何毅[1]2004年在《褪黑素修饰超氧化物歧化酶及其性质的初步研究》文中研究表明关于超氧化物歧化酶的化学修饰，国内外学者已做了较多且较为深入的研究。修饰后的SOD与修饰前比较，其稳定性大大提高，并且免疫原性降低或消除，是酶分子改造中一个较为成功的方面。本文在前人研究的基础上，拓展了关于SOD化学修饰的新思路：在对SOD进行分子改造的同时，着重于扩展其功能，使之成为具备复合型功能的酶分子。本文选用了具备清除自由基、增强免疫等功能的褪黑素作为修饰剂对SOD进行改造。 在自由基代谢中，SOD能够特异性的清除超氧阴离子(O_2~-)，但是对于由O_2~-反应产生的其他更具危害性的自由基如：·OH、ONOO~-等却无能为力。而MT就具备清除·OH、ONOO~-的能力。如果能将二者结合起来，得到的MT-SOD理论上会具备更强的清除自由基的能力。 为了将MT与SOD分子偶联，本文借鉴了免疫学中MT免疫原的制备方法。以甲醛作为偶联剂，将MT连接到SOD分子表面的游离氨基上。 由于甲醛能使SOD失活，于是对甲醛的反应浓度进行了筛选，结果表明选用浓度为0.250g/100ml的甲醛作为偶联剂进行化学修饰的效果较为理想。 修饰反应完成后，用丙酮沉淀、透析等方法将反应物分离纯化，根据MT和SOD的性质确立了一套快速检测MT连接效率的实验方法，并能够计算出每个SOD分子上连接了6-9个MT分子。通过检测，结果表明得到的MT-SOD保留了60％的SOD活性，而且1000ug／ml的MT-SOD(含60-90ug／ml的MT)清除·OH的能力与70ug／ml的MT相当，表明修饰后MT的活性几乎完全保留。结果表明MT已成功与SOD偶联，MT-SOD同时具备了MT以及SOD的生理活性。 将猪血SOD和MT-SOD在75℃下保温不同时间，测定两者的酶活。实验发现保温70min，MT-SOD还保留有61.3％的活性，而天然SOD的活性只剩余35.2％。说明MT-SOD与天然的SOD相比，对温度有更强的抗性，热稳定性增强。
周志刚[2]2009年在《不饱和脂肪酸修饰超氧化物歧化酶的制备和性质研究》文中认为过量的活性氧的产生容易损害生物大分子物质如蛋白质、脂质、核酸等,引起各种各样的疾病如炎症、糖尿病、癌症和神经变性性疾病。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一类能够专一清除超氧阴离子自由基的金属酶,在机体的抗氧化防御体系中占有重要的地位,被广泛的用作药用酶预防和治疗上述疾病。然而,由于SOD存在半衰期短、稳定性差、不易透过细胞膜等缺陷,实际应用价值受到了极大的限制。本实验采用两种不同的合成方法用亚油酸和α-亚麻酸修饰Cu,Zn-SOD,以期提高SOD的稳定性和亲脂性。对修饰后SOD的活性保持率,热稳定性,耐酸碱性和抗胃蛋白酶,胰蛋白酶水解稳定性,表观油水分配系数研究表明,亚油酸和α-亚麻酸较大分子物质修饰SOD活性保持率高,修饰后SOD热稳定性,酸碱稳定性,抗蛋白酶水解稳定性显着提高,特别是表观油水分配系数也增大了。这说明不饱和脂肪酸修饰SOD可以增强其稳定性,提高生物利用度,有望作进一步药学性质研究。
毛琳[3]2015年在《不同尺寸纳米叁氧化钨致小鼠肝肾毒性研究以及褪黑素的保护作用》文中提出纳米叁氧化钨(W03)作为一种新型的过渡金属氧化物和半导体材料,因其具有气致变色、电致变色、气敏性、光催化等多种性能而在环境监控、生物医药行业、军事及其他领域都有巨大的应用前景。与此同时,伴随而来的纳米WO3的安全性问题也日益引起研究者的广泛关注。然而目前对纳米WO3的生物学效应研究比较少,且不同尺寸的纳米WO3毒性比较也未曾报道。本课题通过对两种不同尺寸的WO3纳米棒(小尺寸的WO3纳米棒-S和大尺寸的WO3纳米棒-L)分别腹腔注射暴露后对BALB/c小鼠肝脏和肾脏组织损伤及其毒性机制的研究,分别对这两种尺寸的W03纳米棒对肝脏和肾脏的毒性进行了评价与比较,以研究导致肝脏和肾脏损伤以及损伤差异的可能机制,同时采用褪黑素作为保护剂,为选择合适的尺寸的WO3纳米棒材料和WO3纳米棒的安全应用提供了参考依据。