李英华[1]2001年在《鲤鱼生长激素 cDNA在毕赤酵母中的胞内表达和分泌表达》文中研究指明生长激素（Growth hormone.GH）是脊椎动物下丘脑分泌的单链多肽激素，鱼类生长激素参与鱼体的生长、发育和代谢等。鱼类脑垂体中天然生长激素含量极低，分离纯化比较困难，基因工程技术为生产大量廉价的鱼生长激素创造了条件。实验证明，重组鱼生长激素具有天然生长激素的功能，因此，生产基因重组鱼生长激素在水产养殖领域具有重要的应用价值。本论文成功实现了鲤鱼生长激素（Cyprinus carpio GH,cGH）在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的胞内表达和分泌表达。1 cGH在毕赤酵母细胞内的表达 根据cGH cDNA两端序列改造、设计一对引物。以cGH cDNA的克隆载体pUC18/GH为模板，扩增cGH成熟肽cDNA，克隆入酵母整合型胞内表达载体pHIL-D2的EcoR I位点，转化大肠杆菌，获得重组表达质粒pHIL-D2-GH（pD2-GH），酶切线性化，用电脉冲法转化组氨酸缺陷型（HIS4~-）毕赤酵母菌GS115，用MD培养基筛选转化子，MM培养基筛选转化子的表型，提取转化子基因组DNA，用PCR鉴定重组菌株。在MGY培养基中培养，甲醇诱导，收集菌体，破碎细胞，取上清，SDS-PAGE分析，检测到与标准cGH对应的特异蛋白带，重组cGH在细胞总蛋白中的含量约为2-3％。Westernblotting显示，表达产物有免疫活性。将重组工程菌作为饲料添加剂投喂罗非鱼，实验鱼的体重生长率明显高于对照组，证明重组cGH能促罗非鱼的生长。2 cGH在毕赤酵母中的分泌表达 将cGH成熟肽cDNA克隆到分泌表达载体pPICZa A，构建重组表达质粒pPICZaA-GH，转化毕赤酵母GS115菌株，YPDZ培养基筛选重组子，经培养和诱导表达，取培养基上清进行SDS-PAGE分析，结果表明，cGH分泌至培养基中。诱导3天时cGH表达量最高，表达的cGH占培养基上清总蛋白的36.41％，表达量为300-400mg/L。不同pH值实验表明，cGH表达的最适pH值为6.0。表达产物用阴离子交换层析分离纯化，纯化的cGH注射罗非鱼，实验初步显示分泌表达的cGH具有促进罗非鱼生长作用。
吴刚, 陈丽华, 钟山, 李琦, 宋朝君[2]2008年在《鲤鱼(Cyprinus carpio)血清生长激素变化的酶联免疫吸附测定》文中研究指明本研究的目标是纯化鲤鱼(Cyprinus carpio)生长激素,用于制备抗鲤鱼生长激素的单克隆抗体,建立鲤鱼生长激素的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)技术,并用所建立的技术检测不同环境下养殖的鲤鱼的血清生长激素水平的变化.利用柱纯化技术纯化酵母表达草鱼(Ctenopharyngodon idella)生长激素,免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus),获得抗草鱼生长激素多克隆抗体.摘取鲤鱼垂体,从中提取生长激素,经层析纯化后,以变性聚丙烯凝胶电泳判断其分子量和纯度,并利用抗草鱼生长激素多克隆抗体以Western blot验证.纯化并经鉴定的鲤鱼生长激素作为免疫原被用于B淋巴细胞杂交瘤技术.共建立14株能够稳定分泌抗鲤鱼生长激素单克隆抗体的杂交瘤细胞系(FMU-cGH1~FMU-cGH14),其中8个克隆(FMU-cGH1~FMU-cGH6,FMU-cGH12和FMU-cGH13)成功用于Western blot分析,9个克隆(FMU-cGH1~FMU-cGH7,FMU-cGH9和FMU-cGH10)可用于荧光标记和免疫组织化学分析.利用竞争性ELISA进行表位分析,结果表明这些单克隆抗体能够识别5个不同的表位.利用其中的FMU-cGH12作为包被抗体,FMU-cGH6作酶标抗体,建立了能够检测鲤鱼生长激素含量的ELISA技术.这一检测系统被证明具有高度的稳定性和灵敏度,能够检测并定量低至70pg/mL的生长激素.利用这一检测技术,发现限制进食和网箱养殖的鲤鱼其生长激素含量都有明显提高,分别为对照的6.9和5.8倍,显示不同生长环境下鲤鱼生长激素水平具有不同的反应.
