董高翔[1]1999年在《丁基苯酞对脑缺血神经细胞凋亡的抑制作用及其机理研究》文中进行了进一步梳理缺血性脑卒中是临床上继心脏病和肿瘤后的第三大死亡原因，严重威胁人类健康，影响病人生活质量，给家庭和社会带来沉重的经济负担。对其发病机理的研究和寻找有效的治疗药物已成为当务之急。近年研究表明脑卒中后迟发性神经元死亡的主要形式是细胞凋亡，且凋亡的细胞主要集中在缺血阴影区(penumbra)。保护这部分神经元的完整性和功能是目前治疗脑卒中的目标。丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)是我所近年来开发的一个新型抗脑缺血药物，具有良好的抗脑缺血作用，目前正在进行Ⅱ期临床试验。以往实验研究表明：NBP能缩小大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)后脑梗塞面积和改善神经功能缺失。为进一步研究NBP这一作用的机理，我们提出如下假说：NBP缩小大鼠MCAO后脑梗塞面积与其抑制脑缺血后神经细胞凋亡有关。因此，本论文的研究目的是：(1)NBP对脑缺血神经细胞凋亡是否具有抑制作用；(2)如果有作用，其可能的机理有哪些。本学位论文的主要研究内容如下： 第一部分 丁基苯酞对脑缺血神经细胞凋亡的抑制作用 第一节 NBP对低氧低糖诱导的皮质神经细胞凋亡的作用 本节首先从离体水平以原代培养的大鼠胎鼠皮质神经细胞低氧低糖再复氧为模型，研究NBP对神经细胞凋亡的作用。用流式细胞术检测DNA含量及凋亡细胞百分率，透射电镜观察细胞形态学变化，DNA琼脂糖凝胶电泳和原位末段标记(TUNEL)检测DNA断裂。结果表明：低氧低糖处理的细胞随着时间的延长凋亡峰增高(6h：10％；9h：13.5％；12h：25.1％)，但
吴丽蓉[2]2007年在《丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧炎性损伤及机制》文中进行了进一步梳理背景:缺血性脑血管病是严重威胁人们生命健康的常见病、多发病。虽然,国内外对该病所作的大量实验和临床研究,使人们对脑缺血损害及药物干预等的认识不断深化,针对该病的不同病理环节进行有目的、分阶段、联合治疗使其预后也有了较大改观,但该病的治疗仍未取得理想效果。因此,寻找新的、针对性的治疗靶点和策略很有必要。目前,对缺血性/再灌注损伤机制的研究主要集中在氧自由基、线粒体损伤、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸、炎症反应和细胞凋亡等方面。其中,缺血/再灌注后的炎症反应是研究的热点。神经元是神经系统的形态和功能单位,具有感受体内、外刺激传导冲动和整合信息的能力。神经元数量庞大,约有1011个,它们通过突触彼此连接,形成复杂的神经网络和通路。脑的不同部位和不同的细胞对缺氧的敏感性不尽相同。各类细胞对缺氧敏感性由高到低依次为:神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞。脑缺血、脑损伤等多种神经疾病均涉及到神经元的损伤,尤其在脑缺血时,在缺血中心区和半影区存在大量的神经元变性、死亡。神经元作为神经功能的主要承载者和体现者,保护其结构和功能是十分重要的。众多试验表明,脑缺血后ICAM-1、iNOS的表达增强。同时发现,在脑血管疾病尤脑缺血时可引起NF-κB的活化,活化的NF-κB可上调细胞因子、粘附分子、炎性蛋白酶等的表达,造成缺血脑组织的炎性反应加剧,细胞的通透性增高,细胞基质破坏,血脑屏障破坏等最终导致神经元坏死。多数学者认为NF-κB是炎症反应的中心环节。靶向NF-κB的抗炎治疗成为国内外学者的研究热点。恩必普(通用名丁基苯酞软胶囊,NBP)是我国研发的治疗脑血管疾病的一类新药。恩必普的主要成分丁基苯酞是从我国南方的一种水芹籽中提取出来的有效成分,可分为左旋丁基苯酞(l-NBP)、右旋丁基苯酞(d-NBP)及消旋丁基苯酞(dl-NBP),有全新的作用机理,可以增加缺血区的脑血流,重建缺血区微循环,缩小脑梗塞面积,保护线粒体,改善脑缺血后能量代谢,减轻局部脑缺血所致的脑水肿等。有研究提示丁基苯酞可以明显降低缺血再灌时脑损伤区的中性粒细胞数目,并可以抑制缺血区的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的升高,d-NBP还可以降低低氧/复氧、IL-1所致的中性粒细胞-内皮细胞粘附,l-NBP能够明显抑制iNOS表达和NO的合成。丁基苯酞(NBP)是否可以通过抑制NF-κB的活化,进而影响其靶基因的转录抑制ICAM-1和iNOS蛋白的表达发挥抗炎作用而保护神经元,是我们研究的重点。目的:(1)探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法并对之进行形态学观察;(2)建立一种方便、稳定、可靠的体外细胞氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)/复氧(reoxygenation)模型(3)通过该模型,研究神经元在氧糖剥夺/复氧后NF-κB p65的表达、活化的动态规律;(4)研究NBP对神经元在该模型条件下细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达的影响。