本研究通过对WO3纳米棒-S和W03纳米棒-L暴露后小鼠的体重变化、肝功能指标(谷丙转氨酶,ALT；谷草转氨酶,AST)和肾脏功能指标(尿素氮,BUN；肌酐,Cr)检测、肝脏和肾脏组织病理学观察来评价其对小鼠肝脏和肾脏造成损伤的程度。通过肝脏和肾脏组织氧化应激指标(活性氧,ROS；丙二醛,MDA；还原型谷胱甘肽,GSH；超氧化物歧化酶,SOD和8-羟基脱氧鸟苷,8-OHdG)、炎症指标(免疫球蛋白IgE；核转录因子-KB, NF-κB;肿瘤坏死因子-α,TNF-α;干扰素-γ,IFN-γ和白介素-4,IL-4)的检测来探讨W03纳米棒-S和W03纳米棒-L产生毒性的可能机制,以及从W03纳米棒-S和W03纳米棒-L其自身理化性质的角度来讨论二者毒性不同的原因。并通过褪黑素作为保护剂,来研究预处理褪黑素后WO3纳米棒-L暴露对小鼠肝脏和肾脏的组织的保护效应及保护机制。实验结果表明,对于W03纳米棒-S,与对照组相比,W03纳米棒-S暴露剂量为5mg/kg时肾功能指标BUN和Cr含量都出现显着性升高,小鼠的肾脏组织病理切片显示,肾小球细胞出现轻微的水肿,肾小管变得狭窄。W03纳米棒-S暴露剂量5mg/kg时,小鼠的体重在染毒暴露过程中出现了显着性降低,肝脏功能指标ALT、AST水平显着性上升,肝脏和肾脏组织内氧化应激指标ROS水平以及MDA、 8-OHdG的含量显着性升高；GSH含量、SOD活性显着性降低；炎症水平IgE含量以及肝脏组织内的NF-κ、TNF-α、IFN-γ和IL-4的含量显着性上升；小鼠肝脏的组织病理学表现为肝细胞出现水肿,细胞核固缩甚至消失,部分细胞出现了空泡样变,肾脏组织的病理学变化表现为肾小球细胞水肿程度加重,肾小管变窄甚至消失并且最高剂量时肝肾组织病变更加明显；而对于W03纳米棒-L,在剂量≥10mg/kg时,肾功能指标BUN、Cr的水平显着性上升；在剂量为20mg/kg时能引起小鼠体重的显着性降低,肝功能指标ALT、AST的水平显着性上升,肝脏和肾脏组织氧化应激指标ROS水平、MDA的含量、8-OHdG的含量都显着性升高,GSH含量、SOD活性都显着性降低；炎症指标IgE含量明显升高,肝脏和肾脏组织中的NF-κB、 TNF-α、IFN-γ和IL-4的含量都显着性上升,肝脏和肾脏组织出现与W03纳米棒-S暴露剂量≥10mg/kg类似的病理学变化,但是病变程度没有W03纳米棒-S≥10mg/kg剂量组明显。结果提示,W03纳米棒-S暴露剂量≥5mg/kg时就能引肝脏或者肾脏的毒性效应,而W03纳米棒-L剂量在≥10mg/kg时能够引起肝脏和肾脏的毒性效应。通过褪黑素预处理20mg/kgWO3纳米棒-L暴露组小鼠后,结果发现,与单独的20mg/kg WO3纳米棒-L暴露组相比,小鼠体重的下降明显减少、肝脏和肾脏功能受损得到明显的减轻,小鼠的肝脏和肾脏组织氧化应激,炎症水平都显着性降低,并且肝脏和肾脏组织的病理学损伤程度得到一定程度的降低。本研究结果提示,W03纳米棒-S≥5mg/kg能够引起肝脏和肾脏毒性效应,而W03纳米棒-L剂量≥10mg/kg和剂量≥20mg/kg时能够分别引起肾脏和肝脏毒性效应。而氧化应激以及炎症可能是造成这两种材料造成肝脏和肾脏组织损伤的机制之一,且W03纳米棒的尺寸效应可能是W03纳米棒-S的毒性作用大于W03纳米棒-L的主要原因。本研究中2.5mg/kg的W03纳米棒-S,5mg/kg的W03纳米棒-L对于小鼠来说是一个相对安全的使用剂量。褪黑素能够通过降低肝和肾脏功能指标水平、肝脏和肾脏组织中氧化应激、炎症的水平对小鼠的肝、肾组织进行保护,进而降低W03纳米棒-L对小鼠肝脏和肾脏组织的损伤程度。
付文力[4]2013年在《羊血SOD分离纯化及修饰与理化性质研究》文中研究说明超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是一种广泛存在于各种需氧生物内的金属酶，它能够有效地清除生物体在氧化过程中产生的超氧阴离子自由基O_2~-。根据其活性中心所含金属离子不同，可分为Cu,Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD、以及Ni-SOD四种类型。其中，Cu,Zn-SOD主要存在于真核细胞的细胞质中。由于SOD在抗氧化、抗炎、抗肿瘤，及自身免疫性疾病方面都有重要作用，因此在医药，保健食品，化妆品中都有着广泛的应用。