烟台毓璜顶医院 264000
【摘 要】目的 探讨滑膜间充质干细胞软骨分化能力。方法 无菌状态下获取兔颞下颌关节滑膜组织，酶消化法进行滑膜间充质干细胞原代培养，并进行传代扩增。第3代细胞消化后离心成为细胞团块，用软骨诱导液培养，并以鸡尾酒法添加生长因子人重组转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子，即前3天2种生长因子共同使用，之后只用rhTGF-β1继续培养18 d。细胞团块培养21 d后，免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原的表达。细胞团块培养在普通培养基中不添加rhTGF-β1和bFGF作为对照组。结果 滑膜间充质干细胞经过传代培养后，成为形态一致的梭形细胞；细胞团块经软骨诱导液、rhTGF-β1和bFGF培养后，免疫组织化学染色可见Ⅱ型胶原在细胞之间的细胞外基质中明显显色，并且细胞团块的周边要比中央浓染；原本二维培养状态下的梭形滑膜间充质干细胞变为球形的软骨样细胞形态。结论 滑膜间充质干细胞具有很强的成软骨能力，可以作为髁突软骨组织工程的种子细胞。
【关键词】滑膜细胞；软骨分化；
关节软骨损伤后的自我修复能力非常有限，随着软骨组织工程的出现，为软骨损伤提供了一种全新而有效的修复方式。作为组织工程的重要组成部分，种子细胞的选择对于构建组织工程软骨非常重要。间充质干细胞是治疗软骨缺损中重要的细胞来源。许多组织中都能都分离出间充质干细胞，例如骨髓、脂肪、骨膜、滑膜等。由于骨髓间充质干细胞取材方便，来源广泛，体外增殖能力较强，目前软骨组织工程构建软骨研究中的种子细胞大多数都选择骨髓间充质干细胞。然而，与骨髓组织、脂肪组织、肌肉组织和骨膜组织来源的间充质干细胞相比较，滑膜组织来源的间充质干细胞在增殖能力及软骨分化潜能等方面更具有优势。有研究称滑膜间充质干细胞与软骨细胞有着相似的基因表达谱，二者均来源于同一种前体细胞，因此，对于软骨组织工程来说，滑膜组织是一种细胞丰富、取材方便的组织来源。
1 材料与方法
1.1滑膜间充质干细胞的培养与扩增
采用消化法培养兔颞下颌关节滑膜间充质干细胞。健康雄性新西兰大耳白兔2只，2月龄，体重1.5 kg。全麻后，双侧颞下颌关节区备皮、消毒、铺巾，无菌状态下切取颞下颌关节滑膜组织。切取的滑膜组织用含100 u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无菌磷酸盐缓冲液反复冲洗3次，之后用含0.1%胰蛋白酶、100 u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的高糖DMEM溶液37℃孵育消化30min，然后再用含0.1%Ⅱ型胶原酶的高糖DMEM/10%胎牛血清37℃孵育消化2 h。消化后的悬液用70目的滤膜将细胞过滤，并离心（500 g/min）收集，用含100 u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的高糖DMEM/10%FBS细胞培养液重悬后移入细胞培养瓶，在含5%CO2的37℃湿化培养箱中进行原代培养。每2 d换液1次，未贴壁的悬浮细胞分别在第2天和第4天用PBS液洗去。待细胞80%汇合后进行传代，用0.25%胰蛋白酶液消化并调整细胞密度为1× 105/ml，分瓶接种，用高糖DMEM/10%FBS继续传代培养，传至第3～ 4代细胞应用于后续实验。
1.2滑膜间充质干细胞团块培养及软骨分化诱导
第3代滑膜细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，调整细胞密度为1.4× 106/ml，吸取1.2 ml细胞悬液在1.5 ml的EP管中以500 g/min离心5 min，使细胞成为团块，细胞团块用高糖DMEM/10%FBS培养24 h。然后将培养液更换成无血清软骨诱导液，即高糖DMEM液中含有40μg/ml脯胺酸、100 nM地塞米松、50μg/ml 2-磷酸抗坏血酸、1%ITS+ premix。鸡尾酒法添加人重组转化生长因子β1 10 ng/ml和碱性成纤维细胞生长因子50 ng/ml于软骨诱导液中，即在前3 d，2种因子共同使用，之后只用rhTGF-β1继续培养18 d，每2 d换液1次。对照组为培养于高糖DMEM/10%FBS培养液中，而不添加生长因子。
1.3免疫组织化学检测