方法:取Wistar大鼠乳鼠脑组织,采用筛网过滤、胰酶酶消化、离心等技术获取大脑皮质神经元并进行培养,通过倒置显微镜、免疫细胞化学进一步鉴定,采用细胞培养、MTT法、酶学检查、光学显微镜等研究和评价氧糖剥夺模型;采用MTT法、酶学检查观察丁基苯酞的保护作用;采用免疫细胞化学和RT-PCR方法研究NF-κB的动态变化及丁基苯酞对其靶基因蛋白ICAM-1、iNOS表达的影响。结果:(1)经形态学、免疫细胞化学(NSE)鉴定所培养的细胞为神经元;(2)OGD前后细胞形态结构变化显著,MTT法及乳酸脱氢酶的释放量测定均提示神经元损伤随氧糖剥夺时间呈时间依赖关系,与正常对照组有显著差异(P<0.05);(3)免疫细胞化学显示神经元的NF-κB p65蛋白表达在OGD4h时开始明显增加(P<0.05);R4h、R8h逐渐增加,R8h时达到高峰(P<0.05);R12h时有所下降,但仍高于正常组(P<0.05);R24h时进一步下降,稍高于正常组,与正常组无显著性差异(P>0.05)。NF-κB核转位细胞R8h达到高峰,与正常对照组有显著差异(P<0.05),且各组间(R4h、R8h、R12h、R24h)差异显著(P<0.05)。OGD/R前NF-κB p65大多数集中于胞浆,细胞呈“空泡”现象,OGD/R后NF-κBp65大多数集中于胞核,细胞呈“实心”现象;(4)MTT法和LDH释放测定发现在OGD4h/R8h时丁基苯酞各浓度组可增加神经元的细胞活力和减少神经元LDH的释放(P<0.05);(5)免疫细胞化学及RT-PCR检测到在OGD4h/R8h时丁基苯酞各浓度组可显著降低神经元表达ICAM-1、iNOS(P<0.05);(6)不同剂量丁基苯酞(100μmol/l、10μmol/l、1μmol/l、0.1μmol/l)在增加细胞活力、减少LDH的释放及降低神经元表达ICAM-1、iNOS等方面,高浓度组与低浓度组有统计学差异(P<0.05),且丁基苯酞100μmol/l组与PDTC 100μmol/l组有统计学差异(P<0.05)。结论:(1)成功培养出数量多、纯度高的神经元;(2)建立了一种简便、稳定和可靠的体外大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧模型;(3)氧糖剥夺导致神经元NF-κB的快速活化,NF-κB p65蛋白表达在氧糖剥夺4h到复氧24h逐渐升高,复氧8h核转位率最大(P<0.05);(4)MTT法和LDH释放测定发现在OGD4h/R8h时丁基苯酞对神经元有保护作用。(5)丁基苯酞各浓度组均可抑制NF-κB的活化,可能通过影响其靶基因的转录而抑制ICAM-1和iNOS蛋白的表达,从而有效保护氧糖剥夺/复氧中损伤的大脑皮质神经元。(6)丁基苯酞各浓度组间在增加细胞活力、减少LDH的释放及降低神经元表达ICAM-1、iNOS等方面,高浓度组与低浓度组有统计学差异(P<0.05),说明高浓度组比低浓度组更能发挥保护作用,且丁基苯酞100μmol/l组与PDTC 100μmol/l组有统计学差异,说明丁基苯酞100μmol/l组比PDTC 100μmol/l组在抑制NF-κB的活化上作用更强。(7)通过MTT法和LDH释放测定,证实丁基苯酞对大鼠大脑皮质神经元没有毒副作用。
董高翔, 冯亦璞[3]1999年在《丁基苯酞抑制低氧低糖诱导的大鼠皮质神经细胞凋亡》文中认为目的：以原代培养的大鼠胎鼠皮质神经元低氧低糖再复氧为模型，研究丁基苯酞对神经细胞凋亡的抑制作用。方法：用流式细胞术检测ＤＮＡ含量及凋亡细胞百分率，透射电镜观察细胞形态学变化，ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳和原位末段标记（ＴＵＮＥＬ）检测ＤＮＡ断裂。结果：丁基苯酞能减轻细胞核形态的改变，减少ＤＮＡ断裂和阳性细胞数，使低氧低糖诱导的神经细胞凋亡百分率明显下降，凋亡峰显著降低。结论：丁基苯酞对低氧低糖诱导的大鼠皮质神经细胞凋亡有抑制作用。
蔡耘[4]2010年在《丁基苯酞对血管性痴呆小鼠海马神经元NF-κB、ICAM-1表达的影响》文中认为目的:血管性痴呆(vascular dementia, VD)是由一系列脑血管疾病,如缺血或出血及急慢性缺氧性脑血管病,导致脑组织损害产生的一种慢性、进行性、持续性智能障碍综合征,其临床表现除神经系统定位损害的症状和体征外,尚有系列异常的神经心理症状和精神行为,已成为继阿尔茨海默病(AD)后的第二大痴呆疾病。随着人口老龄化, VD发病率逐年上升。VD是迄今为止唯一可防治的痴呆,如早期治疗会具有可逆性。因此探索VD发病的相关因素及发病机制,寻求有效治疗措施,具有重要的社会和医学意义。目前认为,慢性脑灌注不足是VD发病的主要病因,其发病机制涉及神经生化、分子免疫、遗传基因等多个方面。随着炎性机制在缺血性脑血管病中的地位日益受到重视,越来越多资料表明,炎症反应在脑缺血后继发性神经损伤中起主要作用,参与了VD的发生与发展。炎症反应始于炎症细胞黏附、迁移、浸润、活化以及炎症因子释放,各类参与炎症反应的因子既有各自的作用,又相互促进和调节,形成一个复杂的炎症反应网络系统。核因子-КB (NF-КB)是脑缺血后反应最早的炎症因子,编码和调控多种炎症因子,被认为是血管内皮细胞受损的始动机制之一。而炎症细胞黏附于血管内皮则依赖于细胞间粘附因子-1(ICAM-1)等粘附分子,从而进入脑组织并进一步释放各种炎症因子,形成血管源性和细胞源性脑水肿,加重脑血管病后继发性脑组织损伤,导致海马等脑组织神经元损伤、凋亡,最终影响整体认知功能。