本研究用新鲜羊血为实验材料，对传统分离方法进行改进，采用了Cu~(2+)、Zn~(2+)变性除杂蛋白法分离粗酶、DEAE-A50葡聚糖凝胶层析法纯化提取SOD，并通过单因素试验与L_9(3~4)正交试验探索最佳工艺参数；利用纯化的羊血SOD建立壳聚糖修饰SOD工艺，通过单因素和L_9(3~4)正交试验，优化壳聚糖修饰羊血SOD的反应条件，并初步测定了修饰酶的稳定性。结果表明：利用硫酸铜和硫酸锌作为保护剂和激活剂来提纯羊血SOD，经过溶血，热变性除杂，浓缩获得SOD粗品，变性除杂蛋白的最优工艺参数为Cu~(2+)浓度6.1mmol/L、Zn~(2+)浓度13.9mmol/L、变性除杂温度为65℃、变性时间为15min，粗酶活性达到了传统工艺提取分离的效果，纯酶比活力为6213.3U/mg（酶蛋白）；壳聚糖修饰羊血超SOD的最佳反应条件应为每2mgSOD中壳聚糖用量0.25g、戊二醛浓度0.7%、pH值5.6、搅拌时间2h，壳聚糖修饰SOD酶活力为580.79U/g，且酸热稳定性明显优于天然SOD，4℃的半衰期达到132d。
秦川[5]2013年在《贯叶连翘褪黑素测定及其提取物降血糖作用的初步研究》文中认为贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)是我国传统中草药,在抑郁、肿瘤、病毒感染、细菌侵染、炎症发生等方面具有重要的治疗作用,这些作用与其含有的多种活性成分有密切关系。褪黑素(Melatonin)作为贯叶连翘中一种重要的活性成分,是迄今发现的最强的内源性自由基清除剂之一,在机体内具有重要的生理作用,它能够改善人的睡眠状态,提高机体的抗氧化、抗衰老能力,提高免疫力等。建立稳定准确的测定贯叶连翘中褪黑素的方法对于研究褪黑素在植物中的作用具有指导意义。已有研究表明褪黑素具有降低糖尿病大鼠血糖的作用,这可能与它具有很强的自由基清除能力有关。糖尿病和氧化应激之间存在一定关联,而抗氧化治疗能够通过减轻机体内氧化应激水平,对糖尿病及其并发症的防治起到一定的作用。选择一种有效的抗氧化治疗药物,并对其作用进行研究,对防治糖尿病与其并发症具有重要的意义。本研究目的在于通过优化褪黑素提取纯化方法,建立准确的褪黑素HPLC检测方法,详细测定贯叶连翘及其提取物中褪黑素的含量,进一步研究贯叶连翘的降血糖作用,探讨贯叶连翘提取物、褪黑素对于糖尿病机体组织中的氧化应激水平的影响和降血糖的效果。论文的主要研究内容如下：1、贯叶连翘中褪黑素测定方法的建立。基于HPLC技术建立了测定褪黑素的方法：采用Phenomenex C18反向色谱柱(规格：5μm,4.6mm×250mm),流动相为含0.2%(v/v)冰醋酸的水溶液、乙腈、甲醇,在30℃下,使用1.0mL/min的流速梯度洗脱,在波长223nm处进行检测。同时优化了褪黑素的提取方法。方法学研究表明,褪黑素进样量在0.1μg-1.5μg范围内时,线性关系良好,建立的方法的重复性好,精密度高,样品稳定性好,加样回收率达到99.6%,RSD为1.86%。通过建立的褪黑素提取纯化和HPLC检测方法,测定了5份野生贯叶连翘及外购贯叶连翘提取物样品,并记录其色谱峰面积,利用线性回归方程计算出样品中褪黑素的含量。2、对贯叶连翘降血糖作用进行研究。将4-6周龄的清洁级昆明雄性小鼠随机分为正常对照组(NC)、糖尿病模型组(DM)、阳性药物组(PC)、贯叶连翘提取物组(HYE)和褪黑素组(MT),其中贯叶连翘提取物组及褪黑素组又根据浓度不同各分为低(L),中(M),高(H)叁组,每组各10只小鼠。适应性喂养4d后,称体重、测血糖,除NC组外的其他各组小鼠以四氧嘧啶水溶液150mg/kg-BW一次性腹腔内注射0.2mL造成糖尿病模型,NC组腹腔注射等体积超纯水。实验过程中,所有小鼠均自由采食饮水,不给予其他辅助降糖药物,HYE组和MT组分别灌胃相应浓度的贯叶连翘提取物和褪黑素,PC组灌胃等体积药物溶液,NC组和DM组给予等体积超纯水灌胃,每天一次,每次0.2mL,持续3周。3周后,测小鼠血糖,称体重,并处死小鼠,测量各组小鼠的应激指示器官(肝、肾)重量,测量肝、肾组织内抗氧化酶(SOD, GSH-PX, CAT)活性、脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)水平及一氧化氮(NO)含量,一氧化氮合酶(NOS)活性。