崔为国 徐畅(山东省济宁市兖州区人民医院泌尿外科，山东济宁 272100）
摘要 目的：探讨单侧睾丸外伤后致对侧睾丸生精细胞损害及手术和药物干预的影响。 方法：将Wistar雄性大鼠40只(230~250g)随机分为四组建立睾丸外伤动物模型。A组：外伤模型组；B组：手术组，右侧睾丸外伤6小时后手术清创；C组：泼尼松干预组，外伤后给予泼尼松25mg/kg?d，连续两周；D组：空白对照组。用TUNEL法检测睾丸生精细胞凋亡情况，并比较各组间生精细胞凋亡程度的差异性。结果：1．外伤模型组和空白对照组比较，HE染色片可见生精细胞层数减少，尤其是精原细胞数量明显减少。手术清创缝合组和外伤模型组比较，可见生精细胞受损减轻。而应用泼尼松组和外伤模型组比较，发现无明显抑制生精细胞减少的作用，仍出现精原细胞等生精细胞层数减少。2．透射电镜：凋亡细胞主要表现为线粒体和细胞核的改变，可见线粒体空泡变、髓样变、瘠断裂及凋亡小体形成等。3.外伤模型组和空白组对照可见生精细胞凋亡主要表现为精原细胞，精原细胞数量减少，具有统计学意义(P<0.01)。 结论1．大鼠单侧睾丸挫裂伤可导致对侧睾丸生精细胞受损害而凋亡，生精细胞凋亡主要发生于精原细胞，细胞层数明显减少。2．早期手术清创缝合，清除失活的组织，缝合破裂的白膜可减少生精细胞的凋亡。3．糖皮质激素（泼尼松）应用不能有效地防止生精细胞凋亡，而间质细胞的凋亡也有所增加。
关键词：睾丸；外伤；凋亡；生精细胞；手术；药物干预
睾丸作为男性重要的内生殖器官，它不象肾、肾上腺等成对器官，一侧损伤后，对侧可完全代偿而维持正常功能。一侧睾丸局部创伤、感染或免疫失衡可能因触发自身免疫反应或通过其他机制导致对侧睾丸生精细胞及相关细胞受到损害，甚至出现不育【1】，在正常的情况下，机体对睾丸的抗原不产生免疫反应 [2]。单侧睾丸损伤可导致对侧睾丸功能下降或发生纤维化萎缩，丧失睾丸功能称为交感性睾丸炎，(sympathetic orchitis)[3]，其原因未知，多数学者认为是自身免疫性损害，与体液免疫和细胞免疫有关。
材料与方法
1 实验材料
实验动物：健康成年雄性Wistar大鼠40只，体重230～250g,由鲁抗集团动物中心提供。
2 实验方法
2.1 实验分组
将大鼠领养后观察一周以适应环境，动物随机分为四组：A组：外伤模型组；B：手术清创组；C：泼尼松治疗组；D：空白对照组。
A组：睾丸外伤模型组。麻醉(以5%的水合氯醛按200mg/kg腹腔注射)后将大鼠右侧阴囊皮肤消毒，用消毒的三棱针刺入睾丸组织内10次，并用持针钳轧伤睾丸3次。使睾丸内少量组织溢出。然后缝合阴囊皮肤。
B组：手术清创组。同上组方法见有睾丸组织溢出后待6小时后再清创切除失活的组织并缝合睾丸白膜及皮肤。
C组：同A组方法，术后麻醉过后给予泼尼松(25mg/kg?d)治疗2周停药。
D组：将阴囊皮肤切开达睾丸白膜后缝合皮肤。
2.2 1个月后取材
取左侧睾丸组织先在中性福尔马林固定液中固定48小时，再用Bouin’s固定液固定18小时，在70%酒精中浸泡3天洗脱苦味酸。石蜡包埋切片，切片厚4-6微米，进行苏木素-伊红染色以及TUNEL染色。取各组的左侧睾丸2只，浸入冷的(4℃)40g/l多聚甲醛和25g/l戊二醛混合固定液内，在冰上切成1立方毫米小块，继续固定2小时，再在浸洗液中4℃过夜，锇酸固定1小时，丙酮脱水，Epon618包埋，半薄切片定位，在超薄切片，醋酸铀-硝酸铅染色，H-7500电子透射镜下观察。
2.3 结果评定
每次实验均以已知阳性组织为阳性对照。光镜下观察染色结果，阳性反应为深蓝色染色细胞，位于胞核内。在高倍镜下任取五个高倍视野计数染色阳性细胞平均数。
2.4 统计学分析
数据采用均数资料表示，应用SPSS 10.0统计软件对各组睾丸组织生精细胞凋亡程度进行方差分析，P<0.05为差异有显著性。
结果
1 外伤模型组和空白对照组比较HE染色片可见生精细胞层数减少，尤其是精原细胞数量明显减少。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆手术清创缝合组和外伤模型组比较可见生精细胞受损减轻，而应用激素组发现无明显抑制生精细胞减少的作用，仍出现精原细胞、初级精母细胞等生精细胞层数减少，而支持细胞无明显改变。空白对照组无明显改变。
2 透射电镜：凋亡细胞主要表现为线粒体和细胞核染色质的改变，可见粗面内质网脱颗粒，胞核固缩，线粒体空泡变、髓样变、瘠断裂及凋亡小体形成等，细胞核染色质浓缩，边集。
