一、重组绵羊白细胞介素2基因的分泌性表达及表达产物的提取（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中进行了进一步梳理近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
姜棋文[2]（2021）在《梅花鹿IL-2基因与TNF-α基因的克隆、真核表达及其免疫原性研究》文中进行了进一步梳理结核病是由结核分枝杆菌感染引起的人畜共患传染病,已成为影响梅花鹿产业发展的一大隐患。目前针对梅花鹿传染病多采用疫苗接种和抗生素注射等方法治疗,随着抗生素耐药性增加和传染性病原体的变异,采用传统疫苗和抗生素控制传染病面临越来越严峻的挑战。细胞因子是一类能在细胞间传递信息,具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。研究表明细胞因子作为新型免疫佐剂,不仅能避免常规佐剂的不良反应,而且能增强疫苗的免疫效果,提高抗体整齐度,延长抗体持续时间。其良好的免疫增强作用,在某些猪、鸡疫病疫苗的研究中得到证实,将细胞因子作为梅花鹿免疫佐剂的研究较少,因此本试验开展了梅花鹿IL-2基因与TNF-α基因的克隆、真核表达及免疫原性研究,为梅花鹿细胞因子相关免疫佐剂开发提供理论依据。研究结果如下:1、梅花鹿白细胞介素（Interleukin2,IL-2）与肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF-α）的克隆根据NCBI中马鹿的IL-2基因（U14682.1）与TNF-α基因（U14683.1）序列设计引物,以梅花鹿外周血m RNA为模板,进行RT-PCR扩增,将其连接至p MD18T载体中,测序,并进行生物信息学分析。IL-2序列分析结果表明,梅花鹿IL-2基因由489 bp组成,编码163个氨基酸,梅花鹿IL-2基因与马鹿IL-2基因核苷酸序列比较存在4个突变;系统进化树分析表明,梅花鹿与马鹿、白尾鹿等物种遗传距离较近为一组;氨基酸序列同源性分析表明,梅花鹿与马鹿、林麝、非洲水牛等物种同源性较近,在82.1%-80.6%,IL-2蛋白分子质量为40.19 k D,等电位点（PI）为10.86,通过亲/疏水性与跨膜结构对蛋白进行分析,发现梅花鹿IL-2属于亲水性外在膜蛋白。TNF-α序列分析结果表明,梅花鹿TNF-α基因由690 bp组成,编码230个氨基酸,梅花鹿TNF-α基因与马鹿TNF-α基因比较存在3个核苷酸差异。系统进化树分析表明,梅花鹿与马鹿的亲缘关系最近,二者与水牛、白尾鹿具有较高的同源性。氨基酸同源性分析表明,梅花鹿与马鹿、白尾鹿同源性相近达到98.9%、98.3%,梅花鹿TNF-α蛋白分子质量为57.97 k D,等电位点（PI）为5.81,通过亲/疏水性与跨膜结构对蛋白进行分析,发现梅花鹿TNF-α属于疏水性跨膜蛋白。2、真核表达载体pc DNA3.1/V5His A-IL-2和pc DNA3.1/V5His A-TNF-α的构建与表达将测序正确的扩增产物连接至真核表达载体pc DNA3.1/V5His A中,并进行酶切鉴定和测序分析,将鉴定正确的质粒命名pc DNA3.1/V5His A-IL-2和pc DNA3.1/V5His A-TNF-α。将构建的重组质粒经脂质体介导转染Vero细胞,转染48 h后,在激光共聚焦显微镜下观察IL-2基因和TNF-α基因的表达情况。采用SDS-PAGE、Western blot方法对表达的IL-2和TNF-α蛋白进行验证。结果表明,在分别转染pc DNA3.1/V5His A-IL-2和p DNA3.1-/V5His A-TNF-α48 h后,均能在Vero细胞中检测到荧光;SDS-PAGE结果显示,与对照组相比,分别发现40 k D与55 k D蛋白,与预期蛋白大小相符;Western Blot结果表明,IL-2与TNF-α蛋白在24 h开始表达,随着时间增加表达量逐渐升高。3、梅花鹿IL-2,TNF-α基因表达对耻垢分枝杆菌mc2155侵染Vero细胞的影响将pc DNA3.1/V5His A-IL-2和pc DNA3.1/V5His A-TNF-α质粒转染到Vero细胞后感染耻垢分枝杆菌mc2155菌液,通过ELISA法检测IL-2质粒的转染使Vero细胞抗炎细胞因子IL-2表达量升高,增加细胞活力,抑制Vero细胞凋亡。转染TNF-α质粒的转染使细胞中促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α）表达量增加,同时招募Vero细胞固有免疫因子IL-2释放,能够抑制感染mc2155后Vero细胞的生长,提高未感染细胞存活率,增加感染mc2155细胞的凋亡率。通过CCK-8法检测发现,与mc2155侵染Vero细胞模型组相比,转染质粒IL-2 Vero细胞侵染mc2155菌12 h后,细胞存活率明显上升;转染质粒TNF-αVero细胞侵染mc2155菌细胞活力显着下降。应用流式细胞术检测发现,转染IL-2质粒的Vero细胞被mc2155感染后低于mc2155感染Vero组2.47%,但转染TNF-α质粒组接菌后,凋亡率高出模型组12.94%。荧光定量PCR结果表明,IL-2基因的表达产物能有效抑制各凋亡基因的分泌,改善Vero细胞的凋亡。TNF-α基因的表达产物能促进感染mc2155菌细胞凋亡基因的分泌,激活死亡受体和死亡线粒体通路,加速感染细胞凋亡。综上所述,本实验通过对梅花鹿IL-2基因和TNF-α基因的克隆、真核表达及其表达产物免疫原性的研究,为制备梅花鹿特异性免疫增强剂奠定基础。利用梅花鹿TNF-α基因对耻垢分枝杆菌mc2155感染细胞的细胞毒力作用,为治疗已感染结核梅花鹿减少病灶提供新思路。
王一鸣[3]（2019）在《丁香酚抑制猪源肺炎克雷伯菌AI-2信号分子和MrkD蛋白机制研究》文中指出肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae）是继大肠杆菌后第二大条件致病菌,作为一种人兽共患病原菌,该菌广泛分布于土壤、皮肤、呼吸消化道和泌尿生殖道中,并可引起人和动物肺炎、腹膜炎、创伤性感染、败血症等疾病。近年来,临床多重耐药和高毒力肺炎克雷伯菌不断出现,严重威胁人和动物的健康,为此寻找新型抗感染药物和抗感染策略已迫在眉睫。肺炎克雷伯菌的致病性依赖于毒力因子,包括荚膜多糖、脂多糖、黏附蛋白和铁载体等。其中,荚膜多糖和脂多糖是细菌生物膜的主要成分。Ш型菌毛主要介导细菌对内皮细胞和上皮细胞的黏附,而对宿主细胞的黏附是肺炎克雷伯菌入侵机体并引发感染的首要条件。细菌群体感应（Quorum sensing,QS）系统能调控生物发光、生物膜形成、毒力基因表达、细胞分化等多种生理功能。LuxS/AI-2型QS系统广泛存在于G+和G-中,同时具有种内信号和种间信号双重功能,作用范围更广。丁香酚（Eugenol）是丁香、樟脑、肉桂等植物挥发油的主要成分,具有抑菌、防腐、抗炎、抗氧化、镇痛麻醉等多种药理作用。随着对天然化合物研究的不断深入,研究人员发现亚抑菌浓度的丁香酚还具有QS系统抑制活性,为预防和治疗细菌感染提供了新的思路。本研究从临床发病猪鼻拭子中分离了2株肺炎克雷伯菌,通过形态观察、培养特性、生化试验、分子生物学鉴定、药敏试验、小鼠致病性等试验,鉴定这2个分离株均为多重耐药肺炎克雷伯菌,并分别命名为KP1株和KP2株。其中,KP1株对小鼠的致病性略强于KP2株,二株菌的LD50分别为5×108cfu/mL,1×109cfu/mL;通过刚果红平板、结晶紫染色、拉丝试验、主要毒力基因PCR方法等对KP1株和KP2株的毒力表型进一步鉴定,结果显示,KP1株和KP2株都能在刚果红平板上长出黑色菌落,结晶紫染色表明二者能够形成生物膜,KP2株生物膜形成能力强于KP1株。KP1株和KP2株均不具有高黏表型,且rmpA基因呈阴性,排除高毒力菌株的可能。荚膜血清型鉴定结果显示,KP1株属于K2荚膜血清型。为了进一步研究亚抑菌浓度的丁香酚对肺炎克雷伯菌AI-2信号分子和菌毛黏附素MrkD蛋白的影响,本研究采用微量二倍稀释法测定了丁香酚对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。结果显示,丁香酚对KP1株和KP2株的MIC和MBC相同,均为2μg/mL,最小抑膜浓度（MBIC）为1μg/mL,表明其具有良好的抑菌活性。采用1/4MIC丁香酚与KP1株共培养后感染小鼠,结果发现,亚抑菌浓度的丁香酚能够延长肺炎克雷伯菌感染小鼠的中位存活时间。但心血菌落计数结果和病理切片观察显示,丁香酚处理组相比对照组缓解小鼠感染的差异不显着。此外,本试验采用原核转录组测序技术研究亚抑菌浓度丁香酚对AI-2合成主要调节基因luxS、pfs（mtnn）、lsrR、lsrK和菌毛黏附素mrkD基因在转录水平的影响,并通过实时荧光定量方法对转录组测序结果进行验证,结果显示亚抑菌浓度丁香酚处理组luxS、lsrR和mrkD基因的FPKM值低于对照组,pfs和lsrK基因的FPKM值高于对照组。qPCR验证结果显示,亚抑菌浓度丁香酚可使luxS和mrkD基因表达下调,使pfs（mtnn）、lsrR、lsrK基因表达上调,lsrR、lsrK基因表达量均显着高于对照组。lsrR基因验证结果与转录组测序结果存在差异,结合其FPKM值高于lsrK基因且log2（FC）值较高,推测尽管丁香酚使lsrR和lsrK基因表达均上调,但lsrR基因表达量更高,总体表现为转录抑制,从而抑制AI-2转运。为了证明LuxS/AI-2型QS系统对肺炎克雷伯菌KP1株生长特性、生物膜、以及毒力的影响,本实验成功构建了pRE112-luxS上下游同源臂重组自杀质粒,采用同源重组方法构建了KP1ΔluxS基因缺失株。结果显示,KP1ΔluxS株与野生株相比生长速度无明显变化,但生物膜形成能力和毒力均减弱,表明luxS基因能调控细菌的生物膜和毒力。为了研究亚抑菌浓度丁香酚对LuxS、Pfs和MrkD蛋白的体外抑制活性,本研究分别扩增这3个蛋白的编码基因,经测序酶切鉴定正确后与原核表达载体pET-28a（+）进行连接构建重组原核表达质粒。利用IPTG诱导表达,亲和层析Ni+柱纯化表达产物,SDS-PAGE电泳Western-blot对表达产物进行分析。结果显示,分别获得了大小约为24kDa的LuxS、30kDa的Pfs和35kDa的MrkD。Western-blot结果表明,亚抑菌浓度丁香酚能够促进LuxS蛋白表达、抑制Pfs蛋白表达,1/8MIC和1/4MIC抑制MrkD的表达。AI-2体外合成试验结果表明丁香酚能够抑制AI-2分子的合成且呈浓度依赖。分子对接预测发现,丁香酚与LuxS、Pfs蛋白对接较好,通过分子间作用力改变其构象,但与MrkD叠合不理想。上皮细胞黏附和黏附抑制试验结果显示,MrkD蛋白能够浓度依赖地促进肺炎克雷伯菌对MDBK细胞的黏附,而丁香酚能够抑制肺炎克雷伯菌的黏附作用,该抑制作用同样随丁香酚浓度的升高而增强。