数据用SPSS软件分析。研究结果表明：1.褪黑素的提取纯化方法良好,检测方法精密、稳定,检测出贯叶连翘中存在较高含量的褪黑素；2.贯叶连翘提取物能降低糖尿病小鼠血糖,缓解糖尿病导致的小鼠体重下降；3.贯叶连翘提取物能缓解糖尿病小鼠肝、肾组织肥大及病变；4.贯叶连翘提取物具有清除自由基的作用,能够提高糖尿病小鼠体内组织中抗氧化酶(SOD、CAT)活性及GSH含量,降低MDA、NO含量,抑制NOS活性。该研究结果可为进一步研究植物中褪黑素的含量变化及作用等奠定基础,为贯叶连翘抗氧化应激损伤的药理作用及糖尿病抗氧化治疗等提供研究资料。
储海虹[6]2011年在《基于鲁米诺电化学发光的生物传感技术研究》文中提出电化学发光或电致化学发光分析方法(Electrochemiluminescence,ECL)是指直接利用电化学反应形成激发态发光体而发光或通过电解产物之间、电解产物与体系中某组分之间进行化学反应产生光辐射而实现分析物测定的发光分析技术,是电化学与化学发光分析相结合的产物。与传统的化学发光分析法相比,ECL分析法不仅具有化学发光分析法的灵敏度高和线性范围宽等优点,而且在许多方面优于化学发光分析,包括如:第一,不稳定的化学试剂和中间体在电极表面定量生成,且迅速进行化学发光反应;第二,电化学反应可以通过改变所施加的电位加以控制,所以可以有选择地控制化学反应而不需要采取额外的分离手段;第叁,电化学氧化能力是连续的,在同一化学条件下可以通过控制电位加以改变电化学氧化能力。本论文在全面总结和论述ECL分析的基本原理、常见ECL体系反应机理以及生物传感器的基本原理、分类、应用等方面的研究等基础上,进行了以下叁方面的研究工作:一、鲁米诺电化学发光体系是基于电化学氧化鲁米诺生成自由基,所生成的自由基不稳定,再进一步被一些氧化剂氧化产生化学发光。虽然ECL分析法具有灵敏度高、线性范围宽和仪器设备简单等优点,但是在中性、弱碱性介质这样有利于生物分子保持活性的环境中,鲁米诺的ECL发光极弱,传统的鲁米诺ECL应用多在强碱性介质中进行。为保持生物分子的活性,考虑利用合理的措施来有效实现鲁米诺在中性、弱碱性介质环境中的ECL增敏,对其发展和应用都有很高的学术和实用价值。在已经建立的ECL分析体系的基础上,探讨了纳米材料如金溶胶(Au sol)和铂溶胶(Pt sol)、有机分子如氯霉素(Chloramphenicol,CAP)和半胱氨酸(Cysteine)、以及介质体系如微乳液(Microemulsion)和离子液体(Ion Liquid)在中性、弱碱性介质中对鲁米诺ECL的增敏作用,研究中发现ECL信号与增敏剂之间均存在可以被实际应用的确定的定量关系,并探讨了各体系的增敏机理。在此基础上,采用吸附、自组装等手段制备了相关的修饰电极,而且可以有效实现ECL物质鲁米诺的固定化,在成功提高检测灵敏度的前提下,实现微量、痕量生物分子(如维生素C、褪黑素、超氧化物歧化酶等)的检测。二、在中性或弱碱性介质中,对溶解氧、过氧化氢(H_2O_2)、辣根过氧化氢酶(HRP)/ H_2O_2、黄嘌呤氧化酶(XOD)/次黄嘌呤(Xanthine)、尿酸酶(Uricase)/尿酸(UA)以及谷丙转氨酶(ALT)等对鲁米诺电化学发光的增敏(或猝灭)行为进行了研究,进而对机理进行了探讨。研究结果表明,O_2、H_2O_2及其氧化还原过程中生成的具有更强氧化性的活性氧(Reactive oxygen species,ROSs)对鲁米诺的电化学发光具有显着的增敏效果,促进鲁米诺中间态自由基激发,导致ECL信号增强,在生物反应适合的酸度范围内,对鲁米诺ECL的增敏作用尤其显着,为研究生物ECL传感器奠定了良好的基础。由于辣根过氧化氢酶(HRP)催化H_2O_2的分解,故猝灭H_2O_2增敏的鲁米诺ECL。其他酶催化反应均可在电极表面产生活性氧物质,从而增敏鲁米诺的ECL,并可建立与相关底物浓度间的定量关系。研究中,结合循环伏安(Cyclic Voltammetry, CV)法,紫外-可见吸收光谱(Ultraviolet-Visible Absorption Spectrometry, UV-Vis)法等方法探讨了有关机理。