广东医科大学湛江科研中心，东莞523808
摘要：目的 KLF10在肥大心肌细胞中的表达和分布。 方法 将培养的原代心肌细胞随机分为空白对照组（Con组），血管紧张素模型组（AngⅡ 组），通过Rt-PCR、western-blot等方法观察KLF10在肥大心肌细胞中的表达和分布。结果 KLF10在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中表达下调，并且呈时间和剂量依赖性。
1.2.1 心肌细胞模型的建立
取1~3天的新生SD大鼠，在超净台内用75%乙醇擦拭胸部及腹部皮肤后，开胸取出心脏并放入盛有预冷PBS的无菌平皿中；用小镊子仔细剔除心脏上的结缔组织及血块，轻轻挤压心脏，使残血流出；把心脏剪成约1 mm3的碎块，将心肌组织转移到含有磁性搅拌子的锥形瓶中，加入15 ml含0.08%的胰蛋白酶。冰上静置20 min进行冷消化，每隔5 min摇一次锥形瓶，使胰酶均匀浸入心肌组织中；冷消化结束后将锥形瓶至于磁力搅拌器上，水浴搅拌，37℃，5 min后将细胞上清液转移至3-4 ml含10%新生牛血清的DMEM培养基中。1200 rpm离心5 min，倒掉上清，加入2 ml含10%新生牛血清的DMEM培甲醛固定15min；加入0.1%曲拉通室温避光孵育30 min；PBS洗3次， 5 min/次。每孔加入100 μl配好的0.5 % rhodamine-phalloidin，避光孵育30 min；再加入DAPI染液，室温避光孵育10 min，激光共聚焦显微镜进行观察，随机选取5次实验的7个视野，每个视野包含心肌细胞约5～10个，测量100～120个细胞表面积，计算细胞表面积。
1.2.3 RT-PCR法检测细胞肥大相关基因ANF、BNP的mRNA表达
Trizol试剂提取细胞总RNA，参照Takara公司RT-PCR试剂盒说明书，用逆转录试剂（Fermentas）将提取的RNA配置20µl 反应液，，将反应液置于PCR仪中进行DNA去除和逆转录反应。ANF、BNP的引物均由英潍捷基贸易有限公司代为合成，反应体系和条件如下：
2 结果
2.1 AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中KLF10的mRNA表达
原代培养的新生SD大鼠心肌细胞在无血清培养24 h 后，分别加入10nM、100nM 及1000 nM 的AngⅡ培养24 h，提取细胞总RNA，用荧光定量PCR 检测KLF10的mRNA 表达的量效关系。如图3A所示，在AngⅡ的刺激下， KLF10的mRNA表达下调。接着，我们观察了100 nM 的AngⅡ刺激下KLF10的mRNA表达的时效关系，如图3B 所示，在100 nM 的AngⅡ刺激下，心肌细胞中KLF10的mRNA表达下调，提示AngⅡ能够时间和剂量依赖性地诱导KLF10的mRNA表达下调。
2.2 AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中KLF10的蛋白表达
原代培养的新生SD大鼠心肌细胞在无血清培养24 h 后， 分别加入10 nM、100 nM 及1000 nM 的AngⅡ培养24 h， 提取细胞总蛋白，采用Western blot 检测KLF10的蛋白表达的量效关系。如图4A所示，在AngⅡ的刺激下，KLF10的蛋白表达下调。接着，我们观察了100 nM 的AngⅡ刺激下KLF10的蛋白表达的时效关系，如图4B 所示，在100 nM 的AngⅡ刺激下，心肌细胞中KLF10的蛋白表达下调，提示AngⅡ能够时间和剂量依赖性地诱导KLF10的蛋白表达下调。
3． 讨论
近年来，KLFs家族成员在心血管疾病中的研究引起人们的广泛关注。在心肌肥大的发生发展过程中，KLFs家族成员也起着重要的作用。KLF10是KLFs家族成员之一，目前研究认为其主要的生物学功能是抑制细胞增殖、诱导凋亡。研究发现过表达KLF10能抑制CHO 细胞、人成骨细胞hFOB增殖，并且，在肺上皮细胞 Mv1Lu及胰腺上皮细胞PANC1中，KLF10过表达能够诱导细胞凋亡；同时还发现KLF10的异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。尽管对KLF10的生物学功能研究取得显著进步，但KLF10在心血管疾病中的作用机制尚不明确。为了充分的了解KLF10在心肌肥大中的作用，我们观察KLF10在细胞中的表达和分布。结果发现KLF10在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中表达下调，并且呈时间和剂量依赖性。我们的研究将进一步揭示心肌肥大的发生机制，为其有效防治提供新理论和药物新靶点。
参考文献
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论文作者:李琴
论文发表刊物:《医师在线（学术版）》2019年第09期
论文发表时间:2019/7/15
标签：心肌论文; 细胞论文; 诱导论文; 蛋白论文; 血清论文; 依赖性论文; 剂量论文; 《医师在线（学术版）》2019年第09期论文;