通路特异性小分子抑制剂,他们利用定量化学蛋白质组学方法发现,其发挥作用主要依赖于介导锚蛋白稳定性的增加,促进该通路的“开关蛋白”β-catenin的降解,进而对肿瘤达到治疗效果。本次研究将端锚聚合酶抑制剂xav939作用于人卵巢腺癌顺铂原发耐药细胞株(skov3细胞株),并检测细胞用药后的增殖、凋亡情况及细胞核质内tankyrase、cyclind1和β-catenin的表达情况,以期为卵巢癌小分子靶向治疗药物的研发和耐药的逆转提供新的方向。材料与方法人卵巢癌skov3细胞体外复苏并培养至对数期,将这些细胞分为端锚聚合酶抑制剂(xav939)组、顺铂组、两者联合组及对照组,以mtt法分别检测不同药物浓度作用下各组细胞的增殖及抑制情况;再以流式细胞技术检测不同浓度的xav939对skov3细胞的凋亡及细胞周期的影响;然后以westernblot法检测skov3细胞中tankyrase、cyclind1及β-catenin的表达情况,并以不同浓度的xav939作用于skov3细胞48小时后再次检测叁种蛋白表达量的变化。实验所得计量数据以spss20.0软件进行分析,检验水准定为α=0.05。结果1、XAV939及DDP对SKOV3细胞的生长抑制作用:XAV939与DDP在体外对卵巢癌SKOV3细胞均有一定的抑制作用,且抑制作用的强弱与药物作用浓度及作用时间呈现正相关,即存在浓度和时间的依赖现象(P<0.05)。2、XAV939对SKOV3细胞的顺铂增敏作用:以0.8μM的XAV939分别联合DDP各浓度作用于SKOV3细胞48小时后,小浓度时细胞抑制率高于DDP单药组,SKOV3细胞对顺铂的敏感性增加(IC50(DDP)=69.059μg/ml IC50(XAV939+DDP)=52.254μg/ml)。3、XAV939对SKOV3细胞细胞周期及凋亡的影响:细胞周期及凋亡检测显示,与对照组相比XAV939作用后细胞的凋亡率随着药物浓度的增加呈增高趋势,差异统计学意义显着(F=512.78,P<0.05)。增加XA939作用浓度后,细胞呈现G0/G1期阻滞(P<0.05),S期细胞所占百分比下降,且呈现明显的浓度依赖(P<0.05)。4、XAV939对SKOV3细胞中Tankyrase、CyclinD1、β-catenin蛋白表达量的影响:蛋白免疫印迹结果显示,Tankyrase、cyclinD1、β-catenin在卵巢癌SKOV3细胞中均呈现高表达;当XAV939作用后叁者的表达量均明显下降。结论1.XAV939及DDP单药于体外对人卵巢癌SKOV3细胞株具有一定细胞毒作用,且具有时间及剂量依赖的特点。2.XAV939与DDP合用时可增加SKOV3细胞对DDP的敏感性,加速细胞的凋亡。3.XAV939可能通过降低Tankyrase和β-catenin蛋白的表达,从而抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖。
胡晓霞[6]2005年在《基质金属蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究》文中研究表明卵巢癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,它的5 年存活率低。侵袭和转移是卵巢癌重要的生物学特征,是引起卵巢癌患者死亡的主要原因。基质金属蛋白酶(MMP)通过降解细胞外基质(ECM)在肿瘤的侵袭和转移中起了关键性的作用。而基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)可抑制MMPs 的活性,MMPs 和TIMPs 的平衡失衡可导致肿瘤浸润和转移。本研究的目的是探讨基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢癌中的表达及与卵巢癌侵袭转移的关系,同时探讨反义核酸及RNA 干扰技术对MMP-9 基因的抑制作用及对卵巢癌细胞生物学行为的影响,并探讨使用RNAi 作为一种新的基因治疗的方法。应用RT-PCR 方法检测48 例卵巢癌、21 例良性卵巢肿瘤及22 例正常卵巢组织中MMP-9、2、7 及TIMP-1、2、3 mRNA 的表达情况,进行阳性率及半定量的比较,将结果与临床及病理资料进行统计学分析,并进行单因素生存分析及Cox 回归模型分析。