细胞团块培养21 d后，用PBS液轻轻漂洗数次，用4%的中性多聚甲醛4℃固定24 h，然后用PBS液反复轻轻漂洗约30min，酒精梯度脱水（30%～ 100%），正丁醇透明过夜，之后浸蜡，石蜡包埋，切片5μm厚，脱蜡后进行免疫组织化学检测。石蜡切片脱蜡入水后，用PBS漂洗3次（5 min/次），3%过氧化氢液室温处理10min，PBS漂洗3次，山羊血清封闭15 min（于37℃水浴锅中）。之后将封闭血清弃去，滴加一抗多克隆抗体兔抗Ⅱ型胶原（1∶ 200，北京博奥森）4℃过夜，PBS漂洗3次，共15 min，之后滴加生物素化二抗山羊抗兔IgG抗体（北京中杉金桥）37℃孵育15min，PBS漂洗15 min后，用链霉素过氧化氢酶作用15 min，PBS漂洗15 min，用DAB（北京中杉金桥）显色，苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，树脂封片。显微镜下观察拍照（Leica，德国）。
2结果
2.1 滑膜间充质干细胞的培养
原代培养的滑膜细胞具有很强的增殖能力，最初细胞呈星形，随着细胞不断增殖，细胞密度变大，细胞形态逐渐变成梭形。经过传代培养后，细胞形态均匀一致。第3代滑膜细胞呈梭形（图1）。
2.2 滑膜间充质干细胞团块培养
第3代滑膜细胞经过离心后成为细胞团块，培养初期细胞团块表面略显不光滑，加入软骨诱导液以及应用生长因子rhTGF-β1和bFGF后，细胞团块表面逐渐光滑，并呈球形（图2）。
2.3 免疫组织化学检测
滑膜间充质干细胞离心后进行细胞团块培养，经含有rhTGF-β1和bFGF的软骨诱导液培养21 d，免疫组织化学检测软骨标志物Ⅱ型胶原的表达。Ⅱ型胶原在细胞团块中有明显显色，胞浆呈棕黄色，而且细胞团块的外围要比中央部分浓染。部分细胞外形呈软骨细胞样的圆形，细胞之间有丰富的细胞外基质成分形成。而在对照组即细胞团块培养于高糖DMEM/10% FBS培养基中，染色后无Ⅱ型胶原显色，细胞形态呈多边形，细胞团块较松散，细胞基质成分较少（图3、4）。
3 讨论
目前软骨再生和组织工程的途径包括：种子细胞、支架材料和生长因子。干细胞是一类未分化、具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，它是关节软骨再生的重要因素，也是关节软骨再生的细胞来源。干细胞主要分为两类：成体干细胞和多能干细胞。成体干细胞存在于不同的组织和器官。间充质干细胞被定义为贴壁细胞、成纤维纺锤样细胞、多能干细胞，可以分化为骨、软骨和脂肪、神经、肌肉等组织。间充质干细胞可以来源不同的组织，如骨髓、脂肪、滑膜、骨膜等。胚胎干细胞具有全能性，能够分化为体内特定的组织与器官，但是由于伦理学上的限制，促使越来越多的学者转向研究成体干细胞。
滑膜间充质干细胞与骨膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨骼肌间充质干细胞进行了比较，证实滑膜间充质干细胞的成软骨能力明显强于其他组织来源的间充质干细胞，并且有着较低的成骨的潜能。滑膜细胞和软骨细胞能产生软骨低聚物基质蛋白、接蛋白和萄糖氨基聚糖，因为这些特性，滑膜间充质干细胞是软骨组织工程中最有前景的种子细胞。间充质干细胞诱导软骨细胞分化的需要各种内在和外在因素，生长因子在这一过程中重要的角色。用于软骨组织工程的生长因子主要包括转化生长因子β家族、胰岛素样生长因子、骨形态发生蛋白、软骨形态发生蛋白等。
综上，对于软骨组织工程来说，滑膜组织是一种细胞丰富、取材方便的组织来源。滑膜间充质干细胞具有软骨分化潜能，细胞团块培养并以rhTGF-β1和bFGF诱导，滑膜间充质干细胞能够发生软骨细胞样表型改变，并能产生软骨细胞外基质Ⅱ型胶原。因此，我们认为滑膜间充质干细胞可以作为髁突软骨组织工程的种子细胞。
参考文献：
[1]Buckwalter JA，Mankin HA. Articular cartilage repair andtransplantation[J]. Arthritis Rheum，1998，41：1331-1342.
[2]Kayoto NI，Norio A，Nobuyuki I，et al. Synovial membranein the temporomandibular joint- its morphology function anddevelopment[J]. Arch Histol Cytol，2003，66：289-306.
[3]李 健，龙 星，朱 帆，等.颞下颌关节滑膜间充质干细胞成骨潜能的实验研究[J].华西口腔医学杂志，2005，23（2）：145-147.
论文作者:王光达,隋来健,盖鹏宙（通讯作者）,李桂石
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2017年8月第16期
论文发表时间:2018/2/28
标签：细胞论文; 软骨论文; 干细胞论文; 团块论文; 组织论文; 生长因子论文; 诱导论文; 《中国医学人文》(学术版)2017年8月第16期论文;