李向茸,王兴陇,令瑛,徐雷,李琼毅,张海霞,包晓婧,冯若飞[4]（2017）在《重组人白细胞介素7在HEK293细胞中稳定分泌表达》文中研究指明通过构建人白细胞介素7的重组真核表达载体,转染HEK293细胞,实现IL-7在HEK293细胞中的稳定分泌表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。从质粒p LV-CMV-EF1-GP-r IL-7中扩增人IL-7全长基因,并将其构建于pc DNA3.1真核表达载体上。利用脂质体法将重组质粒转染HEK293细胞,经G418筛选及单克隆,获得稳定分泌表达IL-7的HEK293-r IL-7细胞系。成功构建真核表达质粒pc DNA3.1-r IL-7,并实现IL-7在HEK293细胞上的稳定分泌表达,最终获得了1株表达量较高的细胞株,命名为HEK293-IL7-2G3细胞,培养48 h的细胞上清中IL-7的含量为3.2 ng/m L。为进一步实现人白细胞介素7在哺乳动物细胞中的分泌表达及药物开发奠定基础。
杨兴武[5]（2017）在《猪PBD-1基因的扩增、克隆及成熟肽基因的原核表达》文中指出防御素（defensins）是机体抵御病原微生物时机体免疫防御过程中合成并分泌的一类重要的抗菌肽。它具有十分广泛的抗菌谱,对细菌、真菌、披膜病毒等多种病原都具有杀伤作用,对支原体、衣原体以及一些恶性细胞具有一定的抑制杀伤作用。其独特的杀菌机制,难以诱发细菌的耐药性,成为有巨大发展潜力的新型抗菌药物。猪β防御素-1（porcineβ-defensin-1,PBD-1）广泛存在于猪消化系统、呼吸系统和免疫系统等多个系统器官组织,在猪只固有免疫中具有重要作用。干酪乳酸杆菌（Lb.casei）广泛存在于人和动物肠道内,具有天然的抑菌作用,是一种公认的有益微生物。乳酸杆菌是至今发现的极少没有致病性的菌种,经过筛选的菌株能够抵抗胃酸和胆盐,所以Lb.casei可以通过口服的方式进入人和动物的肠道并大量定植进而达到大量运输异源蛋白的目的。而大肠杆菌作为首个重组蛋白表达宿主菌,其遗传背景清晰,易于控制表达、生产周期短等特性,成为外源基因表达的首选宿主。大肠杆菌Rosetta（DE3）含有6种稀有密码子对应的tRNA,可以避免密码子使用频率高而导致转录限制,可以提高外源真核基因的翻译水平。试验首先通过反转录-聚合酶链试反应（Reverse Transcription PCR,RT-PCR）方法从猪舌总RNA中扩增得到PBD-1的全基因（PBD1Q）,插入克隆载体pMD18-T。经酶切鉴定及序列测定,证实成功构建克隆载体pMD18T-PBD1Q。为构建干酪乳酸杆菌整合型表达载体,首先先人工合成150 bp的短小乳酸杆菌信号肽（SP）序列,构建出pUCK-SP载体。再从pMD18T-PBD1Q质粒上扩增出168bp的包含His-tag序列的猪PBD-1成熟肽基因的序列PBD1His,插入SP下游,构建pUCK-SP-PBD1His质粒。质粒经酶切回收SP-PBD1His片段,然后插入pMJ67载体。经序列测定证明成功构建出整合型表达质粒pMJ67-SP-PBD1His。利用电转化方法,将重组整合型质粒转进干酪乳酸菌,经鉴定,证实重组猪PBD1His基因的Lb.casei构建成功。经半定量RT-PCR和Western blot分析,证实猪PBD1His基因在重组Lb.casei菌体内获得了表达。而在构建大肠杆菌复制型表达载体时,在pET28a质粒的Nde I和BamH I之间插入SUMO蛋白标签,替代其原有的T7标签。通过PCR方法从pMD18-PBD1Q质粒上扩增出129 bp猪PBD-1成熟肽基因序列PBD1,插入pET28a-SUMO载体Bam HⅠ和Xho I酶切位点之间,随后测序结果证实大肠杆菌复制型表达质粒pET28a-SUMO-PBD1构建完成。采用物理热冲击方法,将pET28a-SUMO-PBD1复制型表达载体导入大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞。经卡那霉素筛选及序列测定,证明重组PBD1大肠杆菌构建成功。经过SDS-PAGE和Western blot分析表明,经过IPTG诱导,猪PBD1在Rosetta（DE3）菌体内获得了表达。诱导条件经优化,重组菌菌体内表达PBD1最佳条件（诱导剂终浓度为0.6 mM,诱导时间为6 h）。
吴燕[6]（2016）在《Mo P113/Mmc LppA蛋白基因克隆表达及其免疫研究》文中认为羊支原体性肺炎（Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats,MPSG）是在羊群中普遍流行的以纤维素性肺炎和胸膜炎为主要特征的接触性传染病,其主要是由丝状支原体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp.Capri,Mmc）、绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,Mo）和山羊支原体山羊亚种（Mycoplasma capricolum subsp.Capricolum,Mcc）等支原体引起。本研究前期调查资料显示,贵州省该病病原以Mo和Mmc两种病原为主,且死亡率呈不断上升趋势,给养羊业带来严重的经济损失,且MPSG综合防控面临诸多困难。本研究应用分子克隆技术、生物信息学技术以及基因工程技术对Mo贵州分离株P113蛋白基因和Mmc贵州分离株LppA蛋白基因进行研究,以期寻找有效的防控MPSG的新型疫苗和完善的防控技术,为本病的早期检测、免疫效果评价及新型疫苗研究提供基础研究资料。1.Mo P113/Mmc LppA蛋白基因克隆及生物信息学分析:根据Gen Bank公布的Mmc LppA和Mo SC01菌株基因序列信息,设计合成特异性引物,应用PCR、分子克隆和生物信息学技术对Mo贵州分离株P113蛋白基因和Mmc贵州分离株LppA蛋白基因进行克隆测序和生物信息学分析。结果显示,Mo贵州株（GZ-QX1）P113基因全长3240bp,可编码1079个氨基酸;Mmc贵州株（GZ-DF1）LppA基因全长1572bp,可编码523个氨基酸。Mo GZ-QX1分离株P113基因序列与Mo Y98参考株同源性达99.9%,而与其他种属羊肺炎支原体间同源性低于39.4%;Mmc GZ-DF1 LppA基因与标准株PG3同源性同源性达100%,而与其他种属羊肺炎支原体间同源性低于72.8%。实验结果表明,Mo贵州分离株P113蛋白基因和Mmc贵州分离株LppA蛋白基因高度保守,不同种属支原体间差异大,不存在交叉免疫效果。生物信息学分析认为Mo P113/Mmc LppA蛋白整体抗原性较好,含有较多的优势抗原表位结构,其中Mo P113蛋白C末端抗原性优势明显,Mmc LppA蛋白N末端抗原性优势明显,可作为蛋白免疫学研究的靶标蛋白区段。2.Mo P113/Mmc LppA蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立:以Mo P113/Mmc LppA基因序列为模板,应用PCR方法扩增优势抗原表位基因片段,并克隆至表达载体p Cold I,构建重组原核表达质粒;转化表达宿主菌诱导表达目的蛋白,并建立基于目的蛋白的间接ELISA方法。结果显示,成功构建含Mo P113和Mmc LppA基因的重组原核表达质粒p ColdⅠ-P113、p ColdⅠ-LppA;转化宿主菌诱导表达,SDS-PAGE和Western-Blotting检测显示表达蛋白分子量分别为33KDa和23KDa;其中P113蛋白最佳诱导表达条件为28℃0.8 mmol/L IPTG诱导3h,LppA蛋白最佳诱导表达条件为30℃0.8 mmol/L IPTG诱导3h,且纯化蛋白具有较好的抗原反应原性。基于纯化表达蛋白建立的间接ELISA方法最佳反应条件为:Mo P113包被蛋白浓度为1.5μg/100μL,血清稀释度1:100,封闭液为1%明胶,封闭时间为1 h,临界值为2.325;Mmc LppA包被蛋白浓度为2.0μg/100μL,血清稀释度1:50,封闭液为3%BSA,封闭时间为1 h,临界值为2.738;ELISA方法性能评价显示其具有较好的特异性和重复性,可用于Mo P113/Mmc LppA蛋白特异性血清抗体的检测。3.Mo P113/Mmc LppA蛋白真核表达及免疫研究:应用PCR方法扩增Mo P113/Mmc LppA基因片段并克隆至表达载体p VAX1,构建重组真核重组质粒并转染至MDBK细胞。应用PCR技术及间接免疫荧光试验评价其体外表达效果;通过间接ELISA、MTT淋巴细胞增殖试验、组织病理学技术、流式细胞术、免疫保护试验等方法分析重组质粒诱导免疫BABL/C小鼠体液免疫应答和细胞免疫应答情况。结果显示,成功构建含Mo P113/Mmc LppA基因重组真核表达质粒p VAX1-P113、p VAX1-LppA以及p VAX1-P113-LppA,重组质粒转染MDBK细胞能有效转录m RNA并表达目的蛋白。动物免疫实验显示,重组质粒都能诱导小鼠产生特异性的血清抗体,其OD630值较对照组有大幅度上升的趋势,实验后期趋于平稳,表明重组质粒能诱导机体产生较强的体液免疫应答,其中p VAX1-P113（100μg）组和p VAX1-LppA（100μg）组OD630平均值分别最高;免疫小鼠血清细胞因子测定结果显示,重组质粒组分泌产生的IL-2、IL-4及IFN-γ细胞因子均高于对照组,表明重组质粒可诱导小鼠产生良好的细胞免疫应答反应;应用流式细胞术对试验小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞百分比进行分析,结果表明重组质粒诱导了Th1/Th2型免疫,但以Th1型免疫为主;攻毒试验显示所构建的质粒p VAX1-P113、p VAX1-LppA以及p VAX1-P113-LppA安全性好,且能提供有效的免疫保护,重组质粒组小鼠肺炎症状减轻或症状不明显。上述结果表明,Mo P113/Mmc LppA蛋白基因具有较高保守性和较好抗原性,其中Mo P113蛋白C末端抗原性优势明显,Mmc LppA蛋白N末端抗原性优势明显。通过构建p ColdⅠ-P113和p ColdⅠ-LppA重组质粒获得的目的蛋白具有较好的抗原性;基于目的蛋白建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和可重复性。构建的真核表达质粒p VAX1-P113、p VAX1-LppA以及p VAX1-P113-LppA能诱导小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答反应,且能提供有效的免疫保护作用。研究结果为Mo/Mmc所致MPSG综合防控提供新思路、新技术,为新型疫苗可行性研究提供理论基础。
