李振宇, 陈玲霞, 尹博文, 代解杰[1]2015年在《骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的研究进展》文中研究表明由各种因素导致的重症肝病的终末治疗的最好手段一直是原位肝移植,但长期以来肝供体的缺乏和免疫排斥引起的一系列问题极大地限制了该手术的运用,同时,在肝脏相关药物的筛选中,原代肝细胞难于培养且易在培养过程中变异,而随着骨髓间充质干细胞研究的深入,越来越多的证据表明骨髓间充质干细胞具有向肝细胞分化的潜能。因此,骨髓间充质干细胞诱导分化而成的肝样细胞在再生医疗和药物筛选领域具有较好的运用前景,本文就间充质干细胞的分离培养及其生物学特性,肝样细胞的诱导培养条件,生物学特性及其运用前景加以综述。
熊剑勇[2]2010年在《体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究》文中指出肝脏疾病在我国属临床常见病、多发病,严重地危害人类的健康。大量肝脏疾病患者由于缺乏理想的、有效的治疗手段而死亡。肝细胞移植是治疗终末期肝功能衰竭的有效方法之一,却面临细胞来源缺乏、体外难以大量增殖、传代后无法保持其原有特性、免疫排斥等众多因素的限制,因此寻找新的肝细胞来源尤为迫切。而人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, HMSCs)是一类具有自我增殖和分化潜能的多能干细胞,因其具有可塑性、取材方便、低免疫原性以及易于外源基因的转染和表达等优点而被广泛用于肝脏疾病的研究。近年研究表明,在适宜的微环境下,HMSCs具有向肝样细胞分化的潜能,使其在肝细胞治疗的临床应用中越来越受到人们的重视,也为临床上应用HMSCs移植治疗肝损伤和急慢性肝功能衰竭展示了一个可喜的前景。当前,HMSCs移植被认为有可能替代原位肝移植(orthotopic liver transplantation, OLT),为肝衰竭的有效治疗带来新的希望。因此,本实验主要研究HMSCs在体外定向诱导分化为肝样细胞的能力,实验内容大致分为两部分：第一部分主要通过研究HMSCs的生物学特性,建立分离培养和扩增细胞的方法,为以后的研究提供足够的细胞来源；第二部分主要研究利用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)以及HGF+EGF联合诱导HMSCs向肝细胞方向分化,并采用免疫细胞化学染色、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)及酶联免疫吸附法(ELISA)等技术鉴定细胞分化能力,试图为自体骨髓间充质干细胞移植治疗终末期肝病的临床应用提供理论依据。第一部分人骨髓间充质干细胞的生物学特性目的建立HMSCs体外分离培养和扩增的方法,研究HMSCs的生物学特性,为利用HMSCs作为种子细胞治疗失代偿性肝硬化等终末期肝病提供实验基础。方法采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养HMSCs,测定其接种贴壁率；在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；并应用流式细胞仪测定细胞表面标记物鉴定所培养的细胞。结果HMSCs体外培养生长状况良好,具有活跃的增殖能力,接种12h后细胞贴壁率达95%以上,细胞外观呈纺锤形、长梭形和多角形等,第4 d细胞数量开始增多,以克隆集落方式增殖,细胞形态呈长梭形,细胞排列成漩涡状,细胞间界限不清,10-14d铺满瓶底；培养的HMSCs阳性表达β1-整合素CD29(99.4%)和基质受体CD44(97.2%),阴性表达造血细胞标志CD34(4.7%),CD45(5.6%)。结论HMSCs是区别于人骨髓中造血干细胞的另一类细胞,通过密度梯度离心联合贴壁筛选法可在体外培养出高纯度的HMSCs,获得的HMSCs在体外生长稳定,且增殖较快,可作为组织工程的种子细胞。第二部分体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化目的探讨HGF和EGF体外诱导HMSCs向肝样细胞分化的可行性,为生物人工肝及肝细胞移植寻找理想的种子细胞。方法取食管癌手术患者肋骨,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法获取HMSCs。取第3代HMSCs,分为4组,肝细胞生长因子组(A组)加入20μg/L HGF,表皮细胞生长因子组(B组)加入20μg/L EGF,联合组(C组)同时加入20μg/LHGF和20μg/L EGF,空白对照组(D组)不加任何生长因子。倒置显微镜下观察细胞形态的变化,在诱导7、14d RT-PCR检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)和白蛋白(albumin, ALB) mRNA的表达,诱导7、14、21、28d免疫细胞化学染色检测AFP,细胞角蛋白18 (cytokeratin 18, CK18)及诱导7、14、21dELISA检测培养上清液中ALB水平。