做为一种可作用于脑缺血多个病理环节的多靶点治疗药物,丁基苯酞已广泛应用于脑缺血及VD的临床治疗,但其治疗VD的药理机制却尚在探讨中。本实验通过建立VD模型,观察小鼠海马NF-КB及ICAM-1的变化,探讨丁基苯酞改善智能的抗炎药理机制。方法:本研究分为三部分。第一部分以昆明小鼠为研究对象,采用双侧颈总动脉丝线结扎方法,经连续三次反复缺血-再灌注,制备VD模型,并设立假手术组、治疗组(丁基苯酞);造模术后第29 d、30 d,利用跳台试验和水迷宫试验对各组小鼠分别进行学习和记忆成绩测试,并观察各组小鼠行为学差异。第二部分以迅速取材,4%多聚甲醛溶液固定的小鼠脑组织为研究对象,经HE染色后观察各组小鼠海马组织的病理改变。第三部分采用免疫组织化学染色技术,在光镜下观察各组小鼠海马组织NF-КB、ICAM-1的表达变化,并计算其海马CA1区NF-КB及ICAM-1阳性细胞的平均光密度值,比较各组海马的表达是否存在差异。结果:(1)跳台试验:模型组小鼠学习、记忆成绩均显著下降,表现为学习阶段的反应时间延长(P<0.05)、错误次数增加(P<0.05),记忆阶段的潜伏时间缩短(P<0.05)、错误次数增加(P<0.05);治疗组较模型组学习、记忆成绩明显改善(P<0.05),并且与假手术组比较无明显差别(P>0.05)。(2)水迷宫试验:模型组小鼠学习、记忆成绩显著下降,表现为学习阶段的游全程时间延长和错误次数增加(P<0.05),记忆阶段的游全程时间延长和错误次数增加(P<0.05);治疗组较模型组明显改善(P<0.05),并且与假手术组之间无明显差别(P>0.05)。(3)海马HE染色:假手术组海马HE染色显示海马轮廓清楚,锥体细胞数量丰富,排列规则致密,细胞核圆而大,核仁清晰,神经纤维密集;模型组海马CA1区锥体细胞数目减少,排列松散,细胞核体积变小,深染,结构不清,呈核固缩表现,神经纤维排列紊乱;而治疗组病理改变明显减轻。假手术组、模型组及治疗组各组单位面积正常神经元计数分别为(102.46±13.16)、(61.04±18.17)和(89.09±19.94)。(4)海马NF-КB表达变化:在光镜下,假手术组海马CA1区层次清楚,NF-КB存在于胞浆中,偶见胞核内微弱的阳性表达。而模型组阳性神经元数目明显增加,胞核呈现为棕黄色或黄褐色,排列松散,染色变深。治疗组可见阳性神经元数目较模型组减少,排列较致密,染色变浅。假手术组、模型组及治疗组各组阳性细胞平均光密度值分别为(0.0660±0.00436)、(0.1533±0.01137)、(0.0927±0.00379),与假手术组比较,模型组小鼠海马NF-КB阳性神经元平均光密度值明显增加(P<0.01),而治疗组NF-КB阳性神经元平均光密度值下降,与模型组比较有显著差异(P<0.01)。(5)海马ICAM-1表达变化:在光镜下,假手术组海马CA1区偶尔可见ICAM-1阳性细胞。而模型组阳性神经元数目明显增加,主要为胞浆棕黄染色的细胞。治疗组可见阳性神经元数目较模型组减少,排列较紧密,染色变浅。假手术组、模型组及治疗组各组阳性细胞平均光密度值分别为(0.0307±0.00416)、(0.139±0.00917)、(0.0833±0.0109),与假手术组比较,模型组小鼠海马ICAM-1阳性神经元平均光密度值明显增加(P<0.01),而治疗组ICAM-1阳性神经元平均光密度值下降,与模型组比较有显著差异(P<0.01)。结论:(1)本实验成功地建立了小鼠VD模型,通过跳台试验、水迷宫试验证实了VD小鼠存在学习和记忆能力障碍,能够基本模拟临床上VD的智能障碍。(2)海马HE染色显示海马锥体细胞受损,是比较理想的VD动物模型;同时,丁基苯酞也取得了治疗效果。(3)采用免疫组化技术,证实了海马组织NF-КB、ICAM-1的表达增加与VD的认知功能损害有关;丁基苯酞可以通过抑制NF-КB、ICAM-1的表达,抑制VD的炎症反应,进而改善VD的临床症状。
李雁[5]2010年在《丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠脑组织NCX3和AIF表达的影响》文中研究说明背景和目的慢性脑缺血是一个常见的慢性病理生理过程,是多种原因引起的脑血管狭窄或者低灌注,导致脑血流低于生理需要,引起全脑或者区域性的脑功能障碍(例如不同程度的记忆力减退、智力下降、头晕、头痛、失眠等),并且常常与血管性痴呆(vascular dementia,VD)、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)等多种疾病伴随发生。目前,大多数国家已经进入老龄化社会,世界人口正在加速老化,慢性脑缺血相关性疾病随之增多,因此,揭示慢性脑缺血损伤的具体机制,提出有效治疗措施愈发重要。近年研究发现钠钙交换体3(sodium-calcium exchanger3, NCX3)在神经系统疾病中发挥重要作用。凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)能够诱导细胞凋亡,其凋亡方式不依赖caspases。丁基苯酞(dl-butylphthalide, NBP)对缺血性脑血管病有较好的治疗作用。丁基苯酞能否通过影响NCX3和AIF蛋白对慢性脑缺血组织发挥神经保护作用目前尚未见报道。