在此基础上,采用能较好保持生物分子活性的固定化方法和材料,将生物活性物质修饰于电极表面,制备了响应性能优良的ECL生物传感器,稳定性好,灵敏度高。将制备的ECL生物传感器应用到一些生物分子(如超氧化物歧化酶、ALT、尿酸等)的检测中,均获得满意的结果。这些ECL生物传感器在保持生物分子活性的前提下,兼具了ECL的高灵敏度以及酶的高选择性,对于相关物质的检测的灵敏度高、检测限低、具有很强的实用性。叁、DNA是生物体的基本遗传物质,是遗传信息的载体,它在生物的生长、发育和繁殖等生命活动中起着非常重要的作用。建立简单、敏感、特异和快速的病源、基因和药物检测方法,对疾病的预防、诊断和治疗具有重要的意义。论文研究了DNA在弱碱性介质中对鲁米诺ECL的猝灭作用,并用循环伏安法、紫外-可见吸收光谱法和荧光光谱法等讨论了其猝灭机理。采用金纳米粒子(Au NPs)和碳纳米管(CNTs)的复合纳米材料作为DNA的固定载体,应用鲁米诺的ECL作为对DNA响应的信号输出,制备了一种检测限低,灵敏度高、重现性好的DNA生物传感器。对应用ECL技术于不同互补状态的寡聚核苷酸杂交的表征进行了研究,结果表明ECL技术可以作为一种可靠的免标记表征杂交状态的手段。而药物与DNA相互作用的研究是认识某些疾病的致病机制和药物的治疗机制的基础,在阐明DNA结构和功能方面也具有重要意义。研究中探讨了利用ECL信号研究药物小分子如氯霉素(CAP)对DNA的损伤行为,并对其作用机理进行了探讨,为药物小分子损伤DNA的研究提供了一种可靠灵敏的检测模型。该研究对开发具有新颖特性的电化学发光探针和传感界面构造的新原理和新方法、以及设计和研制适用于检测蛋白质、基因或小分子药物的高灵敏度、高选择性、可重复使用的电化学发光DNA传感器具有很大的指导意义。
须文[7]2016年在《褪黑素在调控番茄耐热性中的作用及机制》文中研究指明番茄(Solanum lycopersicum L.)是一种世界各地普遍栽培的重要蔬菜作物,其产量和品质常常受到低温、高温、干旱、盐害、重金属以及多种病虫害的影响。因此,研究番茄等蔬菜的逆境响应和调控机制,寻求调控蔬菜的抗性、产量及品质安全的新途径对于发展可持续蔬菜生产至关重要。褪黑素(melatonin,MT)是一种可在许多植物细胞内检测到的色胺类化合物,近年来越来越多的研究表明,MT的外源性应用可以增强植物对各种非生物和生物胁迫的抗性,但有关MT诱导植物高温抗性和生物胁迫抗性的研究还很少,其调控机制亟待深入研究,尤其是MT对植物耐热性的调控及其潜在的分子机制仍然鲜为人知。本文以番茄为材料,利用植物生理学、生物信息学、分子生物学、植物显微技术等手段从光合作用、抗氧化系统、蛋白保护系统等方面系统研究了 MT调控番茄耐热性的作用机制。所得主要结果如下:1.明确了 MT对PstDC3000、Botrytiscinerea、高温和镉(Cd)等生物和非生物胁迫下番茄幼苗抗性的影响和其适用浓度。我们发现各种胁迫显着抑制番茄幼苗的光合作用,叶片的净光合速率(Pn)和最大潜在光化学效率(Fv/Fm)显着降低。适宜浓度的MT对PstDC3000、高温和Cd胁迫引起的Fv/Fm的下降,对Botrytis cinerea、高温和Cd胁迫引起的Pn的下降具有明显缓解作用。10μM的MT预处理能增强番茄对Pst DC3000的抗病性,但是外源MT在调控番茄幼苗对Botrytiscinerea病菌胁迫抗性中的作用并不明显。2.发现MT增强番茄的高温抗性与其诱导高温下叶片自噬体的形成有关,明确了 MT对高温下番茄叶片细胞内蛋白的氧化和沉淀蛋白的聚集有显着的抑制作用,高温下MT诱导的Hsp70表达和自噬体形成增多、叶片光合作用的增强、抗氧化能力的提高在MT调控的番茄耐热性中都发挥了重要作用。适宜浓度的MT(10 μM)叶面喷施预处理显着减小高温下番茄叶片的细胞膜相对透性、减轻膜质过氧化程度,表明MT对高温下细胞膜具有保护作用;MT显着提高高温下番茄叶片Fv/Fm和Asat,有效改善高温导致的光合抑制;透射电镜检测证明MT减轻了高温引起的叶绿体膨大;MT显着增强SOD、APX等抗氧化酶活性和编码这些酶的Cu/Zn-SOD、cAPX基因的表达,增加细胞内抗氧化物质GSH和AsA含量,增大GSH/GSSG和AsA/DHA,维持番茄叶片细胞内较高的还原态水平,明显减少H2O2的积累,减少细胞内氧化蛋白和不溶性蛋白的积累;显着诱导Hsp70的表达;激光共聚焦荧光显微镜检测发现MT在高温下显着诱导自噬体增多,是对照的2.5倍;透射电镜检测发现MT在高温下更早地激活自噬体的自噬过程。