结果HGF组、EGF组、联合组HMSCs诱导后向肝样细胞转化,细胞形态由长梭形变为类圆形或多角形,诱导第7,14d AFP、ALB mRNA均呈阳性表达；空白对照组未见多角形细胞,AFP、ALB mRNA均呈阴性表达；免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达,并以时间依赖方式产生ALB,且细胞上清液ALB的含量在A、B、C叁组间的差异有显着性意义(F=9160.446,P=0.000),而空白对照组则没有检测到上述指标。结论HGF、EGF以及二者联合均具有诱导HMSCs向肝样细胞分化的能力,以HGF+EGF诱导HMSCs分化为肝样细胞的阳性率最高,两者具有一定程度的联合作用。通过以上实验研究,我们掌握了HMSCs的体外分离培养和扩增的方法,证明了HMSCs具有干细胞自我更新和强大复制能力的生物学特性,具备种子细胞的先决条件；而经过HGF和EGF体外诱导后的HMSCs不但在形态上转变为肝样细胞,而且还能分泌肝细胞特性蛋白,如AFP和ALB,因此,我们初步认为HMSCs具有向肝细胞分化的能力,将HMSCs用于细胞移植治疗,具有非常重要的理论研究意义和临床价值。
谢树才, 张剑权, 蒋锡丽, 周帅[3]2016年在《骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方法及机制研究与进展》文中研究说明背景:已有多项研究证明骨髓间充质干细胞可以跨胚层分化为肝细胞,其向肝细胞定向诱导分化的方案很多,但其具体的分子机制目前尚不清楚。目的:综述骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方案及分化机制。方法:检索CNKI数据库、维普、万方和Pub Med数据库2004至2015年期间关于骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的文章。检索词分别为"肝细胞(肝样细胞),骨髓间充质干细胞,诱导分化"和"hepatocyte(-like)cells,bone marrow mesenchymal stem cells,differentiation"。最后选择62篇文章纳入结果分析。结果与结论:骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方案很多,但其具体的分化机制仍不甚清楚,目前国内外研究较多的主要有Notch信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、P38信号通路、miR-122及钙离子的影响等;骨髓间充质干细胞定向分化的成熟肝细胞为肝细胞移植和人工肝提供了理想的细胞来源,从而使肝细胞移植和人工肝运用于临床治疗终末期肝病提供了新的策略。
李振宇[4]2015年在《树鼩骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的研究》文中提出目前治疗各种因素导致的重症肝病的最好手段一直是原位肝移植,但长期以来肝供体的缺乏和免疫排斥引起的一系列问题极大的限制了该手术的运用,同时,基于原代肝细胞难于培养且易在培养过程中变异的特性,制约了其在肝脏相关药物的筛选中的作用,而随着骨髓间充质干细胞的研究的深入,越来越多的证据表明骨髓间充质干细胞具有向肝细胞分化的潜能。因此,骨髓间充质干细胞诱导分化而成的肝样细胞在再生医疗和药物筛选领域具有较好的运用前景。而树鼩作为一种新型的实验动物,目前尚无该方面的报道,因此为将树鼩骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞,我们从幼年中缅树鼩骨髓中分离并经成脂和成骨诱导验证后获得了纯度及活性较高的树鼩骨髓间充质干细胞,并对树鼬骨髓间充质干细胞的培养方法进行了改进。同时我们从树鼩肝组织中克隆得到了HGF全长编码序列并进行分子特征分析,确定了树鼩HGF与人的相似性,并在上面两项基础上,采用叁步诱导法(EGF、bFGF; bFGF、HGF、尼克酰胺；OSM、Dex、ITS+premix)成功将树鼩骨髓间充质干细胞诱导成了肝样细胞,从而为树鼩在药物筛选和肝脏疾病干细胞移植治疗研究奠定了实验基础。