钟山, 罗大极, 汪亚平, 陈竹, 管波[3]2009年在《饥饿状态下转基因鲤鱼和对照鲤鱼血清生长激素的表达研究》文中研究指明研究采用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)技术,比较分析了转GH基因鲤鱼和对照鲤鱼在饥饿和饱食状态下血清生长激素水平的变化规律,并探讨其可能机制。实验结果表明,在投喂实验中,转基因鲤鱼和对照鲤鱼血清生长激素水平均无明显变化,但转基因鲤鱼血清生长激素远高于对照鲤鱼,分别为(142.0±4.9)ng/mL和(1.6±0.2)ng/mL,转基因鲤鱼体重增长速率显着高于对照鱼。在饥饿实验中,转基因鲤鱼的血清生长激素迅速下降,从(142.0±4.9)ng/mL降至(46.0±3.2)ng/mL,而后稳定在这一较低水平;对照鲤鱼血清生长激素持续上升,从(1.6±0.2)ng/mL升至(10.9±1.4)ng/mL,体重负增长速率没有显着差异。研究结果提示,转GH基因鲤鱼血清生长激素的调控机制与对照鲤鱼的不同,其表达水平不受脑垂体反馈抑制调控机制的影响,而与重组GH基因中β-actin基因启动子的调控模式相关。
李文笙, 林浩然[4]2000年在《性类固醇激素对鲤鱼脑垂体生长激素基因表达的影响》文中提出建立核糖核酸酶保护法 ,检测性类固醇激素对鲤鱼脑垂体生长激素基因表达水平的影响。根据已知的鲤鱼生长激素cDNA设计PCR引物 ,亚克隆构建新的含鲤鱼生长激素cDNA片段的质粒 ,并以此作为模板 ,体外转录合成鲤鱼生长激素的反义RNA探针 ,用以检测鲤鱼脑垂体中的生长激素mRNA水平。处于性腺成熟早期的雌性鲤鱼埋植雌二醇 5天或 10天后 ,血液中生长激素水平均显着高于对照组 ,但其脑垂体的生长激素mRNA水平均没有显着变化 ;埋植睾酮 5天或 10天 ,血液中生长激素水平与对照组之间无显着性差异 ,生长激素mRNA水平也没有显着性变化。但埋植雌二醇 5天后显着增强了促性腺激素释放激素类似物对血液生长激素水平升高和促进生长激素mRNA合成的刺激作用。这表明 :性类固醇激素不能在转录水平上对生长激素基因表达进行调控 ,但能够加强促性腺激素释放激素类似物在刺激生长激素分泌及调控其基因转录水平方面的作用
廖杰[5]2012年在《红鳍笛鲷GH、IGFⅠ基因的克隆和GH真核表达》文中进行了进一步梳理生长激素(Growth Hormone, GH)是由脊椎动物下丘脑分泌的单链多肽激素，鱼类生长激素参与鱼体的生长、发育和代谢等；胰岛素样生长因子（Insulin-like growthfactorⅠ, IGFⅠ）是一类多功能细胞增殖调控因子，由胰腺分泌合成，在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。这两种因子鱼类体内天然含量极低，分离纯化比较困难，基因工程技术为生产大量廉价的鱼生长激素创造了条件。重组鱼类生长激素具有天然生长激素同样的功能，在养殖方面，多种鱼类生长激素制剂及饲料得到应用，因此，生产基因重组鱼生长激素在鱼类养殖方面具有重要的经济价值。本论文成功获得了红鳍笛鲷生长激素基因以及胰岛素样生长因子基因的全序列，实现了红鳍笛鲷生长激素(Lutjanus erythopterus GH)在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的分泌表达，通过重组生长激素毕赤酵母投喂罗非鱼验证了重组生长激素的促鱼类生长作用。