3.根据拟南芥中已经报道的一个新的具有N-乙酰基五羟色胺甲基转移酶(ASMT)活性的基因,即咖啡酸O位甲基转移酶(COMT)(能够催化NAS转化成MT)基因的序列为基础,在番茄基因组上利用生物信息学方法对番茄ASMT基因家族进行鉴定与系统进化分析。结果表明,番茄基因组中至少含有24个ASMT基因成员,蛋白质序列长度为96～369个氨基酸之间,具有0～3个内含子;序列比对发现这些ASMT基因家族成员具有10个保守基序;染色体定位发现它们不均匀分布在番茄的8条染色体上;系统发育关系揭示番茄和水稻、拟南芥的ASMT基因家族成员可以分为8组,每组成员数目是变异的,并且存在3对单拷贝直系同源基因,表明这些基因的特征在番茄和水稻、拟南芥分化之前就已经存在。4.明确了番茄ASMT基因沉默显着抑制内源MT的合成,TRV-ASMT植株的耐热性显着降低,外源补充适宜浓度的MT能缓解热胁迫和恢复沉默植株的耐热性。研究发现番茄内源MT含量随环境温度的升高而增加,40°C的高温显着诱导MT的生物合成、上调MT合成关键酶基因的转录水平。利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术沉默ASMT基因之后,番茄内源MT含量显着下降,高温胁迫下沉默植株的叶片细胞膜相对透性和膜质过氧化程度增大,Fv/Fm和Asat显着减小,APX和CAT等抗氧化酶活性和相关基因的表达在高温胁迫后显着减小,GSSG和DHA含量增加,GSH/GSSG和AsA/DHA下降,导致番茄叶片细胞内氧化态水平升高。高温下ASMT基因沉默植株叶片可溶性蛋白的氧化程度加重,沉淀蛋白积累增多。进一步研究发现对番茄ASMT基因沉默植株预处理MT后,高温下沉默植株所丧失的高温胁迫抗性又很大程度上得以恢复。
龚频[8]2009年在《内吗啡肽体内抗氧化活性及其体外氧化代谢产物的研究》文中提出内吗啡肽(EMs),mu阿片受体内源性的激动剂,主要生理活性表现为镇痛活性。之前我们组已经发现EMs可以与体外的活性氧自由基(ROS)作用,起到自由基清除剂的作用,本研究主要对EMs体内抗氧化活性以及其体外氧化代谢产物的性质进行了研究。1)重金属诱导机体损伤通常被用来构建体内氧化损伤的模型。在此研究中,我们利用氯化镉(CdCl_2)损伤雄性小鼠肝脏来建立肝脏氧化损伤模型,通过内吗啡肽1(EM1)对这一损伤作用的保护效果来研究EM1体内抗氧化活性。据报道,由金属镉(Cd)诱导的肝脏损伤的形成是氧化压力所介导的,因此,作为氧化损伤的主要指标,脂质过氧化反应的产物(LPO)和蛋白羧基化的产物(PCO)分别被检测,另外,同时还检测体内抗氧化体系状态的指标:超氧阴离子歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)以及还原型谷胱甘肽(GSH)。还对组织损伤的直观指标比如说肝脏组织学切片进行了分析。此外,肝脏内Cd和Zn的含量也进行了分析和测定。从这些指标的分析结果可以得出:1)Cd的毒性作用能够加强体内LPO和PCO的程度,而EM1的体内保护作用能够有效减少LPO和PCO的增加。2)在Cd的毒性作用下,体内CAT,SOD的活性以及GSH的含量都会有所增加,这可能主要是由于机体的氧化应激反应所引起的,而EM1的体内保护作用能够缓解这一增强的氧化应激反应。而且内吗啡肽的保护作用并不与浓度成剂量依赖的关系,而是呈现U型曲线。我们的结果从几个方面对EM1的可能的作用机制提出了假设,包括其结构的特点以及EM1的金属螯合能力,可能为EM1实现其体内抗氧化活性起到了主要的作用,另外,阿片受体的激活,从而引起下游通道的改变和EM1对炎症因子的抑制作用可能在EM1对Cd诱导的肝脏损伤的保护过程中起到一定的作用。2)据报道,Cd所诱导的心脏损伤是氧化压力所介导的。