本文旨在观察丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠脑组织中NCN3和AIF蛋白表达的影响,探讨丁基苯酞对慢性脑缺血组织的神经保护机制,为慢性脑缺血的临床治疗提供理论依据。材料和方法清洁级雄性Wistar大鼠80只,12-14月龄,体质量350-450g,随机分为4组,适应性饲养7天经Morris水迷宫测试合格后用于实验。A组：对照组(假手术+溶剂)；B组：模型组(手术+溶剂)；C组：小剂量NBP治疗组(手术+小剂量NBP+溶剂)；D组：大剂量NBP治疗组(手术+大剂量NBP+溶剂)。永久性结扎大鼠双侧颈总动脉(BCAL),制备慢性脑缺血动物模型,对照组只分离双侧颈总动脉,不结扎,余同模型组；操作时保持动物体温在(37.5±0.5)℃。模型制备后2个月,Morris水迷宫测试学习和记忆功能。A、B组给予溶剂灌胃,C、D组分别按60mg/kg/d、120mg/kg/d NBP灌胃。各组连续灌胃1月后,再次经Morris水迷宫检测学习和记忆功能,之后麻醉大鼠,夹闭腹主动脉,经心脏快速灌注生理盐水和多聚甲醛,断头取脑,固定、脱水、透明、包埋。冠状位切片,片厚5μm。HE染色、免疫组化染色,光镜下阅片,彩色病理图像分析仪采集图像,图像分析系统分析图像,记录大鼠海马与皮层组织形态学改变,以及NCX3与AIF平均积分光密度值,数据以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS统计软件包进行分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD-t检验,检验水准α=0.05。结果1一般行为学：术后大鼠精神差,纳差,行动迟缓。随后A、D、C、B组大鼠精神渐渐好转,饮食恢复正常。2学习和记忆功能观察：术前各组大鼠逃避潜伏期和跨越平台次数比较,差异没有统计学意义(P>0.05)；各组模型制作(BCAL)后2个月,B组较A组逃避潜伏期明显延长,跨越平台次数明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)；BCAL后3个月,C组和D组较B组逃避潜伏期明显减少,跨越平台次数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),D组较C组逃避潜伏期减小,跨越平台次数有所增加,差异有统计学意义(P<0.05)。3 HE染色：各组均没有明显缺血梗死灶,A组大鼠海马及颞叶皮层神经元大部分形态正常,偶尔发现变性和死亡细胞；B组神经元出现缺血性改变,大部分神经元消失,胞核不规则、固缩、碎裂,有的溶解,胞浆内可见空穴,胶质细胞增多；C组大鼠海马及颞叶皮层神经元消失减少,可见部分变性和死亡神经元,胶质细胞较B组减少；D组虽然在大鼠海马和颞叶皮层可以发现小部分变性和死亡神经元,但是其组织形态较B组有明显的好转,较C组也有部分改善。4 NCX3免疫组化染色：各组大鼠脑组织切片显示NCX3蛋白的免疫反应产物呈棕黄色或棕褐色着色,主要分布在神经元胞膜和胞浆。慢性脑缺血后,大鼠海马和颞叶皮层中NCX3蛋白水平下降,经NBP治疗后,NCX3水平有所上升,但在大剂量NBP治疗后,NCX3水平上升更明显。大鼠海马和颞叶皮层中NCX3蛋白在A、B、C、D组的表达水平如下：海马：132.84±3.04,118.64±5.90,123.48±3.64,127.06±3.96；皮层：148.37±4.84,114.44±8.14,127.51±11.51,147.61±5.14。在海马中,单因素方差分析F值为28.77,P<0.01；在皮层中,F值为61.20,P<0.01。在海马与颞叶皮层中,B组NCX3蛋白水平比A组下降(P<0.05),C组或D组NCX3蛋白水平比B组增高(P<0.05),D组NCX3比C组增高(P<0.05),两组间差异有统计学意义。5 AIF免疫组化染色：AIF蛋白免疫反应产物呈棕黄色或棕褐色着色,主要分布于神经元胞浆和胞核；部分细胞核浓染,染色较胞浆深。慢性脑缺血后,大鼠海马和颞叶皮层中AIF蛋白水平上升,经NBP治疗后,AIF水平有所下降,但是经大剂量NBP治疗后AIF下降水平更明显。大鼠海马和颞叶皮层中AIF蛋白在A、B、C、D组的表达水平如下：海马：108.91±8.91，154.91±8.49，131.59±5.09，115.23±6.19；皮层：93.76±6.56，145.71±4.52,131.46±8.77，123.71±11.07。在海马中,单因素方差分析F值为101.85,P<0.01,差异有统计学意义；在皮层中F值为103.93,P<0.01,差异有统计学意义。在海马和皮层中,B组AIF蛋白水平比A组增高(P<0.05),C组或D组AIF蛋白水平比B组均下降(P<0.05),D组AIF水平较C组降低(P<0.05),以上所述两组间差异有统计学意义。结论NBP可以改善慢性脑缺血后大鼠脑组织的组织形态学损伤；NBP上调慢性脑缺血后的大鼠脑组织中的NCX3水平而下调AIF水平,提示NBP可能通过NCX3途径和AIF途径抑制细胞损伤和死亡,发挥对慢性缺血性脑组织的神经保护作用。
