中南大学湘雅医院眼科 长沙 410008
【摘 要】目的 探讨两种提纯SD大鼠视网膜Müller细胞培养方法的效率。方法 采用完全胰酶消化传代法和反复不完全胰酶消化传代法对SD大鼠视网膜Müller细胞进行纯化培养，1个月后行荧光激活流式细胞分选、RT-PCR和免疫荧光细胞化学检测，对Müller细胞的阳性率及纯度进行统计学分析。结果 荧光激活流式细胞分选检测显示，完全胰酶消化传代法获得视网膜Müller细胞的纯度为73.59%，而反复不完全胰酶消化传代法获得视网膜Müller细胞的纯度高达98.32%；荧光显微镜10倍下各分别选取10个非重叠视野，计算表达GS的细胞阳性率。完全胰酶消化传代法GS阳性表达率为83.2%±5.16%，反复不完全胰酶消化传代法GS的阳性表达率为98.5%±1.08%，采用两样本近似t检验统计学分析，t=-8.94，P<0.005，两种方法差异有统计学意义。结论 反复不完全胰酶消化传代法更易获得高纯度的Müller细胞，具有细胞密度大、数量多、耗时短且细胞分布均匀等特点，该方法法是一种简单、快速、有效的原代细胞培养技术，可推广应用。
【关键词】传代；纯化；视网膜Müller细胞；胰酶消化
Study of Purification culture of SD rat retinal retinal Müller cells
WANG Yu-jue，LI Xin，ZHANG Xue-yong
（Department of Ophthalmology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan Provice，410008，P.R.China，）
Abstract：【Objective】 To compare the efficiency of two methods of purity culture of SD rat retinal Müller cells in vitro. 【Methods】 To purify SD rat retinal Müller cells，traditional pancreatic enzyme passage method and novel repeated pancreatic enzyme passage method were adopted，respectively. A month later，retinal Müller cells was detected by fluorescence-activated cell sorter（FACS），immunohistochemistry technology and RT-PCR to determine the purity. The purity of Müller cells cultured through two methods mentioned above was analyzed by SPSS13.0. 【Result】 FACS showed that the purity of Müller cells from traditional pancreatic enzyme passage method（Group A）was 73.59%，but from repeated pancreatic enzyme passage method（Group B）was 98.32%. Under the fluorescence microscope，about 81.8%±4.87% of the cells were GS positive in Group A，and about 97.6%±1.21% of the cells were GS positive in Group B. The two-sample approximate test analysis demonstrated that the difference between group A and group B was statistically significant（t=-8.94，<0.005）. 【Conclusion】 Repeated incomplete pancreatic enzyme passage method is a more simple and efficiently way to purify retinal Müller cells.
Keywords：passage；purification；retinal Müller cell；trypsinization
Müller细胞是人和哺乳动物视网膜中最主要的神经胶质细胞，该细胞从内界膜延伸到外界膜，贯穿于整个视网膜，其突起广泛分布于视网膜内各类神经元胞体和纤维之间，与各神经元密切接触，使得其在维持视网膜神经元正常功能中发挥着重要的作用[1]。近年来大量研究表明，视网膜Müller细胞是一种潜在的视网膜干细胞（Retinal Progenitor Cells，RPCs）。哇巴因、NMDA所致的视网膜损伤可分别诱导斑马鱼[2，3]、小鸡[4]和成年鼠[5]的视网膜Müller细胞去分化，获得干细胞的特性，因此视网膜Müller细胞可能成为视网膜神经元再生的重要细胞来源。如何在体外快速纯化视网膜Müller细胞对于今后研究视网膜神经元细胞的再生具有重要意义。目前对鼠视网膜Müller细胞提纯方法主要有组织块法和胰酶消化传代法。胰酶消化传代法经过改良又分出两种方法：完全胰酶消化传代法和反复不完全胰酶消化传代法。由于组织块法获得高纯度Müller细胞的周期长、数量少，其优势明显劣于后两种，我们通过后两种方法进行对比研究发现，反复不完全胰酶消化法更容易获得稳定的Müller细胞，并且纯度高，周期短。