熊剑勇, 陈斌, 倪勇[5]2010年在《体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化:肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子的作用》文中研究指明背景:研究证实人骨髓间充质干细胞能够诱导分化为肝样细胞,但其具体生物学特性及分化机制尚不清楚,且诱导分化培养体系尚不成熟。目的:探讨肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性。方法:取食管癌手术患者肋骨,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法获取人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子的表达。取第3代人骨髓间充质干细胞,分为4组,肝细胞生长因子组加入20μg/L肝细胞生长因子,表皮细胞生长因子组加入20μg/L表皮细胞生长因子,联合组同时加入上述两种生长因子,空白对照组不加任何生长因子。倒置显微镜下观察细胞形态的变化,诱导7,14dRT-PCR检测甲胎蛋白与白蛋白mRNA的表达。结果与结论:人骨髓间质干细胞不表达造血细胞标志CD34,CD45,强表达β1-整合素CD29和基质受体CD44。肝细胞生长因子组、表皮细胞生长因子组、联合组诱导后,细胞形态由长梭形变为类圆形或多角形,诱导第7,14天甲胎蛋白、白蛋白mRNA均呈阳性表达;空白对照组未见多角形细胞,甲胎蛋白、白蛋白mRNA均呈阴性表达。证明肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子以及二者联合均具有诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的能力,至于二者联合是否能增强其分化能力尚待进一步免疫细胞化学染色定量分析予以验证。
于俊兰[6]2004年在《骨髓间充质干细胞向肝样细胞诱导分化的体外研究》文中认为目的：利用小鼠2／3肝部分切除术(PH)后36小时再生肝组织浸出液及肝细胞生长因子(HGF)、表皮细胞生长因子(EGF)，探讨骨髓间充质干细胞体外定向肝样细胞分化的诱导条件，为肝组织工程的构建开辟种子细胞来源的新途径。 方法：采用Ficoll梯度离心和贴壁分离方法，获得昆明(I(M)小鼠骨髓间充质干细胞，在基础培养液中，分别应用2／3肝部分切除术(PH)后36小时小鼠再生肝组织浸出液、肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)、以及叁者联合刺激诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向肝样细胞分化。在倒置显微镜下动态观察细胞形态学的改变，应用免疫荧光法(immunofluorescence)进行肝细胞特异性标志物CK8、CK18和白蛋白检测以鉴定细胞性质。 结果：骨髓间充质干细胞(BMSCs)经2／3肝部分切除术(PH)后36小时小鼠再生肝组织浸出液、肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)、以及叁者联合刺激诱导后变为肝细胞样圆形，1-2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK8、CK18和白蛋白，浸出液与两种细胞生长因子联合诱导组表达升高。 结论：研究结果表明，在体外利用小鼠2／3肝部分切除术(PH)后36小时再生肝组织浸出液、肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)、以及叁者联合均可诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞方向分化。再生肝组织浸出液与EGF、HGF联合定向诱导有协同诱导作用。为肝组织工程的构建开辟了种子细胞来源的新途径。
朱华民[7]2010年在《两种细胞因子组合诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞分化的研究》文中指出目的：本实验旨在探讨一种操作简单、费用低廉、结果可靠的人脐带间充质干细胞分离培养方法,为体外增殖提供一种可行的途径；对分离的人脐带间充质干细胞进行体外多细胞因子诱导,促使其向有功能的肝样细胞分化。方法：1、Ⅳ型胶原酶消化+差速贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞,进行体外传代,用流式细胞技术进行细胞表面抗原分析、细胞周期测定；作生长曲线；做功能鉴定(检测其成脂、成骨分化能力)。2、选取培养第3代的脐带间充质干细胞,分4组培养：实验组(含HGF+EGF培养基组)；对照组(含有HGF培养基组、含EGF培养基组、不加生长因子的DMEM/F12培养基对照组)。HGF (Hepatic growth factor)联合EGF(Epidermal growth factor)对体外培养的MSCs诱导分化,实验评估：用倒置相差显微镜、荧光显微镜、原子力显微镜做形态学观察；细胞免疫组化、免疫荧光、PAS糖原染色检测肝样细胞特异性抗原；RT-PCR检测肝样细胞特异性mRNA表达；采用溴甲酚绿法检测培养上清液中白蛋白(ALB)水平。结果：1、体外培养的原代MSCs24小时内可见贴壁细胞,3天左右达到汇合,传代后,表面标志表达：人脐带间充质干细胞表面不表达造血标志CD34,低表达内皮细胞标志CD106(17.1%),高表达CD29(β1-整合素)和基质受体CD44,阳性率分别为99.3%和99.6%,表明间充质干细胞是区别于人组织造血细胞的另一类细胞。