浙江大学医学院附属儿童医院 浙江 杭州 310003 大连医科大学 辽宁 大连 116044
1 前言
中草药因为自身的一些优点如：资源丰富、价格低廉、不易产生有害残留、不易产生耐药性、毒副作用小，是现代抗生素类药物和化学药物无法比拟的。Etirfel制剂在具有抗菌的作用，但其物质基础目前尚未有文献。
2 方法
2.1抗菌活性的研究
2.1.1实验前的准备
各取西青果、诃子、余甘子50g，置于500ml的烧瓶中，按最佳提取工艺：提取温度50℃，每次1h，提取一次，每次10倍量的水。抽滤，挥干抽滤液，得粗浸膏，经50℃减压干燥至24h内三次测量重量不再减少，称重。将粗浸膏用蒸馏水溶解后浓缩至500ml，用聚酰胺大孔吸附树脂纯化工艺，按最佳纯化工艺：0.25ml/min的吸附流速、25ml的上样液体积，径高比为1：3和1.5ml/min的洗脱液流速。分别用蒸馏水和不同浓度的乙醇（30%、50%、70%）进行梯度洗脱，分别回收溶剂后得三份样品分别标为A、B、C、D，于50℃减压干燥至24h内三次测量重量不再减少，称重[1]，备用。
2.1.2菌液的复苏
菌液的配制：用移液枪取在-20℃甘油中保存金黄色葡萄球菌种液体20μl，加入到2mL 肉汤培养液的试管中，混匀。
培养：将配好菌液的试管于37℃的恒温静置培养18h，获得第二代金黄色葡萄球菌（Ⅱ代菌），取少量菌液在染色后，4000倍的光学显微镜下观察其形态，检查是否有杂菌存在；镜检无杂菌后取Ⅱ代菌20μl，加入到2mL 肉汤培养液的试管中，于37℃静置培养18h，获得得到第三代菌（Ⅲ代菌）取少量菌液，如上所述镜检观察形态，确认无杂菌后，备用。
2.1.3 摇菌
菌液的配制：取Ⅲ代菌20μl，加入到含有3ml肉汤培养液的10ml小瓶中。
培养：用棉花塞紧瓶口，于摇床中以160转/分钟，37℃恒温培养4~4.5h后，使其OD值在0.6~0.8之间（达到对数期），备用。
2.1.4最小杀菌浓度（MBC）的测定（试管二倍稀释法）
样品液的配制：取无菌试管10支，除第1支试管中加入1.6 ml 无菌肉汤培养液外，其余每支试管加入1.0 ml肉汤培养，于第1支试管加入0.4ml样品，混匀，于第1支试管取1.0mL加入第2支试管，混匀，于第2支试管取1.0 ml加入第3支试管，如此对比稀释至第8管时，从第8支试管取1.0ml弃去。
菌液的配制：将2.1.3项中的备用的菌液（OD为0.6～0.8）稀释至OD=0.1然后再稀释100倍，即达到106CFU/ml。将稀释好的菌液取1ml加入到上述试管中，即每管菌液可达5×105CFU/ml。
方法：向上述8支试管中加入菌液1.0 ml后（菌的终浓度为5×105 cfu/ml），于37℃恒温静置培养18～24 h后。取菌液0.1ml均匀涂布于琼脂培养基的平板上，倒置于37℃恒温箱中静置培养18～24 h。对平板上的菌落进行计数，出现菌落数少于5个时最低样品浓度为该药物的MBC值，实验重复3次[2，4]。结果见表1-3。
2.1.5 杀菌曲线
样品的配制：取4支无菌试管，除第1支试管加1.6ml无菌肉汤培养液和0.4ml最佳抗菌结果样品，其余3支试管均加1.0ml无菌肉汤培养液，依照2.4项下样品配制的方法对比稀释至第4支试管时，弃去1ml。
菌液的配制：向上述4支试管中加入菌液1.0mL（菌的终浓度为5×105 cfu/ml），方法：菌液配制完成后，置于37℃恒温静置培养，各取时间点或均属在0、2、4、8、12、18、24h的菌液0.1ml，均匀涂布于琼脂基的平板上，于37℃静置培养18~24h后，用平板法计算其活菌数。以时间点为横坐标，活菌数的对数为总坐标作图[2，3，4]。见图1
3实验结果
3.1最小杀菌浓度（MBC）的测定结果
4结论
本实验通过Etirfel制剂总黄酮通过不同浓度乙醇纯化后，对金黄色葡萄球菌抑制作用的研究表明，70%乙醇洗脱出来的部分对金黄色葡萄球菌抑制作用较好，其MBC为2.3mg/mL。通过作杀菌曲线实验表明，随着药物浓度的增大，时间的延长，对金黄色葡萄球菌抑制作用增强。
5参考文献：
[1] Dingrui Liu，Yuan Lin，Zhi Du，et al.Study on the Extraction and Purification of Total Flavone in Etirfel Praparation[J].Asian Journal Of Chemistry，2013，25（3）：1339-1343.
[2]Emilia Canton，Javier Peman，Amparo Valentin et al.Comparison of posaconazole and voriconazole in vitro killing against Candida krusei[J].Diagnostic Microbiology and Infections Disease，2008，62：177-181.
[3] Lee H J，Choi G J，Cho K Y.Correlation of lipid peroxidation in Botrytis cinerea caused by dicarboximide fungicides with their fungicidal activity [J].Journal of Agricultural Food Chemistry，1998，46：737~741
[4] 王海涛.大豆异黄大酮的抑菌活性及其机制的研究[D].辽宁师范大学，2009.
论文作者:杜智1,刁云鹏2
论文发表刊物:《健康世界》2016年第15期
论文发表时间:2016/9/5
标签：试管论文; 培养液论文; 肉汤论文; 浓度论文; 葡萄球菌论文; 样品论文; 金黄色论文; 《健康世界》2016年第15期论文;