（湖北省荆州市第一人民医院病理科 湖北 荆州 434000）
【摘 要】本文通过大量临床实践工作,对三种常用冷冻切片固定液进行对比分析，找出不同固定液的优缺点，从而指导技术人员运用合适的冷冻切片固定液,取得制片的满意效果。
【关键词】冷冻切片；冷丙酮；95%乙醇；AAF液；固定
【中图分类号】R361 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）5-0086-02
随着恒温冷冻切片机的普及，越来越多的基层医院将术中快速冷冻切片作为病理科必备检查项目进行开展。冷冻切片因其制片过程简单，快捷，在对于临床上需要进行术中快速病理诊断，以确定手术方式及范围的病例上，具有石蜡切片无法比拟的优点，但因组织在制片前未经固定，脱水等一系列处理，影响切片质量的因素多，导致术中快速病理诊断的误诊，漏诊率也明显高于常规石蜡切片病理诊断。如何在有限的时间里制作出一张优质切片，是值得技术人员不断实践与探究的问题。在仪器设备及人员素质相同的情况下，制片后的处理至关重要，而固定的过程则是重中之重。冷丙酮，95%乙醇，AAF液是临床上应用较广泛的三种冷冻切片固定液，固定效果各有优点。我们运用上述三种固定液，在各种组织的冷冻切片制备中进行了大量实验，对切片的固定效果以及最终质量进行了比较，以便选用合适的固定液来获得优质的冷冻切片。
1 材料与方法
1.1 材料 标本来源选用我院及外院术中切除新鲜组织，其中甲状腺，乳腺组织各40例，肝，肾组织及胃肠道肿瘤各20例，子宫及其附件组织60例。切片机为shandon cyto fsm恒温冷冻切片机，包埋剂为进口OCT包埋剂。
1.2 固定液 纯丙酮（4℃冰箱预冷），95%乙醇，AAF液（95%乙醇85ml，甲醛10ml，冰醋酸5ml）
1.3 方法 切片机开启速冻工作台，箱体温度设定为-20℃左右。标本切取大小为2cm×2cm×0.3cm的组织块，平放于冷冻组织托盘上，滴加OCT包埋剂，待组织急速冷冻至硬度适中，放置于冷冻夹头上，调整切片刀角度以4?m厚度切片。连续切片3张，立即分别放入冷丙酮，95%乙醇，AAF液中固定1min。流水冲洗后行常规HE染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
2 结果
显微镜下从细胞核形态，细胞核染色，细胞浆染色，核浆对比度，组织结构完整度五个方面进行比较，并按5分制评分，总分25分。（表1）
从观察结果可以看出丙酮对细胞核的固定效果优于另两种固定液，但丙酮固定的切片色彩暗淡，胞浆着色不均匀，核浆对比度差，且切片的完整性较差。95%乙醇固定效果介于另两种固定液之间，切片色彩尚可，但胞核形态及切片完整性略差。AAF液在三种固定液中效果最好，除胞核稍肿胀外，切片色彩鲜艳，胞浆染色好，核浆对比度好，组织结构完整。
3 讨论
冷冻切片的固定属于切片后固定，近似于细胞涂片的固定，为节省时间，切片需要由渗透力强，固定效果好的固定液进行快速固定。冷丙酮，95%乙醇，AAF液用于冷冻切片的固定均可见于许多文献的报导，固定效果各有优缺点。下面进行逐一的探讨与分析。
①丙酮可沉淀蛋白质，渗透力强，主要用于各种酶的固定，也有使组织细胞严重收缩的缺点，我们认为，冷冻切片因其自身的特点，在组织速冻过程中，细胞有不同程度的肿胀变形，丙酮使细胞强烈收缩，从而使胞核的形态趋于正常，因此胞核固定较好，轮廓较清晰，着色较好，这一观察结果与一些文献报导相一致[1]。但也正因为细胞收缩剧烈，导致皱缩变形，组织间距变大，部分组织成分脱落，切片完整性被破坏。
②95%乙醇是最常用的细胞涂片固定液，它可沉淀蛋白质，也可固定糖原，渗透力较弱，对核的固定效果较差，高浓度乙醇用作固定剂可溶解脂质兼有脱水的作用[2]。但其使组织收缩的作用不如丙酮剧烈，用95%乙醇固定的切片，胞浆染色鲜艳，核浆对比度较好，但核的轮廓不清，且某些组织成分亦有脱落现象。
③AAF液为混合固定液，其中甲醛为常规切片常用的固定剂，它渗透力强，使蛋白质分子交联发挥固定作用，固定均匀，对组织收缩小。冰醋酸穿透力强，可沉淀核蛋白，是细胞核的良好固定剂，亦可使细胞膨胀变形，与95%乙醇合用可部分抵消此作用。AAF固定液固定的切片，胞核着色良好，切片完整，核浆对比度好，色彩鲜艳。但我们也发现，AAF液必须新鲜配制，否则因甲醛久置后产生甲酸，使此液偏酸性，影响细胞核的染色[2]，导致胞核轮廓不清，色彩暗淡，影响诊断。
从以上分析可以看出，丙酮，95%乙醇为单一固定剂，对细胞内某些成分可起到较好的固定效果，因此常应用于一些有特殊染色要求的冷冻切片制备中，如有报导丙酮作为胰腺冷冻切片免疫组织化学染色的组织固定剂可取得满意的效果[3]。而应用于常规术中快速病理检查的冷冻切片固定则有某些不足之处，不能达到预期的目的与效果。AAF液是混合固定液，其中的三种成分均有固定作用，三者合用能发挥优势，弥补缺点，新鲜配制的AAF液不但能做到固定，脱水兼顾，并可对细胞内各种成分都能起到较好的固定作用，完全可以满足常规术中快速冷冻切片的制作需要。
（缺图）
图片说明：图1，2 冷丙酮固定甲状腺组织，可见胞核着色较好，切片色彩较暗淡，胞质染色不均匀，部分组织成分脱落。图3，4 95%乙醇固定甲状腺组织，可见胞核着色稍差，切片色彩较好，胞质染色尚可，部分组织成分亦有脱落。图5,6 AAF液固定的甲状腺组织，可见切片色彩鲜艳，核浆染色对比度好，切片完整无脱落。
参考文献：
[1]马恒辉,周晓军, 如何提高冷冻切片的技术水平[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(1)：90-2.
[2]王伯沄，李玉松，黄高昇等， 病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:67-70.
[3]蔡翠珠，张红，贾晓云， 胰腺冰冻切片免疫组化中组织的固定方法比较[J].中国现代医药杂志,2008,10(7)：78-9
论文作者:余,强,赵会传（通讯作者）
论文发表刊物:《河南中医》2015年5月供稿
论文发表时间:2015/10/12
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