李光超[7]（2016）在《牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的真核表达及免疫保护效果评价》文中进行了进一步梳理奶牛乳房炎是一种能引起乳房炎症的疾病,也是奶牛最为常见的疾病之一,它给养殖业带来巨大的经济损失,同时也给公共卫生安全带来了巨大的隐患。本研究内容和主要结果如下。1、对从奶牛乳房炎病例中分离的33株金黄色葡萄球菌进行溶血素基因型和表型检测,并对它们之间的相关性进行分析。结果表明:hla、hlb、hld、hlg、hlg-2基因的检出率分别为90.91%、100%、93.94%、78.79%、66.67%;金黄色葡萄球菌在牛血和绵羊血琼脂平板上均以β溶血为主,但牛血检测出的β溶血比例更高,溶血素基因型和表现型之间无对应关系。2、将β-溶血素基因定向插入到pcDNA3.1 HisB载体上,成功构建了重组的真核表达载体pcDNA3.1 HisB-hlb。用脂质体法将其转染入人乳腺癌细胞内,使用G418筛选出稳定转染的细胞系,用PCR、Western blot等方法检测检测重组质粒的转染情况。发现pcDNA3.1 HisB-hlb已成功转染入细胞内并正确表达β-溶血素。3、用镍柱亲和层析法对表达产物进行纯化,并测定纯化后的β-溶血素对牛和绵羊红细胞的溶血效价,SDS-PAGE电泳显示纯化产物纯度达电泳纯,并在41.8KDa呈现单一条带,对牛红细胞和绵羊红细胞的溶血比活分别为1658HU/mg和829HU/mg。4、分别将纯化的β-溶血素和pcDNA3.1 His B-hlb与福氏佐剂乳化混合,制成亚单位疫苗和DNA疫苗,通过不同的途径对小鼠进行免疫,强化免疫10天后,用ELISA法检测白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-4、免疫球蛋白G、分泌性免疫球蛋白A和γ-干扰素等的浓度,同时用金黄色葡萄球菌对小鼠攻毒,对免疫效果进行初步评价。结果表明,各实验组的免疫球蛋白G（IgG）、白细胞介素-2（IL-2）的浓度远大于对照组,差异显着;β-溶血素和和pcDNA3.1HisB-hlb对小鼠均有一定的保护能力。
刘嫒[8]（2016）在《IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究》文中指出羊口疮病毒（Orf virus,Orf V）属于痘病毒科、副痘病毒属成员,为有囊膜线性双股DNA病毒,是引起绵羊、山羊发生以口唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤、黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡以及结成疣状厚痂为主要特征的接触性、嗜上皮性、人兽共患传染病病原。羊口疮在养羊的国家和地区普遍发生,常呈群发性流行,是严重威胁养羊业、具有重要经济意义的病毒病。疫苗接种是防控病毒性疫病可靠且有效的手段,Orf常用疫苗有弱毒、灭活疫苗,但在生产实践中羊口疮弱毒苗存在散毒危险、毒力返强等缺陷,灭活苗存在灭活不彻底、产生抗体水平较低等缺陷。因此,运用基因工程技术开发Orf新型疫苗具有重要意义。Orf V诱导机体以细胞免疫为主,而IL-2是Th1型细胞因子,可作为细胞因子免疫佐剂,与核酸疫苗联用能增强其免疫效果。本研究构建了山羊IL-2基因、Orf V B2L基因和F1L基因三种真核表达质粒,将山羊IL-2基因真核表达质粒作为细胞因子佐剂与Orf V真核表达质粒联合免疫小鼠,探讨山羊IL-2细胞因子佐剂对Orf V核酸疫苗免疫效果的影响研究。主要研究内容如下:1.山羊IL-2基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达:采集健康贵州黑山羊外周血,分离培养淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,通过RT-PCR扩增、序列测定获得山羊IL-2基因序列,并对其进行生物信息学分析;以p VAX1为真核表达载体,构建山羊IL-2基因真核表达质粒,采用质粒PCR、双酶切和测序鉴定;将重组质粒转染MDBK细胞,采用RT-PCR和ELISA方法对其转录、瞬时表达进行鉴定。结果表明,贵州黑山羊IL-2基因完整编码阅读框长468 bp,编码155个氨基酸,与Gen Bank中羊源IL-2基因序列相比,核苷酸序列一致性为95.9%-100%,氨基酸序列一致性为91.1%-100%;将羊IL-2基因序列提交Gen Bank,获得登录号KT934548;生物信息学预测,该蛋白α-螺旋与β-折叠较多,有信号肽,无跨膜结构和特定功能结构域,整条肽链表现为亲水性;经质粒PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建了真核表达质粒p VAX1-IL-2;p VAX1-IL-2转染MDBK细胞48 h后的上清,RT-PCR检测到IL-2基因的m RNA转录,ELISA方法检测到MDBK细胞上清IL-2蛋白浓度约为112 pg/m L。2.羊口疮病毒B2L、F1L基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达:根据Gen Bank收录的Orf V基因序列（No.AY386264）,分别设计针对Orf V B2L、F1L基因引物,通过PCR扩增、序列测定获得B2L、F1L基因序列,并对其进行生物信息学分析;以p VAX1为真核表达载体,构建B2L、F1L基因真核表达质粒,采用质粒PCR、双酶切和测序鉴定;将重组质粒转染MDBK细胞,采用RT-PCR和IFA方法对其转录、瞬时表达进行鉴定。结果表明,Orf V-GZ株B2L基因全长1137 bp,与Gen Bank中B2L基因序列相比,其核苷酸序列一致性为97.3%-98.8%,氨基酸序列一致性为97.1%-99.7%;F1L基因全长1029 bp,,与Gen Bank中F1L基因序列相比,其核苷酸序列一致性为96.0%-99.6%,氨基酸序列一致性为95.5%-99.7%;分别将Orf V-GZ株B2L、F1L基因提交Gen Bank,获得登录号KP994595、KP057582;生物信息学分析,B2L基因编码蛋白α-螺旋和β-折叠较多,整条肽链表现为疏水性,无跨膜结构和信号肽,含2个磷脂酶D超家族保守结构域,同时还有相应的特异性结合位点;F1L基因编码蛋白α-螺旋和β-折叠较多,整条肽链表现为疏水性,含2个跨膜结构,无信号肽。经质粒PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建真核表达质粒p VAX1-B2L、p VAX1-F1L;RT-PCR方法检测转染细胞中有B2L、F1L基因m RNA转录,IFA方法检测到B2L、F1L基因在MDBK细胞中表达。3.IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果影响研究:以p VAX1-IL-2作为细胞因子佐剂,分别与p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L联合免疫小鼠,采用ELISA方法对小鼠血清中Orf V特异性抗体与Th1型（IL-2、IFN-γ、TNF-α）和Th2型（IL-4、IL-6、IL-10）细胞因子进行测定;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;FACS法检测小鼠脾淋巴细胞亚群变化。结果表明,p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L三组质粒均具有良好免疫原性,各真核质粒免疫组1周后均能诱导小鼠产生Orf V特异性抗体,第6周时抗体水平最高,第7周时抗体水平开始下降,其中以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组抗体变化趋势明显;MTT法检测结果表明三组质粒诱导的淋巴细胞增殖反应均高于p VAX1和PBS组,差异极显着（P<0.01）,加入p VAX1-IL-2佐剂组与未加入佐剂组相比,差异极显着（P<0.01）,表明p VAX1-IL-2对三组质粒诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖具有促进作用,在14周能够持续增殖;FACS结果表明p VAX1-B2L、p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-IL-2、p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组的CD3+CD4+T淋巴细胞含量较PBS组与p VAX1组高,以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组最高,且加p VAX1-IL-2细胞因子佐剂组高于未加佐剂组,CD4+T细胞含量高于CD8+T细胞含量,CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值介于1.712.94之间,表明各真核质粒免疫组均能诱导淋巴细胞亚类增殖,辅助性T细胞高于抑制性T细胞,重组质粒不会引起小鼠不良反应;细胞因子检测结果表明,Th1型细胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α）含量高于Th2型（IL-4、IL6、IL-10）,且加入p VAX1-IL-2佐剂组高于未加佐剂组,表明细胞免疫以Th1型为主。