（1）红鳍笛鲷GH基因和IGFⅠ基因的获得在Gen Bank中下载相近种GH和IGFⅠ基因序列，在保守区设计两种基因的合适引物，PCR扩增后分别克隆测序获得GH和IGFⅠ部分序列，得到GH编码区序列467bp，IGF编码区部分序列506bp，采用特定接头，将模板3’和5’分别延长，将接头引物和所设计的引物配对进行槽式PCR扩增、克隆纯化最后测序得到它们的3’RACE和5’ RACE序列。用Congtig Express进行拼接后得到这两个基因全序列，最后在线分析其基因组成。GH基因全长787bp，其中5’端非编码区长19bp，编码区长615bp，3’非编码区长153bp，提交至Gen Bank登录号为：JQ346228；IGFⅠ基因全长1132bp，其中5’端非编码区长134bp，编码区长558bp，3’非编码区长460bp，提交至Gen Bank登录号为：JN383435。（2）红鳍笛鲷GH在毕赤酵母中的表达及重组毕赤酵母促生长作用将红鳍笛鲷GH编码区cDNA克隆到分泌表达载体，构建重组表达质粒pPICZα-GH，转化毕赤酵母GS115菌株，YPDZ培养基筛选，PCR验证重组子，经培养和诱导表达，取培养基上清进行SDS-PAGE分析，结果表明，GH分泌至培养物中。诱导较佳条件为：甲醇浓度为0.5%，温度为30℃，pH值为6.0。用含有表达产物的未纯化培养物拌料连续投喂罗非鱼，25天的初步实验表明重组生长激素毕赤酵母混合培养物具有明显地促进罗非鱼生长的作用。
赵晓祥, 张淑梅, 杨学成, 李晶, 李荣萍[6]1995年在《鲤鱼生长激素基因的改造及其在大肠杆菌中的表达》文中认为用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）改造了鲤鱼生长激素基因，扩增出编码鲤鱼生长激素成熟肽的序列，并将此序列克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ质粒中，序列分析后，亚克隆到大肠杆菌表达载体ＰＢＶ（２２０）中。经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和薄层扫描，结果表明鲤鱼生长激素基因已在大肠杆菌中获得表达。鲤鱼生长激素成熟肽的分子量为２２０００道尔顿，表达率占细胞总蛋白的１８％以上。
赵晓祥, 张淑梅, 李晶, 李荣萍, 杨志兴[7]1996年在《鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测》文中认为鲫鱼群体内，个体之间的生长速度差别不大，遗传保守性较强，用常规育种方法很难获得生长速度快、个体差异较大的后代。通过基因转移技术，将外源基因如鱼的生长激素基因导入鱼的受精卵中，而获得转基因鱼是鱼类定向育种的一条有效途径。已有报道，在虹蹲鱼生长激素ｃＤＮＡ上游连结一个病毒启动子构建成表达质粒，由此获得的转基因鲤鱼比对照生长速度快２０％。但是未见有将鲤鱼生长激素基因导入鲫鱼受精卵的报导。我们克隆了鲤鱼生长激素基因，并用它构建了含有病毒启动子（Ｆｉｇ．１，插入片段为０．８Ｋｂ，位于ＸｂａＩ和ＰｓｔＩ之间）的表达质粒（Ｆｉｇ．２，命名为ｐＣＭＶ－ＴＫ－ＣＧＨ）。用该质粒对鲫鱼受精卵进行注射，共注射了１０００粒卵，获得了转基因实验鲫鱼４８０尾，孵化率为４８％。将其中１００尾幼鱼于水簇箱中进行放养。选择其中个体较大的５０尾进行ＰＣＲ（检测。其中８条鱼的基因组ＤＮＡ有０．６Ｋｂ的ＰＣＲ扩增产物（Ｆｉｇ．３），表明其上整合有外源的鲤鱼生长激素基因，其整合率为１６％。其中最大的一条体重４．２ｇ，体长６ｃｍ，比对照（０．７ｇ，４ｃｍ）体重增加５倍，体长增加２ｃｍ（Ｆｉｇ．４）。我们构建的是高效表达质粒，其上含有巨细胞病毒增强子和?