因此,通过氯化镉损伤雄性大鼠心脏来建立心脏氧化损伤的模型,通过EM1和内吗啡肽2(EM2)对这一损伤作用的保护效果来研究其体内抗氧化的能力。我们检测了其氧化损伤的指标:LPO和PCO,同时,还对其抗氧化防御体系的指标(CAT,SOD和GSH)进行了研究。另外对其组织形态学切片进行了分析,从以上数据的分析可以得出:EM1和EM2具有体内抗氧化的能力,能够保护机体免受金属Cd所诱导的氧化损伤。另外,Cd所造成心脏损伤的一个标志就是对机体的血压造成一定的影响,主要是通过抑制内皮细胞一氧化氮(NO)的释放而实现的。我们通过研究在体麻醉大鼠的血压和心率,以及相对应的NO的含量,来研究Cd对血压的影响与NO浓度变化之间的关系,以及EM1和EM2对血压和NO的影响,结果证明EM1和EM2能够减低血压,并增加NO的含量。对于其具体的作用机制,还在研究之中。3)作为体外的自由基清除剂和体内抗氧化剂,EM1被ROS的修饰过程以及其氧化代谢产物的性质吸引了我们的注意力。因此设计了体外的氧化模型模拟EM1与ROS作用的过程,并通过反向高效液相色谱分析(RP-HPLC),光谱检测(UV-VIS),电子顺磁光谱测定(ESR)、氨基酸分析,以及Schmorl反应等由此获得的氧化代谢产物进行了分析和鉴定,从而判断EM1在ROS作用下发生氧化反应而得到的产物是一种黑素类似的混合物,并对之命名为EM1-黑素。通过溶解度实验,放射性配体结合实验,NADH氧化实验,超氧阴离子清除实验对EM1-黑素的物理化学性质进行了研究,并与之前已知的多巴黑素与阿片黑素进行了比对和分析,认为EM1黑素是一种与这两种都类似但又不完全一样的黑素,可能是由于EM1中的Trp作为了另外一个自由基攻击的位点而使得黑素的聚合程度不同所导致的。另外还对其EM1-黑素可能的形成路径提出了假设。
周辉平[9]2010年在《超氧化物歧化酶分离－化学修饰耦合过程优化研究》文中认为常规的蛋白质化学修饰过程操作步骤多、周期长、修饰位点相对随机,容易引起蛋白质的变性失活。本课题提出了蛋白质分离过程和化学修饰过程的耦合技术,能够简化原来的生产操作步骤,缩短操作时间,从而减少蛋白活性的损失,降低投资成本和生产费用。本课题选择超氧化物歧化酶作为模型蛋白,选择Q Sepharose Fast Flow作为固相分离介质,选择单甲氧基聚乙二醇5000作为修饰剂,分别对超氧化物歧化酶的吸附条件,分离-化学修饰耦合过程的修饰条件以及分离-化学修饰耦合过程洗脱条件进行了优化,并对修饰后超氧化物歧化酶的稳定性进行了研究。第二章对超氧化物歧化酶吸附条件进行了考察,优化出Q Sepharose Fast Flow吸附超氧化物歧化酶的最佳条件是:时间为30min,pH值为9.0,SOD浓度为3.0mg/ml,温度为室温,最佳吸附条件下吸附量约为22.5mg/ml。第叁章对超氧化物歧化酶分离-化学修饰耦合过程的修饰条件和洗脱条件进行了考察,优化出耦合过程的最佳修饰条件是:修饰时间为270min,修饰缓冲液浓度为40mmol/L,mPEG-5000与SOD摩尔比为50∶1,修饰pH为9.0,修饰温度为室温;优化出超氧化物歧化酶分离-化学修饰耦合过程较好的洗脱方式有两种:洗脱方式1是NaCl浓度梯度洗脱(0–1.0mol/L),洗脱方式2是0.15mol/LNaCl洗脱+NaCl浓度梯度洗脱(0.15–0.6mol/L)。第四章对修饰后SOD的热稳定性、pH稳定性、抗胃蛋白酶水解能力和抗胰蛋白酶水解能力进行了考察,结果表明相比天然SOD,修饰后SOD对温度、酸、碱、蛋白水解酶等的耐受力都有一定程度的提高。
王怀清[10]2008年在《通络方药对链脲佐菌素所致高血糖及β-细胞损伤的保护》文中研究指明糖尿病是一种常见且严重的疾病。糖尿病的微血管病变是导致病人失明,晚期肾功能衰竭以及各种神经退行性病变的主要原因。糖尿病使供应心脏,大脑以及下肢血液的大动脉硬化加剧,结果糖尿病人患心肌梗塞,中风以及截肢的机率明显增加。流行病学调查显示,到2010年,全世界糖尿病人将达到3个亿。因此,如何减少糖尿病及其并发症带来的沉重的医疗及社会经济负担不仅是发展中国家面临的问题,对于发达国家也同样是一个巨大的挑战。氧化应激在糖尿病以及糖尿病并发症的发生发展中起着至关重要的作用。