结论:本试验成功克隆了贵州黑山羊IL-2基因,Orf V-GZ株B2L基因和F1L基因,生物信息学分析表明三个基因具有良好抗原性。本实验构建了三种真核表达质粒p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L和p VAX1-F1L。p VAX1-IL-2对p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L在小鼠体内诱导的Orf V特异性体液免疫和细胞免疫具一定的促进作用,细胞免疫应答以Th1型为主。
王大伟[9]（2011）在《猪α干扰素和白细胞介素-2在真核细胞中表达及其表达产物活性分析》文中指出目的：α干扰素（interferon-a）是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫激活功能的细胞因子,白细胞介素2在抗肿瘤、免疫调节及感染性疾病的治疗中也具有重要作用,同时它还能激活B淋巴细胞,参与机体的体液免疫应答,促进抗体分泌,增强体液免疫应答。Mx蛋白是Ⅰ型和Ⅲ型干扰素（IFN）诱导细胞后产生的天然抗病毒蛋白,有很好抗病毒活性,且副作用小。本实验将猪α干扰素基因和白细胞介素2基因分别转染真核细胞,检测这两个基因的表达,及表达产物的抗病毒活性。为将这两个基因用于疫苗佐剂及转基因抗病育种动物奠定了基础。同时也克隆了猪Mxl基因启动子及Mxl基因,并构建了真核表达载体,为进一步研究猪Mxl基因奠定了基础。方法：（1）根据已发表的猪IFN-a和猪IL-2基因的核酸序列设计引物,克隆出这两个基因,鉴定正确后将两个基因分别连到pcDNA3.1载体上构建真核表达载体,分别命名为pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL;（2）用构建好的真核表达载体分别转染真核细胞通过G418筛选出转染外源基因的细胞,并用RT-PCR进一步检测是否整合外源基因；（3）采用实时定量PCR检测猪IFN-α和IL-2基因在真核细胞内mRNA表达水平、采用ELISA方法检测猪IFN-α和IL-2基因在真核细胞内蛋白表达水平、采用淋巴细胞增殖实验测猪IFN-α和IL-2基因在真核细胞内表达蛋白的生物学活性。（4）根据Genbank已公布的猪Mxl基因启动子、Mxl基因的核苷酸序列,设计合成两对特异引物分别扩增了猪Mxl基因启动子和Mxl基因,并将这两个基因亚克隆到含有G418筛选标记的PGKneotpALox2真核表达载体上结果：（1）成功克隆了猪IFN-α和猪IL-2基因,经测序鉴定正确,并将其分别连到pcDNA3.1真核表达载体上构建成功pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL转染质粒。（2）通过G418筛选出稳定表达猪IFN-α和猪IL-2基因的真核细胞,经RT-PCR鉴定为阳性。（3）实时定量PCR表明转入猪IFN-α基因的真核细胞其IFN-αmRNA表达量高于阴性未转染组1.52倍,转入猪IL-2基因的真核细胞其IL-2 mRNA表达量高于阴性未转染组1.43倍；对整合外源基因真核细胞上清液ELISA检测结果显示,猪IFN-α的含量为121.45pg/mL,而未转染该基因的对照组含量为89.36pg/mL转染组高于对照组1.35倍。猪IL-2的含量为97.45pg/mL,而未转染对照组含量为75.36 pg/mL转染组高于对照组1.29倍；经SPSS统计软件分析表明整合外源基因的真核细胞上清液淋巴细胞增殖作用与阴性对照组相比均差异显着,表明这两个基因的表达产物有很好的活性,可以用来抗病毒。（4）成功克隆了猪Mxl基因启动子和Mxl基因并将这两个基因亚克隆到PGKneotpALox2真核表达载体上。结论：猪IFN-a和猪1L-2基因可以在真核细胞中很好表达,且表达产物具有很好的活性,为开发新型基因工程疫苗佐剂和转基因抗病动物奠定了基础。同时本实验也构建了猪Mxl真核表达载体,为进一步研究Mxl基因提供了实验基础。
吴异健[10]（2010）在《两种中药多糖对呼肠孤病毒感染番鸭的免疫调节作用》文中研究指明近年来有部分中药多糖被临床应用于免疫抑制畜禽的免疫调节,但目前对传染病引起的畜禽免疫抑制和中药多糖免疫调节的机制尚未完全清楚。已有研究表明呼肠孤病毒（MDRV）感染引起雏番鸭免疫抑制。本研究通过建立番鸭呼肠孤病毒病自然感染发病模型,进行了猴头菇多糖（HPS）和黄芪多糖（）对MDRV感染导致免疫抑制雏番鸭的免疫调节试验,并分析HPS和APS对试验番鸭血清中部分细胞因子、神经递质和激素,以及脾脏组织IL-2和IL-6mRNA表达水平的影响,以探讨MDRV引起免疫抑制和HPS、APS免疫调节的机制。主要研究结果如下：1.参照GenBank已发表的相关物种的肌动蛋白（β-actin）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素6（IL-6）基因序列,设计合成三对特异性引物。从刀豆素（ConA）诱导的35日龄番鸭脾脏组织中,克隆了番鸭β-actin（Mdp-actin）、番鸭IL-2（MdIL-2）和番鸭IL-6（MdIL-6）的基因片段,并经测序验证。结果表明Mdp-actin、MdIL-2和MdIL-6的大小分别为786 bp、423 bp、322 bp,与引物设计时的目的片段大小一致。Mdβ-actin核酸序列与绿头鸭β-actin核酸序列（EF667345）的同源率为98.7%,与原鸡（L08165）的同源率为97.3%；MdIL-2核酸序列与番鸭IL-2核酸序列（AY193713）的同源率100%,与绿头鸭（AF294323）同源率为98.35%；MdIL-6核酸序列与绿头鸭IL-6核酸序列（AB191038）的同源性率99.7%。2.应用MDRV-YB4分离株以2000TCID50的病毒量人工感染雏番鸭,3天后,人工感染雏番鸭与未接种MDRV健康试验番鸭以2：5的比例,将前者加入后者中进行同居感染,能引起后者典型番鸭呼肠孤病毒病自然感染发病的发病过程、临床症状和剖检病变。为探讨HPS和APS对MDRV感染引起免疫抑制番鸭的免疫调节作用及其机制,以及进一步阐明MDRV引起感染雏番鸭免疫抑制机制建立了番鸭呼肠孤病毒病自然感染发病模型。3.利用建立的呼肠孤病毒病自然感染发病模型,以不同浓度的HPS和APS分别经饮水给药方式对MDRV感染试验雏番鸭进行预防保护试验。结果显示HPS和APS分别以0.2g/L和0.6g/L浓度自由饮水口服均对MDRV感染试验雏番鸭有较好预防保护效果。4.将2日龄试验番鸭随机分为人工感染MDRV组（AIG）、空白对照组（NCG）、同居感染对照组（CICG）、猴头菇多糖对照组（HCG）、猴头菇多糖预防组（HPG）、黄芪多糖对照组（ACG）和黄芪多糖预防组（APG）,其中CICG、HPG、APG按建立的呼肠孤病毒病自然感染发病模型用AIG进行同居感染；随机分组后,HCG和HPG试验番鸭用HPS以0.2g/L浓度自由饮水,ACG和APG试验番鸭用APS以0.6g/L浓度自由饮水,对MDRV同居感染雏番鸭和MDRV人工感染发病番鸭进行防治的效果观察。结果表明：与CICG比较,HPG和APG试验番鸭发病死亡率分别为12%和4%,显着低于CICG死亡率24%,HPG和APG试验番鸭感染MDRV发病临床症状较缓和,剖检病变轻,尤为试验后期,APG试验番鸭剖检未见明显的MDRV感染病变。5.采用放免检测方法（RIA）测定试验番鸭血清中白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素6（IL-6）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、糖皮质激素（GC）、生长激素（GH）和p-内啡肽（p-EP）的含量,试验结果表明：（1）MDRV感染抑制试验番鸭机体分泌IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、GH、ACTH,引起免疫应答即下降或停止；促进感染中后期试验番鸭机体分泌GC,导致免疫抑制；而试验番鸭血清p-EP水平波动较大,与其受应激的大小呈一定负相关联。（2）猴头菇多糖（HPS）和黄芪多糖（APS）能促进试验番鸭机体分泌IL-1、IL-2和IL-4,维持血清IL-6、ACTH、β-EP含量相对稳定；有效调节MDRV感染番鸭GC水平,并维持在正常值范围；促进MDRV感染导致GH水平低下的番鸭机体产生GH,维持健康试验番鸭血清GH水平相对稳定。试验结果也显示APS免疫调节作用优于HPS。6.采用荧光定量RT-PCR方法,以β-actin mRNA为内参基因,检测试验番鸭脾脏组织中IL-2mRNA和IL-6mRNA的相对表达水平,结果表明：（1）MDRV感染引起试验番鸭脾脏组织中IL-2 mRNA和IL-6 mRNA相对表达水平不同程度的下降,这与MDRV感染引起试验番鸭Th细胞的凋亡有关。（2）猴头菇多糖（HPS）和黄芪多糖（APS）有助于MDRV感染番鸭脾脏IL-2mRNA和IL-6 mRNA稳定表达,可调节试验健康番鸭IL-6 mRNA水平相对稳定。7.利用上述已扩增的MdIL-2基因开放阅读框（ORF） cDNA序列,经克隆筛选和测序后,构建出重组质粒pGEX6p-1/MdIL-2,转化大肠杆菌DH5α,并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明,表达的MdIL-2。融合蛋白分子量约为40 kD。研究结果揭示：①MDRV感染抑制雏番鸭神经-内分泌-免疫系统分泌IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、GH、ACTH,促进GC分泌,导致免疫抑制。②APS和HPS通过能促进MDRV感染番鸭分泌IL-1、IL-2和IL-4,抑制细胞凋亡；维持血清IL-6、ACTH、β-EP含量相对稳定；抑制MDRV感染番鸭GC急剧升高,调节番鸭神经-内分泌-免疫系统达到稳定状态,促进MDRV免疫抑制番鸭康复。本研究结果可为HPS和APS对番鸭呼肠呼病毒病的防治提供理论依据。
