湖南省妇幼保健院 湖南长沙 410008
摘要：目的 分析孕妇血浆或血清进行胎儿性别鉴定的效果，进而明确无创性产前基因诊断的可行性。方法 选取2012年10月~2014年10月在我院接受产科围产保健的孕妇45例为实验研究对象，所有孕妇均为自愿参加到实验研究中，在SRY基因的高保守区进行两对性别特异性引物的设计，应用Nest-PCR（巢式聚合酶链反应）扩增45例产妇血清或血浆中胎儿的游离核酸，通过DNA测序和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析确定扩增产物的准确性。结果 本次实验研究的45例产妇中，分娩男婴26例，其血浆阳性检出率为46.2%；血清阳性检出率为34.6%；分娩女婴19例，其血清和血浆均为出现阳性结果。结论 在对胎儿性别进行确定的过程中，可以直接利用孕妇的血浆或者血清来鉴别，这在临床上为无创产前基因诊断提供了一个新的想法和思路，值得给予临床推广和运用。
关键词：孕妇血浆；孕妇血清；胎儿遗传信息；产前基因诊断；聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
产前诊断指的是在胎儿未出生之前利用各种诊断方法和技术对胎儿是否患有某种遗传病、先天性疾病以及性别等进行诊断的一种方法和手段，对于提高新生儿的质量，控制新生儿的发病率有着较为积极的临床作用和意义[1]。实施产前诊断的主要方法有超声波检查、羊膜穿刺术、经皮脐血抽样、绒膜绒毛取样、早期羊膜穿刺术、胎儿活组织检查等方法，处理超声波诊断外其余的方法均需要进入孕妇的宫腔进行胎儿遗产物质的去除，对胎儿和孕妇均具有一定的潜在危害，而超声波诊断的准确性和敏感度均相对较低，因此就应该对新型的无创产前诊断技术进行分析和研究[2]。本文选取选取2012年10月~2014年10月在我院接受产科围产保健的孕妇45例为实验研究对象，对孕妇血浆或血清进行胎儿性别鉴定的效果进行了探讨和分析，对无创性产前基因诊断的可行性进行了明确，并取得了相对较为满意的效果，现将实验结果总结报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料
本文选取2012年10月~2014年10月在我院接受产科围产保健的孕妇45例为实验研究对象，其中年龄最大的孕妇有39岁，年龄最小的孕妇有24岁，孕妇的平均年龄为（28.45±1.38）岁，其中孕周最长的为39周，孕周最短的为9周，孕妇的平均孕周为（22.68±4.33）周，其中孕周小于12周的早孕期孕妇有7例，孕周在13~28周之间的中孕期孕妇有13例，孕周在29~40周之间的晚孕期孕妇有25例。本次实验研究中参加反应的血清和血浆均通过本科室自行研制的吸附剂进行处理，给予洗脱和溶解并取10ul参加反应。
1.2引物
本次实验研究中的引物为两对Y染色体上SRY基因高保守区特异性巢式引物的设计，引物的序列分别为作为第一轮PCR引物的上游引物（P3）：5’-GAATATTCC-CGCTCTCCGGAG-3’和下游引物（P4）：5’-ACCT-GTTGTCCAGTTGCACT-3’，期扩增片段的长度均为419bp；作为第二轮PCR引物的上游引物（P5）：5’ACTCAGAGATCAGCAAGCA 3’和下游引物（P6）：5’CTTCCGACGAGGTCGATAC 3’，其扩增片段的长度分别为143bp。
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1.3扩增体系
在实验研究中首轮扩增参照25ul反应系统进行，主要的包括的内同有25ul的10X缓冲液，浓度严格控制在2.5mmol/L的Mg+，终浓度为20umol/L的dNTPS以及0.5ul工作浓度为20pmol/L的引物，每反应1U的Taq酶和10ul血浆和血清游离核酸组成。