赵晓祥, 李晶, 李荣萍, 张淑梅, 杨志兴[8]1996年在《鲤鱼生长激素基因的PCR扩增、克隆及其序列比较》文中进行了进一步梳理从鲤鱼(Cyprinus carpio)脑垂体中分离其总RNA,经反转录成为第一条链cDNA。以第一条链cDNA为模板,以合成的两段29个寡聚核苷酸为引物,再经过PCR扩增,合成了鲤鱼的生长激素基因,并把其克隆到大肠杆菌表达载体(p~(Blue-scriptⅡ KS+/-))上。序列分析和限制酶切图谱表明所克隆的鲤鱼生长激素基因的开放读框含有630bp,编码210个氨基酸,其中含有22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟GH序列。我们所克隆的鲤鱼GH基因与Koren发表的鲤鱼GHcDNA的序列在编码区完全一致,但是与Chao发表的鲤鱼GHcDNA比较,在编码区核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95.6％和96.7％。
赵晓祥, 杨学成, 李晶, 李莹, 张淑梅[9]1995年在《鲤鱼（Cyprinus carpio）生长激素基因的亚克隆及其序列分析》文中认为本文对ＰＣＲ扩增的６６８ｂｐ的ＤＮＡ片段进行了亚克隆，，然后以Ｓａｎｇｅｒ双脱氧中止法为原理，利用美国ＡＢＩ公司３７０Ａ自动核酸序列分析仪，确定了６６８ｈＰ的核苷酸序列。序列分析表明鲤鱼生长激素基因的开放读框含有６３０ｂｐ，并推测其中包括２２个氨基酸的信号肽和１８８个氨基酸的成熟多肽。鲤鱼生长激素基因的酶切图谱和序列分析的结果都证明我们已获得了全长的鲤鱼生长激素基因。
裴淑丽[10]2008年在《淇河鲫生长激素全长cDNA的克隆、序列分析及真核表达》文中提出在我国淡水养殖已有2000多年的历史,淡水养殖在我们的生活中占有很重要的地位。淇河鲫是产于河南省淇河的自然叁倍体雌核发育鲫鱼,以生长快、味道美和效益高等优点而久负盛名,具有良好的开发前景。为了提高其生长速度,缩短养殖周期,为市场提供优质产品,促进淇河鲫养殖业的健康持续发展,目前急需研制安全高效的新型鱼用生长促进剂来促进生长和保证食品安全。鱼类生长激素是由脑垂体分泌的多肽类激素,参与鱼类的生长、发育、代谢、食欲和渗透压的调节,广泛应用于鱼类内分泌学、摄食和食物转化效率、生长等的研究。但是由于天然生长激素难以大量获得,限制了其功能和应用研究。另一方面外源生长激素在鱼体内分解消失快,不会在鱼体中积累,这一结果提示,重组生长激素蛋白的应用可能以本原动物来源的为好。本试验进行了淇河鲫生长激素基因cDNA的克隆与序列分析,推导出蛋白质序列并与其他鱼类的生长激素进行了同源性比较和进化系统分析,为从分子水平上了解淇河鲫生长规律打下基础。在真核表达实验中,根据已取得的淇河鲫生长激素的序列全长,在开放性阅读框架两端设计特异引物,用RT-PCR扩增,得到大小为633bp的一个产物,进行测序验证,完全在前测定序列的开放性阅读框架内。将构建好的载体转入大肠杆菌DH5a中进行克隆,用PCR初步筛选出重组子,以EcoRI,SnaBI双酶切做进一步鉴定后,将重组子命名为PPIC9K—GH,并进行序列测定为下一步实验提供重组子。重组质粒经线性化等处理,电击转化导入毕赤酵母GS115中,经MD、G418筛选得到高抗性的阳性菌,抽提酵母基因组进行PCR确定重组载体已经整合到酵母中,并对整合到酵母中的阳性菌进行测序和序列分析。将阳性菌株接种于培养基中,用甲醇进行诱导表达,SDS-Page凝胶电泳,对阳性菌表达的蛋白进行比对分析,在22kDa处有明显条带,说明生长激素在毕赤酵母GS115中获得了分泌表达。
参考文献：
[1]. 鲤鱼生长激素 cDNA在毕赤酵母中的胞内表达和分泌表达[D]. 李英华. 暨南大学. 2001
[2]. 鲤鱼(Cyprinus carpio)血清生长激素变化的酶联免疫吸附测定[J]. 吴刚, 陈丽华, 钟山, 李琦, 宋朝君. 中国科学(C辑:生命科学). 2008
[3]. 饥饿状态下转基因鲤鱼和对照鲤鱼血清生长激素的表达研究[J]. 钟山, 罗大极, 汪亚平, 陈竹, 管波. 水生生物学报. 2009
[4]. 性类固醇激素对鲤鱼脑垂体生长激素基因表达的影响[J]. 李文笙, 林浩然. 动物学报. 2000
[5]. 红鳍笛鲷GH、IGFⅠ基因的克隆和GH真核表达[D]. 廖杰. 广东海洋大学. 2012
[6]. 鲤鱼生长激素基因的改造及其在大肠杆菌中的表达[J]. 赵晓祥, 张淑梅, 杨学成, 李晶, 李荣萍. 生物技术. 1995
[7]. 鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测[J]. 赵晓祥, 张淑梅, 李晶, 李荣萍, 杨志兴. Developmental & Reproductive Biology. 1996
[8]. 鲤鱼生长激素基因的PCR扩增、克隆及其序列比较[J]. 赵晓祥, 李晶, 李荣萍, 张淑梅, 杨志兴. 生物工程学报. 1996
[9]. 鲤鱼（Cyprinus carpio）生长激素基因的亚克隆及其序列分析[J]. 赵晓祥, 杨学成, 李晶, 李莹, 张淑梅. 生物技术. 1995
[10]. 淇河鲫生长激素全长cDNA的克隆、序列分析及真核表达[D]. 裴淑丽. 河南农业大学. 2008