二、重组绵羊白细胞介素2基因的分泌性表达及表达产物的提取（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组绵羊白细胞介素2基因的分泌性表达及表达产物的提取（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）梅花鹿IL-2基因与TNF-α基因的克隆、真核表达及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 细胞因子 |
| 1.2白细胞介素2 |
| 1.3 肿瘤坏死因子α |
| 1.4 耻垢分枝杆菌 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 梅花鹿IL-2基因与TNF-α基因的克隆及序列分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 梅花鹿IL-2和TNF-α基因真核表达载体的构建及表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 梅花鹿IL-2、TNF-α基因真核表达产物对耻垢分枝杆菌mc~2155侵染Vero细胞的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）丁香酚抑制猪源肺炎克雷伯菌AI-2信号分子和MrkD蛋白机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 肺克菌研究概况 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 耐药性及机制 |
| 1.4 致病性与毒力因子 |
| 1.5 防治手段 |
| 第2章 LuxS/AI-2 群体感应系统研究进展 |
| 2.1 QS群体感应概述 |
| 2.2 AI-2 信号分子合成途径 |
| 2.3 LuxS/AI-2 群体感应系统参与调控的功能 |
| 第3章 丁香酚及其药理作用研究进展 |
| 3.1 单体结构 |
| 3.2 药理作用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 猪源肺克菌分离鉴定、药敏试验及表型鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪源肺炎克雷伯菌的分离培养 |
| 2.2 生化试验 |
| 2.3 16s rRNA鉴定 |
| 2.4 药敏试验 |
| 2.5 分离株对小鼠致病性 |
| 2.6 表型鉴定试验 |
| 2.7 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离菌株的培养及形态 |
| 3.2 生化特性 |
| 3.3 16s rRNA片段扩增及克隆结果 |
| 3.4 药敏纸片结果 |
| 3.5 小鼠致病性结果 |
| 3.6 表型鉴定试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第2章 亚抑菌浓度丁香酚抑制猪源肺克菌转录组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 MIC、MBC测定 |
| 2.2 MBIC测定 |
| 2.3 中位时间、切片、计数 |
| 2.4 转录组测序结果分析 |
| 2.5 qPCR验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 丁香酚对肺炎克雷伯菌的MIC和 MBC |
| 3.2 丁香酚缓解小鼠肺炎克雷伯菌感染试验结果 |
| 3.3 转录组测序分析结果 |
| 3.4 KEGG通路分析 |
| 3.5 qPCR验证基因表定量分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第3章 猪源肺炎克雷伯菌luxS基因敲除株的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 pRE112-luxS上下游同源臂重组自杀质粒构建 |
| 2.2 阳性重组子筛选 |
| 2.3 KP1ΔluxS株生长曲线、生物膜形成测定 |
| 2.4 KP1ΔluxS株 LD_(50) 的测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 pRE112-luxS上下游同源臂重组自杀质粒构建结果 |
| 3.2 KP1ΔluxS株生长曲线、生物膜形成测定结果 |
| 3.3 luxS基因缺失对LD_(50) 的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 丁香酚抑制Lux S/AI-2和MrkD活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、质粒、细胞及实验动物 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要溶液的配置 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 LuxS原核表达、纯化 |
| 2.2 Pfs(Mtnn)原核表达、纯化 |
| 2.3 AI-2 合成抑制试验 |
| 2.4 MrkD原核表达、纯化 |
| 2.5 MrkD黏附试验 |
| 2.6 MrkD黏附抑制试验 |
| 2.7 DAPI染色 |
| 2.8 MrkD多抗制备及WB分析 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 luxS基因克隆结果 |
| 3.2 重组表达质粒pET-28a-luxS鉴定、比对结果 |
| 3.3 原核表达产物SDS-PAGE电泳和纯化结果 |
| 3.4 LuxS原核表达产物Western-blot分析结果 |
| 3.5 丁香酚与Lux S蛋白分子对接结果 |
| 3.6 pfs基因克隆结果 |
| 3.7 重组表达质粒pET-28a-pfs鉴定、比对结果 |
| 3.8 原核表达产物SDS-PAGE电泳和纯化结果 |
| 3.9 Pfs原核表达产物Western-blot分析结果 |
| 3.10 丁香酚与Pfs蛋白分子对接结果 |
| 3.11 AI-2 合成抑制试验结果 |
| 3.12 mrkD基因克隆结果 |
| 3.13 重组表达质粒pET-28a-mrk D鉴定、比对结果 |
| 3.14 原核表达产物SDS-PAGE电泳和纯化结果 |
| 3.15 MrkD原核表达产物Western-blot分析结果 |
| 3.16 丁香酚与MrkD蛋白分子对接结果 |
| 3.17 MrkD黏附试验结果 |
| 3.18 MrkD黏附抑制试验结果 |
| 3.19 DAPI染色 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）重组人白细胞介素7在HEK293细胞中稳定分泌表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、细胞和试剂 |
| 1.2 人IL-7引物及基因的扩增 |
| 1.3 重组表达载体pc DNA3.1-r IL-7的构建 |
| 1.4 重组质粒pc DNA3.1-r IL-7转染HEK293细胞 |
| 1.4.1 HEK293细胞G418最佳筛选浓度的确定 |
| 1.4.2 转染HEK293细胞 |
| 1.4.3 HEK293-r IL-7细胞亚克隆 |
| 1.4.4 亚克隆细胞的初检及其保存 |
| 1.5 亚克隆细胞株的IL-7表达检测 |
| 1.5.1 荧光蛋白的表达情况 |
| 1.5.2 IL-7基因的转录 |
| 1.5.3 重组蛋白的ELISA检测 |
| 1.5.4 重组蛋白的Western Blotting分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达载体pc DNA3.1-r IL-7的构建 |
| 2.2 G418最小致死浓度的筛选 |
| 2.3 pc DNA3.1-r IL-7转染HEK293细胞 |
| 2.4 HEK293-r IL-7细胞亚克隆及IL-7蛋白初检 |
| 2.5 HEK293-r IL-7-2G3细胞株的IL-7表达检测 |
| 2.5.1 IL-7基因的转录 |
| 2.5.2 IL-7的ELISA检测 |
| 2.6 Western Blotting检测 |
| 3 讨论 |
（5）猪PBD-1基因的扩增、克隆及成熟肽基因的原核表达（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 试验一 猪β防御素-1全基因扩增、克隆及序列测定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验二 乳酸杆菌整合型表达质粒pMJ67-SP-PBD1_(His)的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验三 猪PBD1_(His)基因在干酪乳酸杆菌中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验四 猪PBD1基因在大肠杆菌中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 附件 |
