环介导等温扩增技术检测肿瘤患者B7-H3基因的应用研究论文_李典芬 王海英 周太梅 阳大庆

湖南医药学院第一附属医院检验科 湖南怀化418000)

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湖南医药学院检验医学院;湖南医药学院第一附属医院检验科 湖南怀化418000)

摘要:目的 建立环介导等温扩增技术(LAMP)用于检测B7-H3基因,以评价肿瘤患者的预后转归。方法 收集临床病理阳性样本并用荧光定量PCR检测,然后根据B7-H3基因序列设计LAMP引物并优化反应条件。用LAMP方法检测收集的临床样本,计算阳性率,并比较LAMP和荧光定量PCR的统计学差异。结果 建立的LAMP体系特异性和灵敏性良好。通过对临床样本的检测,B7-H3阳性样本的LAMP检测结果和荧光定量PCR差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LAMP对B7-H3 基因的检测具有较好的特异性,操作简便,适合在基层医院应用。

关键词:环介导等温扩增技术;B7-H3;肿瘤

B7-H3分子是由Chapoval等人从DC的cDNA库中克隆出 的B7家族新成员,是一种新型的共刺激分子。现有研究表明,B7-H3在多种肿瘤组织中高表达,其与多种肿瘤的恶性程度、迁移以及患者的预后转归有着密切的关系。因此检测B7-H3的表达对于判断肿瘤患者的预后有着重要的意义。传统的检测方法如western blotting和ELISA,操作繁琐,耗时较长且需用到特异性单克隆抗体,因而其应用受到一定的限制。此外,sB7-H3在血清中出现仅见于少数几种恶性肿瘤患者且含量不高。以上原因使得检测可溶性B7-H3分子在肿瘤患者预后判断中

的应用存在着一定的局限性。因此,开发一种应用范围更广、特异性更高、操作更简单、价格低廉的检测B7-H3分子表达的试剂盒有着重要的临床意义和良好的市场前景。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术在保持PCR技术优点的基础上,进一步增强了反应的特异性,缩短了检测时间。目前,该技术已成功应用于微生物检测领域,但在肿瘤相关基因表达的检测中尚无应用。我们将LAMP技术的上述优点应用于B7-H3分子表达的检测,以期开发出应用范围广、检测速度快、结果特异性高和低成本的试剂盒,为肿瘤的预后评估提供新的评价方法和途径。

1.材料与方法

1.1 主要试剂 样品DNA抽提试剂盒、DNA聚合酶、1Kb和100bp DNA ladder和均购自天根生物;Betaine(甜菜碱),Calcein(钙黄绿素)购自Sigma公司;

1.2 标本来源收集湖南医药学院第一附属医院病理科2015年1月到2015年10月肿瘤患者组织标本35例,健康对照标本11例,按照DNA抽提试剂盒的操作说明提取DNA,提取好的DNA进行分装,一部分冻于-80℃冰箱备用,一部分用荧光定量PCR进行检测。所有患者均签署知情同意书。

1.3 引物设计 获取B7-H3基因序列,使用ClusawX软件进行多重序列对比,确定引物设计区段。通过引物软件Primer 5设计4条通用引物,序列见表1,其中F3和B3为外引物,FIP和BIP为内引物, 所有引物均有上海生工公司合成。

1.4 LAMP体系的构建 25μl体系包括:1.5μl内引物(FIP和BIP),0.3μl外引物 (F3和B3),0.6μl甜菜碱,10mmol/L MgSO4,1.5mmol/L dNTPs,6U DNA聚合酶 ,2.5μl10×PCR反应缓冲液,1μl模板,1μl钙黄绿素和MnCl2,用超纯水补足至25μl,同时用加入模板的体系作为阴性对照。将反应管置于65℃恒温水浴箱内反应60min后冷却,灭活反应酶,用来终止反应。

1.5 产物检测 扩增完毕后,取5μl扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶中电泳,观察条带。在反应体系中加入钙黄绿素和MnCl2混合染液,阳性可以观察到反应体系由橙色变为绿色,此现象即用可视化方法进行结果判定:绿色改变为阳性结果,保持橙色为阴性。

1.6 统计学处理 实验数据用SPSS18.0 软件分析结果, 应用配对卡方检验比较LAMP和荧光定量 PCR的统计学差异,P<0.05 表示差异具有显著性。

2.结果

2.1 LAMP检测B7-H3基因的特异性,肿瘤患者阳性标本LAMP扩增后具有梯状条带,健康对照无条带;在反应体系中加入钙黄绿素和MnCl2混合染液,肿瘤患者阳性标本LAMP扩增后管中的颜色由淡橙色变为绿色,而健康对照样本管颜色未发生改变。这种染色方法快速简便,直接观察反应试管颜色即能对结果进行定性判定。

2.2 临床标本的检测 LAMP分别扩增经荧光定量PCR检测的35例阳性标本、11例阴性对照,结果如表2所示,LAMP法和荧光定量PCR的结果比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3. 讨论

研究表明,B7-H3分子与多种肿瘤的恶性程度、迁移以及患者的预后转归有着密切的关系[1-3]。检测B7-H3的表达对于判断肿瘤患者的预后有着重要的意义,但以往的检测方法如western blotting和ELISA操作繁琐,耗时较长且需用到特异性单克隆抗体,因此B7-H3分子在肿瘤患者预后判断中的应用受到了一定程度的制约。我们的研究则基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,形成了一个反应体系,经过对体系的特异性、敏感度以及临床标本的评价,该方法可以满足基层医院对于B7-H3基因的检测要求,反应迅速,不需要特殊的仪器设备,适宜在基层医院推广。

LAMP技术,作为一种特异性和灵敏性均好、成本低廉、易于操作、较有前途的分析诊断技术,已经被多方面认可[4-6]。通过本研究对该技术的应用,我们发现LAMP技术在检测B7-H3基因时,其扩增条件在恒温(60℃~65℃)下进行,无需特殊设备,操作方法简单易学。同时,其扩增效率高,LAMP技术在60min后就可见明显的显色反应,加入群引物后,反应时间更短。因此,我们将LAMP技术的上述优点应用于B7-H3分子表达的检测,检测速度快、结果特异性高、成本低廉,可以为基层医院的肿瘤预后评估提供新的评价方法和途径。

本文受湖南省怀化市科技局科研项目基金(项目编号:2014-15)资助。

通讯作者:阳大庆,博士,副教授,副主任技师,主要从事抗感染免疫研究。

参考文献:

1. 王茗典,张大昕. B7-H3在恶性肿瘤中的研究进展. 现代肿瘤医学,2018, 26(14):2305-2308.

2. 卢旭东邓志勇陆益民赵年B7-H3在肺癌恶性胸腔积液中的表达及临床意义. 临床肺科杂志, 2019, 24(3):481-486.

3. 关爱华. 过表达B7-H3对乳腺癌细胞增殖的影响及其初步机制研究. 中国妇幼保健,2018, 33(23):5594-5597.

4. 杨德全,鞠厚斌,葛菲菲等.环介导等温扩增技术及其在动物疫病诊断中的应用.中国动物传染病学报,2011(2):75-78.

5. 袁向芬,吕继渊,吴绍强等. 环介导等温扩增技术作为基因快速诊断方法的研究与展望. 生物技术通报,2018,34(10):64-70.

论文作者:李典芬 王海英 周太梅 阳大庆

论文发表刊物:《中国结合医学》2019年第08期

论文发表时间:2019/9/24

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环介导等温扩增技术检测肿瘤患者B7-H3基因的应用研究论文_李典芬 王海英 周太梅 阳大庆
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