凌婧[6]2006年在《川芎挥发油对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究》文中认为【目的】 缺血性脑血管疾病由于发病率、死亡率、致残率高而严重威胁人类健康，积极有效的预防和治疗措施的研究具有深远的社会意义和经济价值。川芎是常用的活血化淤中药，在心、脑血管疾病的预防和治疗中具有重要的地位。本实验旨在观察不同剂量川芎挥发油口服给药后对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其保护作用可能的机制。 【方法】 将SD大鼠随机分为假手术组，脑缺血再灌注损伤模型组(阴性对照组)，尼莫地平对照组(阳性对照组)，川芎挥发油大剂量组，川芎挥发油中剂量组，川芎挥发油小剂量组。采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤(MCAO)模型，假手术组仅分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，然后缝合伤口。各组大鼠分别在脑缺血2小时，再灌注后22小时检测神经功能评分和脑梗死灶体积，采用放射免疫方法测定血浆中内皮素(ET)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量，采用生化试剂测定各组大鼠脑组织匀浆中一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量，采用免疫组化法测定各组大鼠脑组织细胞间黏附因
崔玉珍[7]2012年在《东菱迪芙联合应用丁苯酞对大鼠脑缺血损伤的影响》文中研究说明背景与目的脑血管病是由各种因素使供应脑部血液的血管发生病变所致的一种神经系统疾病。它是临床上的常见病、多发病,死亡率及致残率很高,现已经成为世界公认的三大致死疾病之一。因此,对缺血性脑血管病的防治的研究是关系到人类健康的重大课题。临床上治疗的关键在于挽救缺血区域(半暗带)的濒临死亡的神经元和促进损伤后神经功能的恢复。探讨东菱迪芙和丁苯酞对急性期脑梗死的脑保护作用及其可能机制；探讨东菱迪芙联合丁苯酞对急性期脑梗死治疗效果。方法用线栓法制作大鼠大脑中动脉梗塞模型。健康Wistar大鼠100只,随机分为正常组、脑缺血组(缺血后0.5h,腹腔注射4ml/kg生理盐水)、东菱迪芙组(缺血后0.2h,腹腔注射8BU/kg东菱迪芙)、丁苯酞组(缺血后0.5h、6h,腹腔注射4ml/kg/次丁苯酞)、联合用药组(缺血后0.2h,腹腔注射8BU/kg东菱迪芙,缺血后0.5h、6h,腹腔注射4ml/kg/丁苯酞)。梗死24小时后取出大脑,间隔2mm连续冠状切片,TTC缓冲液中染色,正常组织染成粉红色,梗死灶染成白色,摄像,LUZEX-F图像分析软件计算出梗死面积,之后用5ml注射器取心脏血5ml左右,常规方法采用CA7000全自动血凝分析仪进行D-二聚体定量检测。hs—CRP浓度采用免疫比浊法,用全自动生化仪测定,严格按试剂盒说明书进行操作。结果1.对脑缺血24h后的大鼠进行脑梗死面积测定示：东菱迪芙组、丁基苯酞组、联合用药组与脑缺血组比较,均有显著性差异(P＜0.05)；东菱迪芙组、联合用药组与丁基苯酞组间比较,也有显著性差异(P＜0.05)；联合用药组与东菱迪芙组比较有统计学差异(P<0.05)；2.D—二聚体测定在脑缺血组显著高于正常组(P<0.05)、丁基苯酞组显著低于脑缺血组(P<0.05)、东菱迪芙组显著低于丁基苯酞组(P<0.05)、联合用药组显著低于东菱迫芙组(P<0.05)、正常组显著低于联合用药组(P<0.05)。3.超敏C-反应蛋白的测定在脑缺血组显著高于正常组(P＜0.05)、丁基苯酞组显著低于脑缺血组(P<0.05)、东菱迪芙组显著低于丁基苯酞组(P<0.05)、联合用药组显著低于东菱迪芙组(P<0.05)、正常组显著低于联合用药组(P<0.05)。结论东菱迪芙与丁基苯酞通过降低D-二聚体和超敏C-反应蛋白水平,缩小急性期脑梗死的梗死面积,具有脑保护作用,且联合用药效果更佳。
贾智若[8]2014年在《佛手散化学成分分析及其抗脑缺血作用的研究》文中提出佛手散,又名芎劳汤,出自宋·许叔微《普济本事方》卷十,由当归和川芎两味中药组成,既是古方,又是一著名药对。该方组方精良,配伍严谨,具有活血化瘀、气血兼顾、祛风止痛之功效。古时主治妇女月经不调、胎前产后血虚头晕、头痛,心腹诸痛等病证。现代药理研究发现该方具有抗血小板聚集、抑制血管平滑肌增生、改善血液循环、抗脑缺血及抗氧化等多种功效。近年临床上多用于治疗脑中风、脑动脉硬化、深静脉血栓等心脑血管疾病,疗效确切。尽管佛手散及其单味药、有效成分等已在临床上得到了广泛的应用,组方单味药当归和川芎的物质基础研究也取得了相当的进展,但从方剂整体水平上研究佛手散的化学物质基础、抗脑缺血的药理作用却鲜有报道。本课题以佛手散水煎剂为研究对象,建立其指纹图谱分析方法及指标成分测定方法,从定性定量的角度检测佛手散水煎剂的内在质量,获得汤剂中所含的化学成分信息。结合体内和体外不同层次的脑缺血损伤模型,分别从整体动物和细胞两个水平上研究佛手散水煎剂对缺血性脑损伤的保护作用,在此基础上,进一步对复方佛手散全方及不同萃取部位进行体外抗脑缺血药效筛选实验,探讨其抗脑缺血的有效部位及有效成分。