（6）Mo P113/Mmc LppA蛋白基因克隆表达及其免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 羊肺炎支原体研究进展 |
| 第一章 Mo P113/Mmc LppA基因克隆及其生物信息学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 Mo P113/Mmc LppA基因扩增 |
| 2.2 Mo P113/Mmc LppA基因克隆测序 |
| 2.3 Mo P113/Mmc LppA蛋白基因生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MoP113蛋白基因序列分析结果 |
| 3.2 Mmc LppA蛋白基因序列分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MoP113基因序列分析 |
| 4.2 Mmc LppA蛋白基因序列分析 |
| 第二章 Mo P113/Mmc LppA蛋白原核表达及ELISA检测方法建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 Mo P113/Mmc LppA基因片段原核表达载体构建 |
| 2.2 pColdⅠ-P113/pColdⅠ-LppA重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3 纯化重组蛋白反应原性分析 |
| 2.4 间接ELISA方法建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 Mo P113 蛋白原核表达及间接ELISA方法建立结果 |
| 3.2 Mmc LppA蛋白原核表达及间接ELISA方法建立结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于Mo P113 蛋白原核表达及间接ELISA方法建立 |
| 4.2 关于Mmc LppA蛋白原核表达及间接ELISA方法建立 |
| 第三章 Mo P113/Mmc LppA蛋白真核表达及其免疫研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 Mo P113/Mmc LppA基因真核表达质粒构建 |
| 2.2 Mo P113和Mmc LppA双基因共表达质粒pVAX1-P113-LppA的构建 |
| 2.3 重组质粒pVAX1-P113、pVAX1-LppA、pVAX1-P113-LppA体外表达 |
| 2.4 重组质粒动物免疫试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 Mo P113/Mmc LppA蛋白基因片段重组质粒构建结果 |
| 3.2 重组质粒体外表达结果 |
| 3.3 重组质粒动物免疫试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于真核表达载体的选择 |
| 4.2 关于重组质粒的构建 |
| 4.3 关于重组质粒刺激小鼠的免疫应答反应 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 各种溶液及试剂的配制 |
| 附录二 攻读硕士学位期间发表论文及参加科研项目 |
| 致谢 |
（7）牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的真核表达及免疫保护效果评价（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1 奶牛乳房炎危害 |
| 1.1 奶牛乳房炎的危害 |
| 1.2 金黄色葡萄球菌概述 |
| 1.2.1 金黄色葡萄球菌的危害 |
| 1.2.2 金黄色葡萄球菌毒力因子 |
| 2 金黄色葡萄球菌 β-溶血素研究进展 |
| 2.1 金黄色葡萄球菌溶血素的分类 |
| 2.2 金黄色葡萄球菌 β-溶血素的制备 |
| 2.3 金黄色葡萄球菌 β-溶血素纯化方法 |
| 3 金黄色葡萄球菌疫苗研究进展 |
| 3.1 灭活苗 |
| 3.2 亚单位疫苗 |
| 3.3 重组载体疫苗 |
| 3.4 合成肽疫苗 |
| 3.5 基因疫苗 |
| 3.6 基因缺失疫苗 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 溶血素基因型和表型相关性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 主要溶液的配制 |
| 1.2.2 溶血素基因检测 |
| 1.2.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2.2 基因组DNA的提取 |
| 1.2.2.3 PCR扩增与凝胶电泳 |
| 1.2.2.4 测序 |
| 1.2.3 溶血性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 基因组DNA提取结果 |
| 2.2 溶血素基因检测结果 |
| 2.3 溶血性检测结果 |
| 2.4 溶血素基因型和表型相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 实验二 β-溶血素基因真核重组质粒的构建与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 主要溶液的配制 |
| 1.2.2 重组质粒pcDNA3.1 HisB-hlb的构建 |
| 1.2.3 质粒的提取 |
| 1.2.4 pcDNA HisB-hlb的测序和酶切鉴定 |
| 1.2.5 pcDNA HisB-hlb在MCF-7 中的表达 |
| 1.2.5.1 MCF-7 的培养 |
| 1.2.5.2 转染MCF-7 |
| 1.2.6 反转录 |
| 1.2.6.1 细胞总RNA的提取 |
| 1.2.6.2 反转录合成cDNA |
| 1.2.7 PCR检测cDNA |
| 1.2.8 Western blot检测重组质粒的表达 |
| 1.2.8.1 细胞总蛋白的提取 |
| 1.2.8.2 SDS-PAGE电泳 |
| 1.2.8.3 转膜 |
| 1.2.8.4 封闭与抗体孵育 |
| 1.2.8.5 显色 |
| 1.2.8.6 曝光 |
| 2 结果 |
| 2.1 pcDNA3.1 HisB-hlb合成结果 |
| 2.2 pcDNA3.1 HisB-hlb的酶切鉴定 |
| 2.3 MCF-7 转染pcDNA3.1 HisB-hlb前后的观察 |
| 2.4 pcDNA3.1 HisB-hlb在MCF-7 中表达情况的检测 |
| 2.4.1 PCR检测细胞总RNA |
| 2.4.2 Western blot检测hlb的表达 |
| 3 讨论 |
| 实验三：β-溶血素的纯化及活性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.2 主要仪器和试剂见附录 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 蛋白浓度的测定 |
| 1.2.2 β-溶血素的纯化 |
| 1.2.3 溶血效价的测定 |
| 1.2.3.1 1%红细胞悬液的制备 |
| 1.2.3.2 溶血效价的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 β-溶血素纯化结果 |
| 2.2 溶血效价测定结果 |
| 3 讨论 |
| 实验四：β-溶血素和重组质粒对小鼠的免疫保护 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗的制备和安全检验 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 免疫血清的制备 |
| 1.2.4 ELISA实验 |
| 1.2.5 攻毒实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 疫苗的无菌和安全检验 |
| 2.2 ELISA测定结果 |
| 2.3 免疫保护结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 一、β-溶血素序列 |
| 二、所用试剂及试剂盒 |
| 三、所用仪器 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（8）IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述1 |
| 文献综述2 |
| 第一章 山羊IL-2 基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 山羊IL-2 基因克隆与序列分析 |
| 2.2 山羊IL-2 基因生物信息学分析 |
| 2.3 山羊IL-2 基因真核表达质粒构建与表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 山羊IL-2 基因克隆及序列分析结果 |
| 3.2 山羊IL-2 基因生物信息学分析结果 |
| 3.3 山羊IL-2 基因真核表达质粒鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于山羊IL-2 基因克隆及生物信息学分析 |
| 4.2 关于真核表达质粒载体的选择 |
| 4.3 关于pVAX1-IL-2 在MDBK细胞中的表达 |