结果显示MMP-9 阳性表达率和MMP-9、MMP-2 半定量值在卵巢恶性肿瘤组织中明显高于正常卵巢组织(P<0.05);TIMP-2、MMP-7、TIMP-3 在卵巢恶性及良性肿瘤组织中的阳性表达率及半定量值明显高于正常卵巢组织,MMP-9/TIMP-1 在卵巢恶性肿瘤组织中的比值(0.91±0.67)明显高于正常卵巢组织(0.15±0.34);MMP-9 表达水平与卵巢恶性肿瘤的手术病理分期及预后有关,在Ⅲ-Ⅳ期患者中的表达(1.13±0.66)显着高于Ⅰ-Ⅱ期(0.60±0.54)患者(P<0.05),其阳性患者中位生存时间为43.00±17.12 个月,其累积生存率为47.37%,明显低于MMP-9 阴性者(100%)。经Cox 模型多因素生存分析,MMP-9、MMP-2、TIMP-2及残余灶大小可作为卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。研究结果提示MMP-9、MMP-2、MMP-7、TIMP-2、TIMP-3 基因在卵巢恶性肿瘤组织中的表达增加。MMP-9的高表达及MMP-9与TIMP-1 的平衡失调在晚期卵巢癌的发展中起重要作用,MMP-9 有可能作为监测晚期卵巢癌患者预后的一个指标。利用人卵巢癌组织进行RT-PCR扩增TIMP-1基因cDNA,获目的片段(631bp)连接至pcDNA4载体,转化大肠杆菌TOP10筛选阳性克隆并鉴定,并对克隆的全长片段进行DNA序列测定,构建人基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)真核表达重组质粒。利用聚合酶
田丽娜[7]2008年在《腺病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞逆转耐药的体外实验研究》文中进行了进一步梳理目的研究在腺病毒载体介导的RNA干扰ERCC1基因表达的基础上,联合顺铂作用于卵巢癌细胞敏感株SKOV3和顺铂耐药株SKOV3/DDP,观察此重组腺病毒(Ad-hTERT-ERCC1-siRNA)是否对卵巢癌细胞敏感株具有化疗增敏作用及对耐药株具有逆转耐药作用,以及其作用与药物剂量的关系,为逆转卵巢癌顺铂耐药提供实验依据,为临床改善卵巢癌患者的预后提供新方法。方法第一部分:采用直接感染法、台盼蓝活细胞计数、MTT、Hoechst染色法及流式细胞仪检测等方法,研究腺病毒载体介导的RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞敏感株SKOV3的生长抑制作用及其对卵巢癌顺铂化疗的增敏作用。第二部分:采用直接感染法,应用台盼蓝活细胞计数法、MTT法、Hoechst染色法及流式细胞仪检测等方法,研究腺病毒载体介导的RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞顺铂耐药亚株SKOV3/DDP的逆转耐药作用。结果第一部分1.SKOV3细胞株顺铂IC_(50)值为7.76μg/ml,腺病毒载体介导的RNA干扰ERCC1基因表达对SKOV3细胞生长有一定的抑制作用;2.Ad-hTERT-ERCC1-siRNA对SKOV3细胞顺铂敏感性的影响:与对照组相比,用1、10、50、80MOI的重组腺病毒感染后,对顺铂的敏感性分别增加了9.4%、16.4%、23.2%、33.5%,Ad-hTERT-ERCC1-siRNA能提高SKOV3细胞的顺铂敏感性,并呈剂量依赖性;3.Hoechst染色法观察,梯度滴度Ad-hTERT-ERCC1-siRNA联合顺铂作用于SKOV3细胞株,细胞凋亡显着增加;4.流式细胞仪分析发现,Ad-hTERT-ERCC1-siRNA感染并联合顺铂用药,G_1期细胞比例减少,S期细胞比例增加;细胞凋亡率进一步增加。第二部分1.SKOV3/DDP细胞株顺铂IC_(50)值为13.93μg/ml,耐药指数为1.79,Ad-hTERT-ERCC1-siRNA对SKOV3/DDP细胞生长有一定程度抑制作用;2.Ad-hTERT-ERCC1-siRNA对SKOV3/DDP细胞顺铂耐药的影响:与对照组细胞相比,用1、10、50、80MOI的腺病毒感染后,对顺铂的敏感性分别增加了11.1%、16.7%、26.4%、33.5%。