3 TUNEL结果显示：外伤模型组和空白组对照可见生精细胞凋亡主要表现为精原细胞凋亡，凋亡细胞和空白对照组比较明显增多，精原细胞数量及层次减少(P<0.01)。手术清创组和模型组比较可见生精细胞凋亡明显减少，生精细胞层数较模型组增加明显(P<0.05)；而糖皮质激素（泼尼松组）可见凋亡的细胞无明显减少，主要是精原细胞和初级精母细胞及部分间质细胞凋亡，其精原细胞和初级精母细胞凋亡数和模型组比较无统计学意义(P>0.05)。
讨论
1. 生精细胞凋亡与自体免疫反应有关
正常情况下精子无法穿过进入血液，免疫系统不会对自身精子产生免疫应答。特殊情况比如感染、损伤、手术、化学损伤等，均可导致隐蔽的精子抗原突破生理屏障的各种保护而进入血液循环，触发抗精子抗体（AsAb）的产生。
2. 生精细胞凋亡可能与血液中的活性氧( ROS)增加有关
研究表明，睾丸生精过程中生精细胞所处的氧化环境与它们的发育和分化密切相关[4]。睾丸组织中的活性氧(ROS)含量的异常升高必将对睾丸生精细胞的生理功能造成影响。睾丸外伤后局部组织损伤可导致局部组织缺氧，坏死物质吸收及炎性介质可使血液中的活性氧含量增加，随血液循环到达对侧睾丸，改变了对侧睾丸的内环境，也可使睾丸局部毛细血管通透性增加，不但抗精子抗体进入到生精上皮，活性氧也同样进入生精上皮对生精细胞造成损伤，可能引起生精细胞凋亡。活性氧介导细胞凋亡已是公认的事实，但生精细胞凋亡是否也与其有关还没有确切的证据。
3. 一侧睾丸损伤引起对侧睾丸炎致生精细胞损伤凋亡
许多研究发现一侧睾丸损伤导致对侧睾丸生精细胞损伤的发生，在各种族的小鼠或大鼠各不相同。国内也有研究各种大鼠一侧睾丸损伤导致对侧睾丸发生病理改变的发生率不同[5]。组织学研究发现睾丸炎症细胞入侵的脆弱部位，首先淋巴细胞浸入靠近直小管和睾丸网的白膜，随后巨噬细胞等混合细胞浸入睾丸直小管和白膜区间质，最后浸入精曲小管。光镜检查发现精曲小管的基膜无明显损伤，生精细胞层数减少，支持细胞和各级生精细胞空泡化，电镜检查发现线粒体肿胀，空泡变性，可能与实验发现存在抗体有关。
5. 糖皮质激素对生精细胞和间质细胞凋亡的影响
本实验应用透射电镜观察了经口服泼尼松(25mg/kg?d)两周后的大鼠睾丸组织发现，在部分精原细胞和Leydig细胞中，有些细胞核的核膜皱缩，染色质在核膜下呈半月状聚集，有些细胞核染色质浓缩并集中于核中央，也有一些细胞中出现凋亡小体。
综上所述，根据以上实验结果，证实了一侧睾丸外伤可引起对侧睾丸生精功能受损，清创术对对侧睾丸生精细胞有保护作用；泼尼松可导致成年期大鼠精原细胞和Leydig细胞凋亡。
参考文献
[1] Mukasa A Hiromatsu K,Matsuzaki G,et al. Bacterial infection of the testis leading to auto aggressive immunity triggers apparently opposes of and cells [J].J Immunol,1995,155:2047-2056.
[2] Taguchi O, Nishizuka Y.Experimental autoimmune orchitis after neonatal thy mectomy in the mouse [J].Clin Exp Immunol,1981,46:425.
[3] Sakamoto Y, Matsumoto T, Kumazawa J, et al.Establishment of murine model of autoimmune male infertility. Nippon Hinyokika Gakkai Zasshi, 1999, 90 (9): 763 -768. (Abstact)
[4] 潘涛，黄晓玲，侯新燕．超声诊断幼儿睾丸鞘膜积液合并结石一例［J/CD］．中华医学超声杂志（电子版），2011，8（7）：1592．
[5] Aitken RJ, Vernet P Maturation of redox regulatory mechanisms in the epididymi [J]s. J Reprod Fertil Suppl ,1998 ,53 (6) :109～118.
论文作者:崔为国,徐畅
论文发表刊物:《中国医学人文》2015年第10期供稿
论文发表时间:2015/12/16
标签：睾丸论文; 细胞论文; 精细论文; 凋亡论文; 外伤论文; 损伤论文; 模型论文; 《中国医学人文》2015年第10期供稿论文;