| 5 小结 |
| 第二章 羊口疮病毒(OrfV) B2L、F1L基因真核表达质粒的构建与表达研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 OrfV B2L、F1L基因克隆与序列分析 |
| 2.2 OrfV B2L、F1L基因的生物信息学分析 |
| 2.3 OrfV B2L、F1L基因真核表达质粒构建与表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 OrfV B2L、F1L基因的克隆及序列分析结果 |
| 3.2 OrfV B2L、F1L基因的生物信息学分析结果 |
| 3.3 OrfV B2L、F1L基因真核表达质粒鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于OrfV核酸疫苗目的基因的选择 |
| 4.2 关于OrfV B2L与F1L基因的生物信息学分析 |
| 4.3 关于OrfV pVAX1-B2L和pVAX1-F1L在MDBK细胞中的转录和表达 |
| 5 小结 |
| 第三章 IL- 2 基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 pVAX1-IL-2、pVAX1-B2L和pVAX1-F1L质粒制备 |
| 2.2 实验动物(KM系)免疫试验 |
| 2.3 免疫小鼠血清中特异性抗体水平检测 |
| 2.4 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验 |
| 2.5 免疫小鼠脾脏T淋巴细胞亚类变化 |
| 2.6 免疫小鼠血清中Th1/ Th2型细胞因子检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清中特异性抗体水平动态变化结果 |
| 3.2 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.3 免疫小鼠脾脏T淋巴细胞亚类分析结果 |
| 3.4 免疫小鼠血清中Th1/Th2型细胞因子检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于IL-2 基因佐剂对核酸疫苗免疫效果的影响 |
| 4.2 关于OrfV核酸疫苗诱导免疫反应 |
| 4.3 关于免疫检测指标的选择 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 攻读硕士期间发表论文情况 |
| 附录二 攻读硕士期间取得的成果 |
| 附录三 主要培养基、溶液及试剂配制 |
| 致谢 |
（9）猪α干扰素和白细胞介素-2在真核细胞中表达及其表达产物活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 猪A干扰素与白细胞介素2研究进展 |
| 1 A干扰素研究进展 |
| 1.1 α干扰素简介 |
| 1.2 α干扰素结构特征及分子生物学特性 |
| 1.3 α干扰素产生机理 |
| 1.4 α-干扰素的信号转导路径 |
| 1.5 α-干扰素的作用机理 |
| 1.6 α-干扰素的生物学活性 |
| 1.7 α-干扰素基因工程研究 |
| 1.8 α-干扰素的应用及前景展望 |
| 1.9 INF-α研究在预防兽医学中的意义 |
| 2 白细胞介素2研究进展 |
| 2.1 白细胞介素2简介 |
| 2.2 白细胞介素2核酸及蛋白结构特征 |
| 2.3 IL-2的应用 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 猪IFN-A、IL-2基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 PoIFN-α、PoIL-2 基因引物设计 |
| 1.3 猪外周血淋巴细胞分离与培养 |
| 1.4 淋巴细胞总RNA提取及反转采 |
| 1.5 PoIFN-α、PoIL-2基因的扩增 |
| 1.6 目的基因的回收与连接 |
| 1.7 连接产物分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 |
| 1.8 pMD18-IFN、pMD18-IL重组质粒的鉴定 |
| 1.9 PoIFN-α基因和PoIL-2基因的序列测定及分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PoIFN-α基因和PoIL-2基因的RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 PoIFN-α基因和PoIL-2基因重组质粒菌液PCR鉴定 |
| 2.3 PoIFN-α基因和PoIL-2基因重组质粒双酶切鉴定 |
| 2.4 PoIFN-α基因和PoIL-2基因核苷酸序列的分析 |
| 3 讨论 |
| 实验二 PoIFN-A和PoIL-2基因转染真核细胞及筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 PoIFN-α和PoIL-2基因真核表达载体的构建 |
| 1.3 PoIFN-α和PoIL-2基因真核表达载体的鉴定 |
| 1.4 PoIFN-α和PoIL-2基因重组质粒转染真核细胞 |
| 2 结果 |
| 2.1 pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL真核表达载体的PCR鉴定结果 |
| 2.2 pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL真核表达载体的酶切鉴定结果 |
| 2.3 转入外源基因的真核细胞G418筛选结果 |
| 2.4 整合外源基因的真核细胞RT-PCR鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 PoIFN-A和PoIL-2基因在真核细胞内表达,及表达产物活性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 PoIFN-α和PoIL-2基引mRNA表达Real-time检测 |
| 1.3 PoIFN-α和PoIL-2基因表达蛋白表达的ELISA检测 |
| 1.4 重组PoIFN-α和PoIL-2产物的淋巴细胞增殖实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 实时荧光定量标准载体目的片段克隆结果 |
| 2.2 实时荧光定量标准载体目的片段测序结果 |
| 2.3 PoIFN-α基因、PoIL-2基因和β-actin基因的标准曲线结果 |
| 2.4 PoIFN-α、PoIL-2基因在真核细胞中表达的CT值分析结果 |
| 2.5 外源基因表达的ELISA检测结果 |
| 2.6 外源基因表达产物的促淋巴细胞增殖实验结果 |
| 3 讨论 |
| 实验四 猪Mx1基因启动子及Mx1基因扩增 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 Mx1启动子、Mx1基因引物设计 |
| 1.3 猪外周血淋巴细胞分离与培养 |
| 1.4 淋巴细胞总RNA提取及反转录 |
| 1.5 猪Mx1启动子、Mx1基因的RT-PCR扩增 |
| 1.6 目的基因的回收与连接 |
| 1.7 连接产物分别转化感受态细胞及蓝白斑筛选 |
| 1.8 Mx1启动子载体和Mx1载体的鉴定 |
| 1.9 Mx1启动子和Mx1基因真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 Mx1启动子基因和Mx1基因的RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 PGK-MP和PMD18-Mx1载体重组质粒的鉴定 |
| 2.3 PGK-Mx1P-Mx1真核表达载的鉴定 |
| 2.4 PGK-Mx1P-Mx1构建后图谱及PGKneotpALox2载体图谱 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（10）两种中药多糖对呼肠孤病毒感染番鸭的免疫调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 引言 |
| 1 禽类免疫应答的调节 |
| 1.1 细胞因子的免疫调节 |
| 1.2 畜禽的神经-内分泌-免疫网络调节 |
| 2 引起禽类免疫抑制的因素 |
| 2.1 番鸭呼肠孤病毒感染的流行病学、临床症状和病理变化 |
| 2.2 呼肠孤病毒感染番鸭的免疫抑制 |
| 3 中药多糖的免疫调节作用 |
| 3.1 中药多糖对免疫器官的影响 |
| 3.2 中药多糖对免疫细胞的影响 |
| 3.3 中药多糖对细胞因子的影响 |
| 3.4 中药多糖参与调节神经-内分泌-免疫网络调节 |
| 3.5 黄芪多糖的免疫调节作用 |
| 3.6 猴头菇多糖的免疫调节作用 |
| 4 本研究的立题依据、研究内容及研究意义 第二章 番鸭IL-2、IL-6、β-actin基因片段的克隆 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 质粒和菌株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要实验仪器设备 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 番鸭脾淋巴细胞的分离与诱导培养 |
| 2.3 细胞总RNA的提取 |
| 2.4 番鸭IL-2、IL-6、β-actin基因的RT-PCR |
| 2.5 PCR产物目的片段的回收与纯化 |
| 2.6 感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 2.7 IL-2 cDNA与pMD18T-simple vector的连接及转化 |