可见Ad-HTERT-ERCC1-siRNA能部分逆转SKOV3/DDP细胞的顺铂耐药性,并呈剂量依赖性;3.Hoechst染色法观察,梯度滴度Ad-hTERT-ERCC1-siRNA联合顺铂作用于SKOV3/DDP细胞株,细胞凋亡显着增加;4.流式细胞仪分析发现,Ad-hTERT-ERCC1-siRNA感染并联合顺铂用药G_1期细胞比例增加,S期细胞比例增加;细胞凋亡率进一步增加。结论1.重组腺病毒Ad-hTERT-ERCC1-siRNA对卵巢癌细胞SKOV3及其顺铂耐药亚株SKOV3/DDP有一定程度生长抑制作用;2.重组腺病毒Ad-hTERT-ERCC1-siRNA可以增加SKOV3细胞对顺铂的敏感性,可以部分逆转SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性,且与病毒滴度有关;3.重组腺病毒表达载体Ad-hTERT-ERCC1-siRNA以ERCC1基因为靶点,可通过干扰ERCC1基因表达、调节肿瘤细胞周期分布、诱导肿瘤细胞凋亡等途径而发挥增加SKOV3细胞顺铂敏感性、部分逆转SKOV3/DDP细胞顺铂耐药性的作用。
杨茗钫[8]2009年在《二氧化硒对人耐顺铂卵巢癌裸鼠皮下移植瘤作用的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:用SKOV3/CDDP耐药细胞株建立人卵巢癌SKOV3/CDDP耐药细胞株动物模型,通过观察二氧化硒合并顺铂组裸鼠皮下耐药细胞株SKOV3/CDDP移植瘤的生长情况,分析皮下移植瘤组织P-糖蛋白表达和肿瘤细胞凋亡率,初步探讨二氧化硒对卵巢癌顺铂耐药的增敏作用机制。方法:将人卵巢癌SKOV3/CDDP细胞接种于20只SPF级雌性BALB/C裸鼠皮下,待瘤长成约为10 mm×10 mm时,随机分成对照组和治疗组,对照组给予生理盐水0.4ml/只,治疗组分为顺铂组(DDP组),腹腔内注射DDP 3 mg/kg 0.2ml+生理盐水0.2ml;二氧化硒组(SeO2组),每只裸鼠腹腔内注射SeO2 30ug/ 0.2 ml+生理盐水0.2ml;顺铂联合二氧化硒组(SeO2+DDP组),每只腹腔内注射DDP 3 mg/kg 0.2ml+SeO2 30ug/ 0.2 ml。每叁天腹腔给药一次,共四次。观察各组肿瘤成瘤率、平均抑瘤率以及不同处理组对裸鼠体重、食欲及精神状态的影响。测量每次给药后瘤体体积变化,绘制肿瘤生长曲线;并取各组瘤体组织标本分别行病理检查,用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡率,免疫组化法检测肿瘤细胞P-gp的表达。结果:各组裸鼠成瘤率均为100%。SeO2组及SeO2+DDP组对移植瘤的生长有明显抑制作用,与其它组比较有显着性差异(P﹤0.05)。DDP组、SeO2组、SeO2+DDP组的平均抑瘤率分别为41.69%、48.29%、72.28%,联合用药组与其他治疗组比较有显着性差异(P﹤0.05)。各组肿瘤平均细胞凋亡率分别为5.2%、24.1%、25.9%、45.43%,且联合用药组S期细胞明显减少。SeO2组、SeO2+DDP组P-gp的阳性表达水平明显低于DDP组及对照组(P﹤0.05),其阳性表达率(对照组、DDP组、SeO2组、SeO2+DDP组)分别为:59.85%、50.41%、35.67%、22.33%。结论:1.顺铂联用二氧化硒对于耐药卵巢癌生长具有明显的抑制作用;2.二氧化硒有增强卵巢癌对顺铂的敏感性,可以减轻顺铂化疗引起的副作用;3.二氧化硒和顺铂对诱导耐药卵巢癌细胞凋亡可能有协同作用;4.二氧化硒能降低P-糖蛋白的阳性表达水平,这可能是增加耐药卵巢癌对顺铂敏感性的重要机制之一。
