1江苏省中医院 江苏省南京市 210000；1南京中医药大学附属江苏省中医院消化内镜中心 210000
【摘 要】目的 检测炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者血清高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）的水平变化，探究HMGB1在疾病发生发展中的作用。方法 以54例炎症性肠病患者（28例溃疡性结肠炎、26例克罗恩病患者）及50例健康体检者为研究对象，收集血标本，采用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测血清HMGB1水平，用实时荧光定量PCR检测血淋巴细胞HMGB1mRNA的表达，分析其与病情轻重的关系以及HMGB1与其他生化指标的相关性。结果健康对照组、UC患者、CD患者血清HMGB1水平分别为（1.82±0.64）μg/L，（13.66±3.96）μg/L，（19.50±11.13）μg/L，UC组显著高于健康对照组，CD组高于UC组（P＜0.05）。炎症性肠病患者HMGB1mRNA表达明显增高，CD组高于UC组（P＜0.05）。血清HMGB1水平与IL-6、TNF-α呈正相关关系。结论 血清HMGB1水平在IBD时显著升高，与其他炎性指标IL-6、TNF-α变化趋势一致，并与病情的严重程度相关。HMGB1作为一种炎症介质，在IBD的发生发展中可能发挥重要作用。
【关键词】炎症性肠病；高迁移率族蛋白B1；炎症介质
炎症性肠病（inflammatory bowel disease IBD）是一种病因尚不明确的慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis UC）和克罗恩病（Crohn's disease CD）。对其病因和发病机制的研究，可以帮助我们控制病情及针对性治疗。HMGB1是生物长期进化过程中高度保守的核蛋白，1999年Wang等[1]首先发现HMGB1延迟释放至胞外后介导持续的炎症反应，HMGB1作为一种炎症介质，参与了多种疾病的致病过程。本研究旨在研究炎症性肠病患者血清HMGB1水平的变化，并探讨HMGB1与IBD发生、发展和其他炎症因子的关系。
1.对象和方法：
1.1.研究对象
收集2017年6月至2018年3月收治确诊的54例初发型活动期炎症性肠病患者，所有病例经临床、内镜及病理确诊，全部病例均符合2012年《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》中的诊断标准；溃疡性结肠炎患者28例（男20例，女8例，年龄27～61岁），其中腹痛20例（男17例，女3例），腹泻16例（男14例，女2例），便血12例（男10例，女2例），肠镜检查：全结肠6例，左半结肠6例，直肠乙状结肠12例，直肠4例；克罗恩病患者26例（男18例，女8例，年龄19～64岁），其中腹痛25例（男18例，女7例），腹泻11例（男9例，女2例），腹部包块4例（男3例，女1例），发热4例（男4例，女0例），3例出现贫血，内镜检查：空回肠13例，结肠5例，回结肠8例，12例出现肠腔狭窄。排除标准：感染性疾病患者、结缔组织疾病患者、肿瘤患者。以50例健康体检者作为对照组，在起病72h内采集血标本，分别检测血清HMGB1水平等炎症指标。
1.2.检测方法：
1）.血清IL-6浓度测定：采集静脉血后，保存于2-8℃，采用双抗体夹心ELISA法，在450nm处测定吸光度值计算IL-6浓度。
2）.血清TNF-α浓度测定：采集静脉血后，保存于2-8℃，采用双抗体夹心ELISA法，在450nm处测定吸光度值计算TNF-α浓度。
3）.血清HMGB1浓度测定：采用酶联免疫吸附方法（ELISA）。血液标本采集后3小时内分离血清并于-20℃冰箱保存。人HMGB1 ELISA试剂盒为日本SHINO-TEST公司产品，按产品使用说明书进行血清HMGB1浓度测定。
4）.血HMGB1mRNA测定：Total RNA提取试剂、PrimeScript RT Master Mix、PremixEx Taq购自TaKaRa；引物和探针合成由TaKaRa公司完成。总RNA提取与cDNA合成：总RNA提取按Total RNA提取试剂操作说明进行，紫外分光光度计测定其含量及纯度。采用逆转录试剂盒合成cDNA，采用荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术对转录产物进行扩增，以三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参对照。扩增产物经2% 琼脂糖凝胶电泳后照相验证。引物：（1）.HMGB1：上游 5’-ACAGCCATTGCAGTACATTGAG -3’，下游 5’-TTGCCCATGTTTAGTTGATTTTCC -3’，荧光探针 5’-（FAM）AGAGTCGCCCAGTGCCCGTCCG（Eclipse）-3’；扩增片段为113bp。（2）GAPDH：上游 5’-CCCATGTTCGTCATGGGTGT-3’，下游 5’-TGGTCATGGGTCCTTCCACGATA-3’，荧光探针 5’-CTGCACCACCAACTGCTTAGCACCC-3’。使用LightCycler荧光定量PCR仪，计算分析CT值。
1.3.统计学方法
数据以平均值±标准差（ ）表示，采用SPSS19.0统计软件进行t检验、方差分析、非参数分析及二维logistic分析。
2.结果
2.1炎症性肠病患者血清HMGB1水平