采用优选的水提工艺对佛手散水煎剂进行制备,以10批佛手散水煎剂样品为研究对象,运用HPLC法建立该方水煎剂指纹图谱,利用“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”软件对10批样品的相似度进行评价,建立佛手散水煎剂指纹图谱的共有模式,测得各批次样品与共有模式的相似度,结果表明各批样品中共有峰的相对保留时间基本一致,RSD均小于1%,相似度均大于0.94,符合中药指纹图谱的技术要求,所建立的共有模式能较好地反映出全方化学成分质与量的分布情况,并通过复方与组方药味指纹图谱的相关性分析,对其化学物质组成进行初步表征,研究结果可为该方的质量控制和化学物质基础研究提供参考依据。在此基础上应用超高效液相色谱-电喷雾-质谱(UPLC-ESI-MS)技术对佛手散的化学成分进行了定性鉴别,通过对质谱和光谱数据的解析,结合部分对照品和参考文献的比对,对标定的16个色谱峰进行了分析鉴定,成功鉴定了其中的11个组分,分别是绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、川芎酚、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、丁烯基苯酞、丁基苯酞、洋川芎内酯A、藁本内酯以及邻苯二甲酸二丁酯,初步明确了佛手散水煎剂的主要化学物质基础。据文献报道,阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A和藁本内酯被证实是对心脑血管发挥作用的有效成分,因此本研究运用UPLC法首次建立了佛手散水煎剂中阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A及藁本内酯4种有效成分的含量测定方法。结果表明该方法操作简便、精密度高,可为其质量控制提供科学依据。为进一步确证佛手散抗缺血性脑损伤的疗效,本研究结合体内和体外不同层次的脑缺血损伤模型,分别从整体动物和细胞两个水平上研究该方汤剂对缺血性脑损伤的保护作用。首先采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞局灶性脑缺血再灌注(middle cerebral artey occlusion,MCAO)模型,从整体动物水平上考察佛手散水煎剂对实验性脑缺血损伤的保护作用,结果显示,佛手散对实验性脑缺血所致的大鼠神经行为学障碍、脑水肿程度以及脑梗死体积均有明显的改善作用,且作用呈剂量依赖性,表明佛手散水煎剂对脑缺血再灌注损伤具有良好的保护作用,其机制可能通过增加脑组织中抗氧化酶活力、降低脂质过氧化反应等发挥效应。此外,本研究采用连二亚硫酸钠合并缺糖建立体外PC12细胞氧糖剥夺(oxygen-glucose depriviation, OGD)损伤模型,从细胞水平上考察该方对PC12神经细胞缺氧缺糖损伤的保护作用,结果显示,相比于模型组,佛手散水煎剂预处理组对缺氧缺糖诱导的细胞损伤具有明显的保护作用,可剂量依赖性的减少细胞中MDA和NO含量,提高SOD活性,此可能是佛手散水煎剂发挥神经保护作用的机制之一。在体内外实验证实佛手散水煎剂具有抗脑缺血作用的基础上,本课题借助传统植化手段,采用不同溶剂对佛手散全方进行梯度萃取,分别得到乙酸乙酯、正丁醇和残余水三个萃取部位,通过UPLC指纹图谱对不同部位的化学成分进行表征,同时以体外培养的PC12细胞建立氧糖剥夺(OGD)损伤模型,直接在细胞水平上考察佛手散各部位对神经细胞缺血样损伤的影响,以筛选佛手散水煎剂抗脑缺血的有效部位及有效成分。药效筛选结果表明乙酸乙酯部位对PC12细胞OGD损伤的抑制作用较强,抑制率大于50%,与全方组药效相近；残余水部位的抑制作用次之；而正丁醇部位的抑制作用不明显。推测乙酸乙酯部位和残余水部位为佛手散抗缺血性脑损伤的有效部位,其药效成分可能主要集中于上述两个部位。综合前期UPLC-ESI-MS分析结果,乙酸乙酯部位主要是阿魏酸和咖啡酸以及洋川芎内酯A、H、I、丁基苯酞、丁烯基苯酞、藁本内酯等苯酞类化合物。据此推测上述化合物可能是佛手散水煎剂抗脑缺血的主要药效物质基础,而残余水部位的主要化学成分目前尚未明确,有待进一步研究。综上所述,本研究结果可为阐明佛手散水煎剂抗脑缺血的药效、物质基础以及建立质量评价方法提供科学依据,为该方剂的二次开发和临床应用提供理论参考。
徐玉振[9]2011年在《丁苯酞对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及海马MMP-2、MMP-9表达的影响》文中进行了进一步梳理血管性痴呆(vascular demensia,VD)是由一系列脑血管因素导致脑组织损害所引起的脑高级功能障碍综合征的总称,其诊断具有以下三项及以上的精神活动受损如语言、记忆、视空间技能、情感、人格、计算力和抽象判断力[1]。临床常见的血管性痴呆包括:多梗塞性痴呆、大面积脑梗塞性痴呆、皮层下动脉硬化性脑病(Binswanger病)、特殊部位梗塞所致痴呆及出血性痴呆等。随着社会老龄化及生活模式的改变,VD的发病率逐年提高,成为仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的第二大痴呆类型[2],是神经内科的常见病、多发病,不仅严重影响广大患者的身心健康和生活质量,也给社会和家庭带来了沉重的负担。近年来,VD的发病呈现年轻化的趋势,日益受到广大科研和临床工作者的重视。目前VD的发病机制尚未完全明确,也无确切有效的防治方法,因此探讨VD的发病机制,制定有效的治疗方案,已成为医学领域研究的热点。学习记忆是大脑的高级神经生理活动之一。