金岩[9]2006年在《槲皮素逆转HepG2细胞对顺铂耐药性机制的研究》文中研究说明目的探讨槲皮素及槲皮素与顺铂联合应用对HepG2肝癌细胞增殖和凋亡的影响及机制,从而探索槲皮素逆转HepG2细胞对顺铂耐药性的可能机制,为槲皮素应用于临床肝癌的治疗提供理论依据。方法采用MTT检测槲皮素及槲皮素联合顺铂对HepG2细胞增殖影响;用Annexin-v-FITC联合PI及流式细胞仪检测槲皮素及槲皮素联合顺铂处理后HepG2细胞的凋亡变化;免疫组化及图象分析系统测定槲皮素、顺铂及槲皮素联合顺铂处理HepG2细胞24小时后Bcl-2及Bax的表达变化。结果槲皮素能抑制HepG2细胞增殖及促进其凋亡,且有剂量效应关系(P<0.05);在其他条件相同情况下,槲皮素联合顺铂与相同浓度顺铂单用相比,前者对HepG2细胞的抑制作用更显着(P<0.05);不同浓度槲皮素与顺铂联合与顺铂单处理相比,前者显着提高了HepG2细胞的凋亡率(P<0.05),且与槲皮素的浓度有量效关系;顺铂处理后存活的HepG2细胞Bcl-2表达上调、Bax表达下调及Bcl-2/Bax的比率值升高,而槲皮素与顺铂联合处理后,存活的HepG2细胞Bcl-2、Bax及Bcl/Bax的比率值变化则相反。结论槲皮素有抗肝癌及促进顺铂对HepG2细胞的化疗作用,其可能机制是通过促进细胞Bcl-2表达下调和Bax的表达上调逆转HepG2细胞对顺铂的耐药性。
刘静[10]2012年在《卵巢癌肿瘤干细胞对顺铂和盐霉素的药物敏感性研究》文中认为目的检测卵巢癌干细胞对顺铂、盐霉素的药物敏感性，并比较两者对卵巢癌干细胞的杀伤作用。方法采用无血清悬浮培养法从人卵巢癌细胞株SKOV-3中分离肿瘤干细胞并采用流式细胞技术检测干细胞标志性因子CD44。人卵巢癌SKOV-3细胞及人卵巢癌干细胞经盐霉素、顺铂作用48h后采用CCK-8比色法检测细胞存活率，计算半数致死量(IC5。）。取第48小时时间点的半数抑制浓度作用于悬浮培养的第5代悬浮细胞48h后-，收集药物生存细胞(DSC),采用RTPCR技术检测DSC的叁磷酸腺苷结合转运蛋白Bl(ABCB1)基因及叁磷酸腺苷结合转运蛋白G2(ABCG2)基因的转录水平。结果无血清悬浮培养法富集的人卵巢癌微细胞球高表达CD44抗原。盐霉素、顺铂作用第48小时时间点卵巢癌SK0V-3细胞IC50为（62.50±2.53)、（3.62±0.38)y mol/L,卵巢癌干细胞IC50分别为（48.81±2.83)、（3.80±0.22)u mol/L。卵巢癌干细胞对顺铂耐药指数（RI)为2.12±0.41,明显高于盐霉素RI(0.78±0.08)，差异有显着性（t=6.22,P<0.05)。盐霉素组DSC细胞ABCB1、ABCBG2基因表达水平明显低于顺铂组(t=7.49,9.75,P<0.05)o结论人卵巢癌干细胞对盐霉素药物敏感性显着高于顺铂。盐霉素对卵巢癌干细胞的杀伤作用大于顺铂。人卵巢癌干细胞对顺铂及盐霉素敏感程度不同可能与其高表达ABCB1、ABCBG2蛋白有关。
参考文献：
[1]. 端粒酶抑制剂对顺铂不同敏感性卵巢癌细胞株的影响[J]. 李雪梅, 姚嘉斐. 实用妇产科杂志. 2006
[2]. 端粒酶抑制剂对顺铂不同敏感性卵巢癌细胞株的影响[D]. 李雪梅. 中国医科大学. 2003
[3]. SeO_2对人卵巢癌耐药细胞株耐药性的影响[D]. 胡嘉. 江西医学院. 2005
[4]. 破壁灵芝孢子粉提取物抑制人卵巢上皮性癌细胞生长、转移及逆转顺铂耐药的研究[D]. 赵素芬. 河北医科大学. 2010
[5]. XAV939对卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制及顺铂增敏作用[D]. 王燕利. 郑州大学. 2016
[6]. 基质金属蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究[D]. 胡晓霞. 广西医科大学. 2005
[7]. 腺病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞逆转耐药的体外实验研究[D]. 田丽娜. 天津医科大学. 2008
[8]. 二氧化硒对人耐顺铂卵巢癌裸鼠皮下移植瘤作用的实验研究[D]. 杨茗钫. 南昌大学. 2009
[9]. 槲皮素逆转HepG2细胞对顺铂耐药性机制的研究[D]. 金岩. 华中科技大学. 2006
[10]. 卵巢癌肿瘤干细胞对顺铂和盐霉素的药物敏感性研究[D]. 刘静. 青岛大学. 2012
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