克罗恩组、溃疡性结肠炎组患者及健康体检者血清HMGB1浓度分别为（19.50±11.13）μg/L，（13.66±3.96）μg/L、（1.82±0.64）μg/L，按照最小显著差数法（LSD）和Dunnett检验法进行两两比较，发现三组间HMGB1值均有差异（P＜0.05，表1＝。
3.讨论
炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一组以胃肠道为主要表现的自身免疫性疾病，尤其是肠道的慢性炎症反应，主要包括克罗恩病（Crohn’s disease，CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC），其发病机制和病因目前尚未完全明确，目前黏膜免疫反应、肠道微生态的改变以及遗传易感性的相互作用被认为可能参与了炎症性肠病的发病发生过程。其中免疫异常在炎症性肠病的发病中的作用已得到相当程度的关注。目前比较工人的是黏膜通透性增加，肠道上皮屏障破坏，使得黏膜组织暴露于大量抗原之中，导致肠道免疫系统错误识别以及过度反应，激活免疫细胞，释放一系列炎症介质和细胞因子，炎症反应加剧，最终导致肠道组织破坏和功能影响，出现炎症性肠病的病理改变和临床症状[2，3]。
TNF-α是一种单核因子，主要来源于激活的单核细胞和T淋巴细胞，TNF-α具有广泛的生物学活性，主要有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节以及诱发炎症反应。当患者感染、创伤、烧伤、某些肿瘤及自身免疫性疾病时，TNF-α可有不同程度的增高。HMGB1可由活化的单核-巨噬细胞主动分泌，也可由坏死或损伤的细胞被动释放，血清HMGB1水平在正常人群中不易检测出，在调节感染、损伤和炎症反应中是一个重要的细胞因子[6]。
HMGB1是一种促炎细胞因子，激活多种靶细胞，产生瀑布式细胞因子连锁效应，推进免疫应答或炎症反应。Wang等研究发现IFN-γ与TNF-α或IL-1共同刺激则可使HMGB1的产生增加3～5倍，反过来HMGB1能刺激多种细胞合成、释放促炎细胞因子。HMGB1可以刺激单核巨噬细胞、嗜中性粒细胞分泌一些促炎因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8；并能引起NF-κB的核移位。HMGB1还能诱导树突细胞成熟并产生多种促炎细胞因子，因此HMGB1与这些促炎因子形成复杂的细胞因子网络，参与炎症反应[9]。本研究发现血清HMGB1与IBD患者病情的严重程度相关，血清HMGB1水平与血清IL-6、TNF-α水平呈正相关，三者共同参与了肠道的炎症反应。
当机体存在某些遗传性或后天因素造成的缺陷时，入侵的病原体或其他外源性因子破坏宿主肠黏膜免疫耐受性，导致黏膜层上皮细胞和固有层炎症细胞TLRs大量表达，并与PAMPs结合，激活下游细胞因子信号转导，损伤黏膜结构；与此同时，活化的炎症细胞和坏死细胞主动或被动释放内源性损伤分子HMGB1，进一步释放一系列细胞因子和炎症介质。且HMGB1可通过蛋白与蛋白间的直接相互作用，加重肠道上皮细胞损伤，放大炎症反应，使肠道炎症进入损伤-炎症-屏障破坏-加重炎症的恶性循环[10]。综上可见HMGB1作为重要的炎症因子之一，在炎症性肠病的发生发展中具有重要作用，但其具体机制还有待进一步研究。
参考文献：
[1]Wang H，Bloom O，Zhang M，et al.HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science，1999，285（5425）：248-251.
[2]Wendelsdorf K，Bassaganya-Riera J，Hlntecillas R，et al. Model of colonic inflammation：immune modulatory mechanisms in inflammatory bowel disease [J].J TheorBiol，2010，264（4）：1225-1229
[3]Dharmani P，Chadee K，Biologic. Biologic therapies against inflammatory bowel disease：a dysregulated immune system and the cross talk with gastrointestinal mucosa hold the key.[J]Curr Mol Pharmacol，2008，1（3）：195-199.
[4]Schinzari F，Armuzzi A，De Pascalis B，et al.Tumor necrosis factor-alpha antagonism improves endothelial dysfunction in patients with Crohn’s disease．Ciin Pharmacol Ther．2008，83（I）：70-76．
[5]Aleksandra Nielsen A，Nederby Nielsen J，Schmedes，et Al. Saliva Interleukin-6 in patients with inflammatory bowel disease．Scand J Gastroenterol，2005，40（12）：1444-1448．
作者简介：张婷，韩树堂，江苏省中医院。
第一作者：张婷南京中医药大学附属江苏省中医院消化内镜中心。
通讯作者：韩树堂，主任医师，教授。
论文作者:张婷1.2,夏敏2,韩树堂1（通讯作者）
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2018年3月第5期
论文发表时间:2018/8/2
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