高血糖使线粒体内超氧阴离子生成过多,导致多元醇通路激活,蛋白质非酶糖化增加,PKC通路激活以及己糖胺途径激活,这些通路的激活引起急性内皮功能紊乱,最终导致糖尿病微血管病变以及大血管病变的发生发展。研究表明,抗氧化剂治疗能减轻实验动物模型体内以及人体内的氧化应激指标。与降糖治疗相比,抗氧化剂治疗安全价廉(如胰岛素强化治疗每年每例患者需花费1600美金),抗氧化剂治疗因而成为世界范围内一种有效的,切实可行的治疗措施。链脲佐菌素(STZ)特异破坏胰岛β细胞,因而被广泛用于诱发实验性糖尿病。人们普遍认为活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)是STZ导致啮齿类胰岛损伤的首要因素。STZ在胰岛内引起超氧阴离子及羟自由基堆积,刺激过氧化氢的产生,因而介导β细胞核DNA碎裂并最终导致β细胞坏死。褪黑素是强有力的抗氧化剂,同时褪黑素还能调节抗氧化酶以及促氧化酶活性并能控制抗氧化酶以及促氧化酶基因表达。褪黑素的脂溶性使其极易进入细胞及所有的亚细胞内,并能进入细胞核内发挥其抗氧化损伤的效应。实验表明,褪黑素能降低STZ诱发的高血糖水平,并能降低肝脏,肾脏以及胰腺等组织内氧化应激水平,后者与血糖高低无关。通络方药(TLR)由人参,水蛭,全蝎,蜈蚣,土鳖虫,蝉蜕,赤芍等组成。据报道通络方药能有效地降低血浆中总胆固醇以及甘油叁酯水平,改善微循环。我们既往的研究表明,通络方药通过降低血浆中以及组织中氧化应激水平发挥其对糖尿病大鼠周围神经(12),肾脏(13)以及大血管内皮细胞(14)的保护作用。目前,我们的研究旨在探究通络方药是否能有效地阻止STZ诱发的糖尿病,并与褪黑素的作用进行比较。本课题主要研究材料和方法雄性SD大鼠随机分为四组,正常对照组(NC,n=10);STZ组(STZ,n=10);通络方药+STZ组(TLR+STZ,n=10)褪黑素+STZ组(MLT+STZ)。链脲佐菌素(STZ)70 mg/kg体重腹腔注射,通络方药(1.0g/kg体重/天,强饲)及褪黑素(200μg/kg/day)在STZ注射前八天开始给予至实验结束。实验期限为四周。观测实验期间各组糖尿病发生率及血糖的动态变化,实验结束时取大鼠胰腺行MDA水平及GSH-Px活性测定,免疫组化方法检测β细胞功能。本课题主要结果三组不同来源的证据表明,通络方药以及褪黑素能有效地阻止STZ诱发的糖尿病的发生发展。首先,通络方药和褪黑素使STZ诱发的糖尿病的发生率降低并降低STZ诱发的高血糖水平(p＜0.05 vs STZ);其次,STZ使大鼠胰腺组织内MDA含量明显升高,GSH水平降低.通络方药以及褪黑素能逆转STZ引起的变化(p＜0.05 vs STZ),通络方药作用较褪黑素略强;最后,免疫组化结果显示,STZ使胰岛内胰岛素抗体染色明显减弱,通络方药以及褪黑素使胰岛内胰岛素抗体染色明显增强(p＜0.0001 Vs STZ)。本课题主要结论中药复方制剂通络方药和已知的强效抗氧化剂褪黑素一样能通过减少胰腺组织内氧化应激水平有效防止链脲菌素诱发的高血糖以及β细胞的损伤,通络方药的疗效较褪黑素略强。
参考文献：
[1]. 褪黑素修饰超氧化物歧化酶及其性质的初步研究[D]. 何毅. 华中师范大学. 2004
[2]. 不饱和脂肪酸修饰超氧化物歧化酶的制备和性质研究[D]. 周志刚. 浙江工业大学. 2009
[3]. 不同尺寸纳米叁氧化钨致小鼠肝肾毒性研究以及褪黑素的保护作用[D]. 毛琳. 华中师范大学. 2015
[4]. 羊血SOD分离纯化及修饰与理化性质研究[D]. 付文力. 甘肃农业大学. 2013
[5]. 贯叶连翘褪黑素测定及其提取物降血糖作用的初步研究[D]. 秦川. 陕西师范大学. 2013
[6]. 基于鲁米诺电化学发光的生物传感技术研究[D]. 储海虹. 苏州大学. 2011
[7]. 褪黑素在调控番茄耐热性中的作用及机制[D]. 须文. 浙江大学. 2016
[8]. 内吗啡肽体内抗氧化活性及其体外氧化代谢产物的研究[D]. 龚频. 兰州大学. 2009
[9]. 超氧化物歧化酶分离－化学修饰耦合过程优化研究[D]. 周辉平. 浙江工业大学. 2010
[10]. 通络方药对链脲佐菌素所致高血糖及β-细胞损伤的保护[D]. 王怀清. 第二军医大学. 2008