学习是经验和技能的获得,记忆则是经验和技能的保存和再现。学习和记忆是两个不同的神经生物过程,既相互联系,又密切合作,使生物体适应不断变化的外界环境[3]。大量研究表明,大脑海马等结构对学习和记忆的形成和保持具有重要意义。记忆分为瞬时记忆、短时记忆、长时记忆和永久记忆四种。较长时的记忆可能与脑内蛋白质的合成有关,而永久性的记忆则可能与新突触的建立有关[4]。海马独特的组织结构及神经生理功能可能参与了这种蛋白质和突触的合成和建立。人体的多种神经递质及体液因子参与了学习记忆的过程,如胆碱能系统、兴奋性氨基酸谷氨酸及其受体、NO及钙调蛋白等,已得到基础医学科学和临床科学的广泛证实,但由于其机制复杂,目前仍未完全明确。消旋3-正丁苯酞(dl-3n-butylphthalide,NBP),是由中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所合作开发的国家级一类新药,具有完全的自主知识产权,最早是从天然植物芹菜籽中分离提纯并消旋合成的黄色油状液体,具有较好的抗脑缺血疗效。丁苯酞抗脑缺血的机制极其复杂,是由多基因、多靶点、多环节参与的过程。通过减轻脑水肿,改善脑能量代谢、改善缺血脑区的微循环,抑制神经细胞凋亡,抗脑血栓形成、抗血小板聚集作用、抑制谷氨酸释放,降低细胞内钙浓度、抑制自由基和提高抗氧化酶活性等机制而发挥药效作用[5]。目前对丁苯酞的研究大多集中在脑缺血领域,尚缺乏对其与VD之间关系的相关研究报告。MMPs尤其是MMP-2及MMP-9在VD发病中的作用已得到越来越多科研工作者的重视,有理由认为,MMPs有可能是丁苯酞治疗VD的靶点之一。本实验研究探讨消旋3-正丁苯酞对VD大鼠的保护作用及其可能的治疗机制,进而为临床治疗提供科学的依据。目的:研究消旋3-正丁苯酞对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及海马MMP-2、MMP-9表达的影响,探讨丁苯酞对慢性脑缺血的治疗机制。研究方法:12—16周龄的健康雄性Wistar大鼠160只,体重约250-300g,随机分为假手术对照组(n=40),模型组(n=40),丁苯酞大剂量组(n=40)(剂量为6mg/kg),丁苯酞小剂量组(n=40)(剂量为2mg/kg)。以2-Vo法制作血管性痴呆模型,分离大鼠双侧颈动脉,假手术对照组只分离不结扎,模型组、丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组永久结扎双侧颈动脉。丁苯酞注射液大剂量组和丁苯酞小剂量组于手术当日起即腹腔注射相应剂量的丁苯酞注射液,模型组腹腔注射等量的生理盐水,假手术组不给药。在给药后的1d、3d、5d、7d、14d和30d,在各时间点分别随机选取各组大鼠3只,经心脏灌注后断头取脑,于视交叉后1mm及4mm冠状切开脑组织,去除小脑和脑干,取中间海马组织,经固定、脱水、浸蜡、包埋制成石蜡切片,行免疫组化染色观察MMP-2及MMP-9的表达变化。各组剩余大鼠于给药后30d行跳台回避试验和Morris水迷宫试验,测试学习记忆能力,行HE染色观察海马病理变化。数据以均数士标准差(x士s )表示,运用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差的分析,采用LSD-t检验进行各组间两两的比较,P<0.05有统计学意义。结果1.实验动物的一般情况各组大鼠术后均出现毛发凌乱、活动减少、精神萎靡和少食少饮,术后麻醉苏醒时间和精神体能恢复时间,假手术对照组明显早于模型组,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组,而丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组明显早于模型组。假手术对照组术后1天即可恢复精神,丁苯酞治疗组约需2-3天,模型组最长,约5-7天左右恢复。2.跳台回避试验和Morris水迷宫试验各组大鼠于术后第31天测试跳台回避试验和Morris水迷宫试验作为学习成绩,各组大鼠于术后第32天测试跳台回避试验和Morris水迷宫试验作为记忆成绩。跳台试验以大鼠逃避潜伏期和错误次数作为学习成绩,潜伏时间和错误次数作为记忆成绩;Morris水迷宫试验以逃避潜伏时间和错误次数作为学习成绩,以停留原平台象限时间作为记忆成绩。2.1跳台试验的结果显示:在学习能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的跳台逃避潜伏期明显缩短,分别为(85.23±12.71,56.18±11.36,57.96±11.48)秒,错误次数明显减少,分别为(4.78±0.79,2.08±0.41,2.09±0.45);在记忆能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的潜伏时间明显延长,分别为(72.84±10.26,152.27±11.70,153.19±11.58)秒,错误次数明显减少,分别为(1.86±0.13,0.53±0.05,0.55±0.06)。