2.海南医学院生物化学教研室 海南海口 571199；
3.海南医学院附属医院 海南海口 570102；
4.海南省中医院 海南海口 570000
【摘 要】目的：建立NPPB基因RS3753581突变位点的等位基因特异性PCR技术。方法：应用针对NPPB基因RS3753581突变位点设计的等位基因特异性PCR技术,对海南黎族人群中NPPB基因RS3753581突变位点类型进行了基因分型检测,同时对经上述等位基因特异性PCR检测分型的样本进行序列测定。结果：在海南黎族人群中,RS3753581突变位点可检测出NN、NM、MM3种基因型,用等位基因特异性PCR技术鉴定的NPPB基因RS3753581突变位点基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论：等位基因特异性PCR技术操作简便，重复性和稳定性好,可作为鉴定NPPB基因RS3753581突变位点的可行方法。
【关键词】NPPB基因；等位基因特异性PCR；基因分型
【中图分类号】R746.4 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）6-0151-02
笔者应用简便、快速的PCR技术检测NPPB基因RS3753581突变的等位基因特异性,讨论探索海南黎族人群中NPPB基因RS3753581位点的多态性,结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 DNA样品
从海南省陵水黎族自治县医院随机采集海南籍黎族正常人群且血缘上无关个体的血液样本219份，用EDTA抗凝、SDS方法提取DNA。
1.2 等位基因特异性PCR扩增NPPB基因
1.2.1 引物设计与合成 从NCBI中获得人类NPPB基因的两个突变位点上下游500bp的基因序列，用PRIMER5.0软件辅助设计引物，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Rs3753581位点引物设计（G→T），3581-1（上游通用引物）：5′-GGGTGGTCAGATGAAGGA-3′（Tm值：52.4℃），3581-N（下游正常引物）：5’-AGCCTGGTTGACAGACAGC-3’（ Tm值：57℃），3581-M（下游突变引物）：5’-AGCCTGGTTGACAGAGTGA-3’（ Tm值：58℃），引物片断长度均为165bp。测序产物扩增引物序列，Rs3753581位点引物，3581-1上游引物设计（G→T）：5′-gggTggTCAgATgAAggA-3′（Tm值：52.4℃），3581-2（下游引物），5′-ggTCCAgTgATgACgAAgT-3′（Tm值：51.9℃），片段长度为512bp。
1.2.2 PCR扩增 每个多态位点均设立2个PCR检测管,分别加入寡核苷酸正常和突变引物用于检测每个多态位点正常和突变的等位基因。反应体系如下：每管在1×PCR缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH8.3， 50 mmol/L KCl，1.5~2.0 mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2μg,引物各0.2~0.5μmol/L，, 4种dNTP各200μmol/L， Taq DNA聚合酶(北京天根公司产品)1 U。PCR循环参数为：首先在94℃进行5 min的热变性，随后进行38个循环反应(每个循环包括94℃50 s,60℃50 s,72℃10min)。扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色在UVI band凝胶成像系统(英国UVI tec公司产品)中观察结果并照相。
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1.3 NPPB基因PCR扩增结果的DNA序列测定
随机抽取经上述建立的等位基因特异性PCR技术检测后分型出的各种NPPB基因型的DNA样本，将3581-1和3581-2-2引物对的PCR扩增特异DNA片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定。
2 结果
2.1 NPPB基因Rs3753581突变位点的基因分型结果
每种NPPB基因突变位点都利用突变型引物和野生型引物同时进行两管PCR扩增，根据每个样品两种等位基因扩增产物结果，可准确判定样品的基因类型。应用建立的等位基因特异性PCR技术对219例海南黎族人样本DNA进行了NPPB基因的检测。在黎族人群中，RS3753581突变位点可检测出NN、MMM、MM 3种基因型。
2.2 NPPB基因PCR扩增结果的DNA测序验证测序结果表明等位基因特异性PCR技术对NPPB基因的分型结果与DNA测序结果相符,说明基因分型结果的特异性和准确率均较高。
3 讨论
NPPB基因存在于1号染色体短臂的末端[1]，包括3个外显子和2个内显子。NPPB 基因 转录、翻译表达生成 BNP 前体原，脱去信号肽后生成含 108 个氨基酸的BNP前体。BNP前体主要从心室分泌，在分泌过程中或进入血液后转变为具有生物活性的 BNP。BNP作用于心脏、肾脏、血管及交感神经（SNS）、肾素-血管紧张素-醛固酮（RAAS）系统，有排钠利尿、扩张血管、降低血压、防止血管平滑肌增生和心肌纤维化、降低心室的前负荷的重要作用[2]。等位基因特异性PCR技术称作（Allele-specific PCR，AS-PCR），又称作ARMS（Amplification refractory mutation sys-tem），是DNA点突变检测的主要技术。其基本原理是：根据基因单核苷酸序列多态性位点设计特异性引物，其中一条引物(特异性引物)的3′末端与基因多态性位点的碱基互补(或相同)，另一条引物（普通引物）按常规方法进行设计，因此，AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标记方法。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物，在其他基因型中没有扩增产物，能方便的利用凝胶电泳技术分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的SNP。我们可以人为的将错配碱基引入等位基因特异性PCR技术，改进后只需要2次PCR（正常引物和突变引物与模板各一次PCR反应）和一次凝胶电泳就可以确定基因型的多态性分型，方便、快捷、廉价且不需要昂贵的实验仪器设备。理论上，多数聚合酶(包括Taq)只有在引物的3′末端与模板完全互补时才能产生聚合反应，但某些特殊情况下，即使引物的3′末端碱基与模板不互补也可产生聚合反应，但延伸效率仅为前者的10-6.6~10-3倍。因此我们可以人为的改变紧靠引物3′末端的2个碱基，即人为地引入错配(Mismatch)碱基，该错配碱基与3′末端的突变引物的互补碱基可起到协同作用，使引物在与其3′末端不互补的模板中的扩增效率显著降低，而引物在与其3′末端互补的模板中正常扩增，因此,这种多碱基错配引物能显著增加引物的特异性。本实验应用改进后的等位基因特异性PCR方法，目前我国尚未有应用等位基因特异性PCR检测NPPB基因突变的文献报道。NPPB基因PCR扩增结果的DNA测序验证测序结果表明等位基因特异性PCR技术对NPPB基因的分型结果与DNA测序结果相符,说明基因分型结果的特异性和准确率均较高。为开展NPPB基因的研究提供简便，快速，准确的基因分型方法。
参考文献
[1] Tamura N , Ogawa Y, Yasoda A, et al . Two cardiac na-triuretic peptide genes(atrial natriuretic peptide and brain na-triuretic peptide) are organized in tandem in the mouse and human genomes J. J Mol Cell Cardiol, 1996,28(8):1811-1815.
[2] Tonolo G,Richards AM,Manunta P,et al.Low-dose infusion of atrial natriuretic factors in mild essential hypertension.Circulation,1989,80:893-902.
基金项目：
1.海南省海口市科技局重点科技项目（2013-53），2、海南省自然科学基金项目（80586）
论文作者:李 萌 云美玲 周代峰 王明军 刘正旺 范美竹
论文发表刊物:《中医学报》2015年6月第30卷供稿
论文发表时间:2015/10/12
标签：引物论文; 特异性论文; 基因论文; 突变论文; 黎族论文; 碱基论文; 位点论文; 《中医学报》2015年6月第30卷供稿论文;