细胞周期检测结果显示：第3代人脐带间充质干细胞92.2%处在G0/G1期,4.1%细胞处在G2期,3.7%处在S期,说明符合间充质干细胞生长特性。多向分化潜能：人脐带间充质干细胞在脂肪诱导分化液内培养叁四天,胞浆中即可出现折光性很强的脂肪空泡,诱导10d左右细胞形态逐渐发生变化,由细长梭形变为矮胖梭形、椭圆形、圆形,油红O染色后胞浆中呈现红色颗粒,说明人脐带间充质干细胞在体外有向脂肪分化的能力；而未诱导的细胞无此变化。在向成骨分化的培养体系内培养4周后,细胞形态逐渐发生变化,由长梭形渐变为立方形,有聚集倾向,2周时细胞爬片经碱性磷酸酶染色后,立方形、多边形细胞的胞浆染成棕黑色；而未诱导的细胞无此变化。2、HGF联合EGF对体外培养的MSCs进行诱导分化：倒置相差显微镜观察显示实验组诱导培养的MSCs逐渐向类肝细胞形态转变,由刚开始的梭型,变为椭圆型、类圆形,增殖速度减慢,而对照组细胞的形态基本不变。细胞免疫组化、免疫荧光鉴定实验组细胞10天可检测到ALB、AFP、CK18表达,对照组在以上时间点未检测到上述指标。RT-PCR结果显示诱导第1Od,AFP,ALB的mRNA均呈阳性表达；诱导第20d,ALB仍为阳性表达,而AFP则不表达；空白对照组AFP、ALB始终不表达,反映了肝样细胞的形成和成熟过程。ELISA检实验组测培养上清液中清蛋白含量在诱导组4、8、12、16 d上清液中清蛋白的含量呈时间依赖性增加。对照组间充质干细胞没有分泌清蛋白。结论：人脐带中含有丰富的间充质干细胞,其具有较强的多向分化潜能,经肝细胞生长因子与表皮生长因子联合诱导后,易向肝样细胞分化,具有肝样细胞部分功能。
陈建锋[8]2006年在《人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的体内外实验研究》文中指出研究背景 肝脏疾患是影响人类生活质量和生命健康的重要疾病之一。不管其病因如何，这些疾病都将逐渐发展，演变为肝纤维化或肝硬化，最终出现肝脏功能衰竭。对于各种类型的终末期肝病，肝移植在理论上应该为最理想的治疗选择。但由于供体缺乏及保存供体的时间限制的原因，很多病人在等待肝移植的过程中即死亡。 生物人工肝系统能使终末期肝病病人桥接肝移植。肝细胞具有强大的再生能力，临时应用生物人工肝系统也可以解决急性肝功能的失代偿，促进肝细胞再生，肝功能可以暂时恢复，争取到等待肝移植的时间。经过几十年的研究，生物人工肝系统已从非生物型、生物型人工肝系统发展到混合型人工肝系统，国内外已经有不少种类的人工肝系统应用于临床。肝细胞是生物人工肝系统的主要生物成分，生物人工肝系统的支持作用主要来源于肝细胞的生物代谢功能。然而肝细胞不易在体外培养生长，如何获得高质量、来源丰富的肝细胞是生物人工肝和干细胞移植面临的共同问题。 目前肝细胞来源主要是人源性肝细胞和动物源性肝细胞，但都各有不同的缺陷。最为理想的是能在体外培养且保持肝细胞特性和功能的肝细胞，这种细胞必须具有合成代谢、解毒和生物转化功能并能长期存活，可以大量扩增，解决
范敬静[9]2011年在《大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞诱导分化及对急性肝衰竭的治疗作用》文中提出目的:(1)探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向肝样细胞的诱导方法,观察BMSCs向肝样细胞分化的能力;(2)探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对急性肝衰竭大鼠的治疗作用。方法:(1)采用全骨髓贴壁培养法分离、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,培养至第3代时用肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)和成纤维生长因子4(Fibroblast growth factor-4,FGF-4)联合诱导大鼠BMSCs向肝样细胞分化,于诱导7、14、21d后收集细胞,观察细胞形态变化及肝细胞相关标志的表达。应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞白蛋白(Albumin,ALB)、甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)的mRNA表达,并于诱导7、14、21d进行PAS糖原染色,诱导14、21d后免疫细胞荧光方法检测白蛋白的表达,以验证诱导分化结果;(2)以四氯化碳作为肝脏毒剂,构建SD大鼠急性肝衰竭模型。在造模成功的24h后,以2×106/ml的剂量分别将诱导及未诱导的BMSCs经尾静脉注入同种大鼠体内。肝衰竭模型组注入等量的生理盐水。严密观察各组大鼠的饮食、活动及死亡情况,并分别在移植后3、7、14d处死,留取肝脏和血清标本,评价肝功能的恢复情况。