2.2 Morris水迷宫试验的结果显示:在学习能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的跳台逃避潜伏期明显缩短,分别为(80.71±8.27,43.25±5.29,44.74±5.82)秒,错误次数明显减少,分别为(37.53±7.69,14.76±5.01,15.68±5.32);在记忆能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的原平台象限时间明显延长,分别为(18.67±5.39,32.35±4.27,31.19±4.78)秒。3.各组大鼠海马HE染色假手术对照组:神经元变性坏死及细胞水肿不明显,细胞核大而圆,细胞排列紧密,与周围神经元界限清楚;模型组:神经元变性坏死及细胞水肿明显,核固缩,与周围神经元有明显水肿带;丁苯酞治疗组:神经元变性凋亡程度介于假手术组与模型组之间,神经元之间结构较清晰,无明显水肿带,受损神经元数量较模型组明显减少,丁苯酞大剂量组神经元受损的病理学表现较丁苯酞小剂量组为轻。4. MMP-2,MMP-9的免疫组化染色各组大鼠分别在术后的1d,3d,5d,7d,14d和30d以10%水合氯醛麻醉,断头取脑,4%多聚甲醛灌注固定,石蜡包埋,冠状切片,采用SP法行免疫组化染色,观察MMP-2,MMP-9表达的情况。用图象采集系统采图和图像分析软件对图像进行统计学分析。与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组MMP-2,MMP-9在各时间点的表达明显减少,p<0.05,有统计学意义,表明丁苯酞可减少MMP-2及MMP-9的表达。结论:1.丁苯酞可改善VD模型大鼠在跳台回避试验和Morris水迷宫试验中的学习记忆能力。2.慢性脑缺血VD大鼠海马神经元的MMP-2及MMP-9的表达明显增加。3.丁苯酞可使海马神经元的MMP-2及MMP-9的表达明显减少。4.丁苯酞对MMP-2及MMP-9的表达的影响有可能是丁苯酞对VD的治疗作用的靶点之一。
张海霞[10]2004年在《电压依赖性钾通道在Aβ_（25-35）诱导的神经元凋亡中的作用及相关药理学研究》文中研究指明Aβ是形成老年痴呆病人老年斑的主要成分，可引起神经元的退变和凋亡。Aβ的神经毒性涉及到复杂的分子机制，包括促进自由基的产生，破坏细胞内的Ca~(2+)稳态，增强细胞因子引起的炎症反应等。近来研究表明延迟整流钾通道介导的钾离子外流增加在Aβ引起的神经元凋亡中发挥重要作用。尽管大量研究表明钾通道激活促进凋亡发生，但也有研究者持相反观点。为进一步阐明钾通道在凋亡中的确切作用，我们系统研究了钾通道在Aβ_(25-35)诱导的海马神经元凋亡中的作用。 Donepezil和galantamine是第二代胆碱酯酶抑制剂，被广泛应用于老年痴呆的治疗。本室的前期研究表明，donepezil和galantamine可明显抑制大鼠海马神经元上的延迟整流钾通道，但它们对钾通道亚型的作用尚未见报道。Kv1.5和Kv2.1是海马神经元上表达最为广泛的延迟整流钾通道。我们在本文中对克隆Kv1.5和Kv2.1钾通道的电生理特性和donepezil、galantamine对其作用进行了研究。 丁基苯酞(3-n-Butylphthalide，NBP)，是我所合成开发的新型抗脑缺血药物，可明显抑制神经元凋亡的发生。钾通道在凋亡中发挥了重要作用，而且研究发现Kv1.5和Kv2.1钾通道与凋亡关系密切。因此，NBP对海马神经元钾通道和克隆的Kv1.5和Kv2.1钾通道的作用研究有望为NBP抗凋亡的机制提供新线索。 钟通道是许多重要疾病的治疗靶点，近来出现了许多分析平台用于筛选钾通道调节剂。但所有筛选结果都需进行电生理实验做最后的验证。在本文中，我们采用了膜片钳技术对我室高通量筛选结果进行了进一步筛选和验证。
参考文献：
[1]. 丁基苯酞对脑缺血神经细胞凋亡的抑制作用及其机理研究[D]. 董高翔. 中国协和医科大学. 1999
[2]. 丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧炎性损伤及机制[D]. 吴丽蓉. 重庆医科大学. 2007
[3]. 丁基苯酞抑制低氧低糖诱导的大鼠皮质神经细胞凋亡[J]. 董高翔, 冯亦璞. 药学学报. 1999
[4]. 丁基苯酞对血管性痴呆小鼠海马神经元NF-κB、ICAM-1表达的影响[D]. 蔡耘. 河北医科大学. 2010
[5]. 丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠脑组织NCX3和AIF表达的影响[D]. 李雁. 郑州大学. 2010
[6]. 川芎挥发油对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D]. 凌婧. 四川大学. 2006
[7]. 东菱迪芙联合应用丁苯酞对大鼠脑缺血损伤的影响[D]. 崔玉珍. 延边大学. 2012
[8]. 佛手散化学成分分析及其抗脑缺血作用的研究[D]. 贾智若. 成都中医药大学. 2014
[9]. 丁苯酞对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及海马MMP-2、MMP-9表达的影响[D]. 徐玉振. 泰山医学院. 2011
[10]. 电压依赖性钾通道在Aβ_（25-35）诱导的神经元凋亡中的作用及相关药理学研究[D]. 张海霞. 中国协和医科大学. 2004
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