| 2.8 重组质粒少量提取 |
| 2.9 重组质粒的鉴定 |
| 2.10 pMD18T-simple/IL-2、IL-6和β-actin PCR产物序列测定与分析 |
| 2.11 番鸭IL-2基因序列的同源性比较 |
| 2.12 番鸭IL-2推导氨基酸序列比较 |
| 2.13 番鸭IL-2分子二级结构的初步预测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 番鸭IL-2、IL-6、β-actin基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 重组质粒pMD18T-simple/IL-2的鉴定 |
| 3.3 重组质粒pMD18T-simple/IL-2的测序结果与分析 |
| 3.4 IL-6 PCR产物的序列测定结果与比较分析 |
| 3.5 β-actin PCR产物序列测定结果与比较分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 番鸭IL-2基因克隆 |
| 4.2 番鸭IL-6基因克隆 |
| 4.3 番鸭β-actin基因克隆 第三章 番鸭IL-2原核表达载体的构建及诱导表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 工具酶和相关试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 原核表达载体的构建 |
| 2.2 表达载体的鉴定 |
| 2.3 重组表达质粒pGEX6p-1/MdIL-2在大肠杆菌中的表达 |
| 2.4 表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定 |
| 2.5 诱导表达时间的优化 |
| 2.6 IPTG最佳诱导浓度的确定 |
| 2.7 最佳诱导温度的确定 |
| 2.8 表达产物的SDS-PAGE分析和Western-blotting初步鉴定 |
| 2.9 表达蛋白的纯化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 表达载体鉴定结果 |
| 3.2 pGEX6p-1/MdIL-2融合蛋白的表达 |
| 3.3 诱导表达产物的Western-blotting分析 |
| 3.4 pGEX6p-1/MdIL-2融合蛋白的表达形式 |
| 3.5 IL-2放射性免疫检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 IL-2的生物学活性及其作用特点 |
| 4.2 表达载体对表达的产量及生物学活性影响 |
| 4.3 表达产物的分布 |
| 4.4 蛋白诱导表达的条件 |
| 4.5 表达蛋白的纯化 第四章 番鸭呼肠孤病毒病自然感染发病模型的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 试验番鸭种蛋和1日龄雏番鸭 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.5 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 番鸭呼肠孤病毒的扩增 |
| 2.2 病毒感染力的测定 |
| 2.3 同居感染模拟番鸭呼肠孤病毒自然感染 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 细胞病变结果观察与TCID_(50)统计 |
| 3.2 同居感染MDRV雏番鸭的临床症状和剖检病变 |
| 3.3 番鸭呼肠病毒病自然感染发病模型的确定 |
| 4 讨论 第五章 中药多糖对MDRV免疫抑制番鸭的免疫调节作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 试验雏番鸭 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.5 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 试验用中药多糖的筛选 |
| 2.2 中药多糖饮水剂量的选择 |
| 2.3 黄芪多药和猴头菇多糖对番鸭呼肠孤病毒引起免疫抑制的干预作用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猴头菇多糖和黄芪多糖防治MDRV感染饮水口服浓度的确定 |
| 3.2 黄芪多糖和猴头菇多糖对MDRV感染雏番鸭的保护效果 |
| 3.3 血清制备 |
| 3.4 脾脏样品制备 |
| 4 讨论 |
| 4.1 试验进一步验证番鸭呼肠孤病毒病自然感染发病模型成功建立 |
| 4.2 黄芪多糖和猴头菇多糖在试验番鸭中的使用与饮水口服浓度 |
| 4.3 黄芪多糖和猴头菇多糖对呼肠孤病毒感染番鸭防防保护作用 |
| 4.4 黄芪多糖和猴头菇多糖对呼肠孤病毒感染番鸭治疗作用 第六章 中药多糖对MDRV免疫抑制番鸭血清白细胞介素、神经介质和激素的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 番鸭血清 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 标本采集 |
| 2.2 放免检测方法 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 番鸭血清白细胞介素1(IL-1)含量 |
| 3.2 番鸭血清白细胞介素2(IL-2)含量 |
| 3.3 番鸭血清白细胞介素4(IL-4)含量 |
| 3.4 番鸭血清白细胞介素6(IL-6)含量 |
| 3.5 番鸭血清促肾上腺皮质激素(ACTH)含量 |
| 3.6 番鸭血清糖皮质激素(GC)含量 |
| 3.7 番鸭血清生长激素(GH)含量 |
| 3.8 番鸭血清β-内啡肽(β-EP)含量 |
| 3.9 各检测指标相对含量的变化趋势 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MDRV感染对番鸭血清部分细胞因子、神经递质和激素的影响 |
| 4.2 黄芪多糖(APS)对MDRV感染番鸭的血清检测指标的影响 |
| 4.3 猴头菇多糖(HPS)对MDRV感染番鸭的血清检测指标的影响 |
| 4.4 神经-内分泌-免疫网络调节 第七章 两种多糖对MDRV免疫抑制番鸭IL-2和IL-6 mRNA转录水平的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 番鸭脾脏组织 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 荧光相对定量PCR引物设计 |
| 2.2 总RNA的提取与质量检测 |
| 2.3 总RNA的反转录 |
| 2.4 MdIL-2mRNA和MdIL-6mRNA相对定量RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.5 相对定量RT-PCR检测MdIL-2mRNA、MdIL-6mRNA转录水平 |
| 2.6 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 总RNA质量的鉴定 |
| 3.2 PCR检测目的基因引物 |
| 3.3 熔解曲线 |
| 3.4 标准曲线 |
| 3.5 相对定量结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于荧光相对定量RT-PCR的方法 |
| 4.2 试验番鸭脾脏组织IL-6mRNA和IL-2mRNA表达的影响 |
| 4.3 试验番鸭脾脏组织IL-2mRNA表达量与血清IL-2含量的比较 |
| 4.4 试验番鸭脾脏组织IL-6mRNA表达量与血清IL-6含量的比较 |
| 4.5 mRNA水平与细胞合成蛋白质的水平关系 第八章 全文总结 |
| 1 本研究结论 |
| 2 本研究创新点 |
| 3 本研究还需进一步解决的问题 参考文献 致谢 附录一:IL-2基因核苷酸多序列比较结果 附录二:IL-2基因核苷酸推导氨基酸序列比较结果 附录三:放免检测结果 附录四:样品总RNA OD_(260)/OD_(280)值 附录五:相对定量RT-PCR检测结果 |
四、重组绵羊白细胞介素2基因的分泌性表达及表达产物的提取（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]梅花鹿IL-2基因与TNF-α基因的克隆、真核表达及其免疫原性研究[D]. 姜棋文. 吉林农业大学, 2021
- [3]丁香酚抑制猪源肺炎克雷伯菌AI-2信号分子和MrkD蛋白机制研究[D]. 王一鸣. 吉林农业大学, 2019
- [4]重组人白细胞介素7在HEK293细胞中稳定分泌表达[J]. 李向茸,王兴陇,令瑛,徐雷,李琼毅,张海霞,包晓婧,冯若飞. 生物学杂志, 2017(05)
- [5]猪PBD-1基因的扩增、克隆及成熟肽基因的原核表达[D]. 杨兴武. 河南农业大学, 2017(01)
- [6]Mo P113/Mmc LppA蛋白基因克隆表达及其免疫研究[D]. 吴燕. 贵州大学, 2016(05)
- [7]牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的真核表达及免疫保护效果评价[D]. 李光超. 甘肃农业大学, 2016(08)
- [8]IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究[D]. 刘嫒. 贵州大学, 2016(03)
- [9]猪α干扰素和白细胞介素-2在真核细胞中表达及其表达产物活性分析[D]. 王大伟. 石河子大学, 2011(04)
- [10]两种中药多糖对呼肠孤病毒感染番鸭的免疫调节作用[D]. 吴异健. 福建农林大学, 2010(07)