结果:(1)随着诱导时间的延长,骨髓间充质干细胞表现出肝细胞样特征,出现类圆形细胞,并呈集落生长,肝细胞特异性标志物逐渐出现和成熟。诱导至7d出现AFP(mRNA)表达,14d表达增高,21d时表达下降。CK18、ALB(mRNA)和糖原l4d时出现表达,并随时间延长表达逐渐增强。免疫细胞荧光检测发现,细胞诱导14d时,胞浆ALB出现表达,至21d时,ALB表达增强;(2)不同剂量的CCl4可导致不同程度的肝损伤,而50% CCl4 4ml/kg的剂量较好地模拟了急性肝衰竭的病理生理改变且稳定性较好。移植BMSCs后3～14d在移植组大鼠肝脏内均能检测到DAPI阳性移植细胞。移植组恢复情况明显优于对照组,诱导细胞组情况稍好于未诱导细胞组。结论:(1)骨髓间充质干细胞在HGF、FGF-4及多种因子的诱导作用下,具有强大的向肝细胞分化的能力;(2)经尾静脉移植的BMSCs可促进急性肝衰竭大鼠的肝功能恢复。
杜超, 蒋明德, 曾维政, 高勇[10]2013年在《红景天苷与淤胆血清诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化》文中认为背景:大量实验证实骨髓间充质干细胞在诱导因子及特定微环境下可诱导分化为肝细胞,并已广泛用于终末肝病的临床替代治疗,而其最佳诱导条件目前尚不清楚。目的:初步探讨中草药红景天苷联合淤胆大鼠血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性和有效性。方法:采用全骨髓贴壁培养法从大鼠骨髓中获取骨髓间充质干细胞,流式法检测干细胞表型;胆总管结扎切断法制备大鼠淤胆血清。取第3代骨髓间充质干细胞分3组体外诱导培养:空白对照组,基础培养基+5%淤胆血清;红景天苷组:基础培养基+5%淤胆血清+30μmol/L红景天苷;阳性对照组:基础培养基+5%淤胆血清+20μg/L肝细胞生长因子;观察各组诱导培养过程中细胞形态变化,RT-PCR法、Western-Blot法检测各诱导组肝细胞特异性蛋白表达水平。结果与结论:骨髓间充质干细胞高表达CD90、CD105,不表达CD45、CD14、CD34、CD79a;空白对照组、红景天苷组、阳性对照组细胞在诱导培养中均出现多角及双核细胞;空白对照组、红景天苷组、阳性对照组在诱导培养7 d开始出现甲胎蛋白、白蛋白的mRNA及蛋白表达;在同一时间点空白对照组表达率最低(P<0.05),红景天苷组、阳性对照组间比较,差异无显着性意义(P>0.05)。与传统淤胆血清体外诱导相比,红景天苷联合淤胆血清能更有效诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化。
参考文献：
[1]. 骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的研究进展[J]. 李振宇, 陈玲霞, 尹博文, 代解杰. 实验动物科学. 2015
[2]. 体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究[D]. 熊剑勇. 南方医科大学. 2010
[3]. 骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方法及机制研究与进展[J]. 谢树才, 张剑权, 蒋锡丽, 周帅. 中国组织工程研究. 2016
[4]. 树鼩骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的研究[D]. 李振宇. 北京协和医学院. 2015
[5]. 体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化:肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子的作用[J]. 熊剑勇, 陈斌, 倪勇. 中国组织工程研究与临床康复. 2010
[6]. 骨髓间充质干细胞向肝样细胞诱导分化的体外研究[D]. 于俊兰. 中国人民解放军军医进修学院. 2004
[7]. 两种细胞因子组合诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞分化的研究[D]. 朱华民. 暨南大学. 2010
[8]. 人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的体内外实验研究[D]. 陈建锋. 第一军医大学. 2006
[9]. 大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞诱导分化及对急性肝衰竭的治疗作用[D]. 范敬静. 福建医科大学. 2011
[10]. 红景天苷与淤胆血清诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化[J]. 杜超, 蒋明德, 曾维政, 高勇. 中国组织工程研究. 2013
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