第二轮扩增Mg+的浓度应该下调至1.5mmol/L，DNA模板取5ul上轮的扩增产物，其余的同首轮扩增相同。
1.4循环参数
首轮扩增产物的循环温度为：45s的94oC，45s的58oC以及1min的72oC，循环的次数的共有35次。
第二轮扩增产物的循环首先有5min94oC的预变性，之后将温度降低到80oC，并加入每反应1U的Taq酶，循环温度为45s的94oC，1min的62oC，循环的次数共有30次，进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，给予EB染色之后观察扩增的结果并进行照相记录。
1.5扩增产物序列的分析
本次实验研究中扩增产物的序列分析均送往伤害基康生物制品有限公司进行，用检验得出的结果与原始的序列进行对比和分析，对扩增产物实验的准确性进行证实。
2结果
本次实验研究中共有孕妇45例，其中分娩男婴26例，经过三次重复实验最终得出结果为血浆检验呈阳性12例，血浆阳性检出率为46.2%；血清检验呈阳性9例，血清阳性检出率为34.6%；分娩女婴19例，其无论是血清检验还是血浆检验均呈现出阳性结果。
3 讨论
目前，已经有相关的研究报道可以从孕妇外周血有核细胞基因组中进行特异性胎儿遗传信息捕获的信息，而随着“无宿主游离核酸”这一概念的提出，临床医学工作人员已经想到可以将游离于孕妇血液中的胎儿遗传物质应用于产前基因诊断的过程中[3-4]。本实验以胎儿性别鉴定入手对孕妇血浆或血清游离核酸中胎儿的遗传信息进行检测和鉴定。
实验研究选择巢式扩增的方法，较常规单扩增增加了一定的灵敏度和特异性，同时这种扩增方式的运用还可以在一定的程度上增加特异性的模板背景，达到提高检验结果准确性的作用和目的[5]。但是临床工作者应该认识到聚合酶链反应虽然是一项较为灵敏的检测技术，但是由于孕妇外周血中胎儿遗传信息的含量相对较低，会对检验率造成较大的影响，同时孕妇自身凋亡和机械性的断裂均会给检验带来一定的可变因素，导致假阴性的出现，降低了实验研究的检出率[6]。本次实验研究的45例产妇中，分娩男婴26例，其血浆阳性检出率为46.2%；血清阳性检出率为34.6%；分娩女婴19例，其血清和血浆均为出现阳性结果。
综上所述，在对胎儿性别进行确定的过程中，可以直接利用孕妇的血浆或者血清来鉴别，这在临床上为无创产前基因诊断提供了一个新的想法和思路，值得给予临床推广和运用。
参考文献：
[1]邹昕.应用母血浆中胎儿游离DNA进行无创性产前诊断的研究[J].生殖工程学.2010，23（14）：1435-1436
[2]廖茜.母血浆中胎儿游离DNA无创产前诊断β-地中海贫血方法的研究[J].妇产科学（专业学位）.2014，32（10）：547-548
[3]严提珍.利用母体血浆游离的胎儿DNA通过缺失断裂点内父源SNP的检测进行纯合α~0-地中海贫血的无创伤性产前排除诊断[J].细胞生物学.2011，33（19）：435-436
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[5]张胜利，朱宝生.母血浆中胎儿游离DNA检测及非侵入性产前诊断的研究进展[J].中国产前诊断杂志（电子版）.2013，25（02）：114-116
[6]荣媛，高嘉嘉，姜新强，等.孕妇血浆中胎儿游离核酸Y染色体STR复合扩增的应用[J].武汉大学学报（医学版）.2012，15（02）：209-212
论文作者:马晓琦
论文发表刊物:《健康世界》2015年20期供稿
论文发表时间:2016/2/22
标签：血浆论文; 孕妇论文; 血清论文; 引物论文; 胎儿论文; 产前诊断论文; 阳性论文; 《健康世界》2015年20期供稿论文;