1.材料与方法
1.1实验动物 出生后20d的SPF级SD大鼠20只，由中南大学湘雅医学院动物提供。
1.2主要试剂与仪器 DMEM培基（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）（Hyclone公司）；牛血清白蛋白（BSA）（Sigma公司）；青链霉素混合液（100×）（Gibco公司）；0.25%胰酶细胞消化液（含0.05%EDTA）（Sigma公司）；兔抗大鼠谷氨酰胺合成酶（GS）抗体（Sigma公司）；FITC标记的羊抗兔二抗（Sigma公司）；DAPI染料（碧云天生物技术研究所）；PBS缓冲液（Hyclone公司）；RT-PCR试剂盒（Takara 日本）；荧光激活流式细胞分选仪（FACS）（BD公司）；倒置荧光显微镜（LEICA DMI4000B）；Galaxy细胞培养箱（RS Biotech公司）；离心机（北京时代北利离心机有限公司）。680型全自动酶标仪（BioRad公司）；7500荧光定量RT-PCR仪（ABI公司）；DYY-7C型电泳仪（北京六一）；DYCZ-24DN型双垂直电泳槽（北京六一）。
1.3细胞培养
出生后20d的SPF级大鼠20只，拉颈处死，75%酒精浸泡消毒后无菌条件下取出眼球，PBS缓冲液清洗眼球后置于20%FBS完全培养基（含80%的DMEM，20%的FBS，100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素）的培养皿中，去除眼前节组织，用两把显微镊夹住巩膜两侧，轻轻来回牵拉数次，造成视网膜脱离，完整剥离视网膜神经上皮层，将视网膜组织放入另外一个20%FBS完全培养基的培养皿中。显微眼科剪将神网膜组织剪成小于1mm2的碎块，用巴氏吸管将剪碎的视网膜组织连同培养基一起移入15ml的离心管中，800r离心3min，弃上清，加5mlPBS缓冲液，巴氏吸管吹打，800r再次离心3min，洗去残留的培养基，弃上清，加0.25%胰酶细胞消化液2ml，巴氏吸管吹打均匀，使视网膜组织尽可能充分接触胰酶，置于37℃水浴箱中消化15min后，加20%FBS完全培基5ml终止消化，200目滤网过滤后，将过滤液移入15 ml的离心管中，800r离心3min，弃上清，加20%FBS完全培基10ml，吸管吹打后使细胞悬浮，接种于10个25mm2的培养瓶中，每瓶加1ml，然后每个培养瓶补充1ml20%FBS完全培基。10个培养瓶随机分2组：A组、B组，每组5瓶。A组采用完全胰酶消化法传代，B组采用反复不完全胰酶消化法传代。
1.3.1 完全胰酶消化传代法（A组）
8天后首次换液，PBS清洗细胞2次，洗去漂浮及贴壁不牢的细胞及碎屑，此后每2天换液一次。待细胞融合后（至少需换液4次），倾去培养基，PBS清洗2次，加入0.25%胰酶细胞消化液0.5ml，显微镜下观察，待细胞变圆，部分细胞悬浮后，加入含20%FBS的完全培养基2ml终止消化，巴氏吸管反复吹打瓶壁，使细胞完全脱离培养瓶，移入15ml离心管，800r离心3min，弃上清，加20%FBS完全培基4ml，接种于2个新的25mm2的培养瓶中，放入37℃CO2细胞培养箱继续培养，6天后换液，此后每2天换液1次，待细胞基本融合后，再次行完全胰酶消化传代，方法同前。1个月后传至第二代可获得4瓶细胞。分别行荧光激活流式细胞分选仪及免疫荧光细胞化学检测。
1.3.2 反复不完全胰酶消化传代法（B组）
6天后首次换液，PBS清洗细胞2次，洗去漂浮及贴壁不牢的细胞及碎屑，切忌用枪头强力冲洗。3天后倾去培养基，PBS清洗细胞2次后，加入0.25%胰酶细胞消化液0.3ml，显微镜下观察，待细胞开始收缩，少量细胞悬浮后，加入含20%FBS的完全培养基2ml终止消化，将培养瓶放至摇床上摇2分钟，吸除脱离培养瓶的细胞及碎屑，加入含20%FBS的完全培养基2ml继续培养。此后每2天换液一次，换液2次后细胞融合成单层细胞，再次行不完全胰酶消化，此时胰酶消化细胞的程度稍加强，待部分细胞悬浮后加入含20%FBS的完全培养基2ml终止消化，将培养瓶放至摇床上摇2分钟，将培养瓶中的液体全部移入15ml离心管，培养瓶中加20%FBS完全培养基2ml继续培养；15ml离心管800r离心3min，弃上清，加20%FBS完全培基2ml，吸管吹打后使细胞悬浮，接种于1个新的25mm2的培养瓶中，放入细胞培养箱中继续培养；待细胞融合后即行不完全胰酶消化，如此反复3遍，1个月后，由原来的1瓶细胞经反复不完全胰酶消化传代为8瓶细胞。分别行荧光激活流式细胞分选仪及免疫荧光细胞化学检测。
1.4 荧光激活流式细胞分选（FACS）检测
从A、B两组中各任取1瓶细胞，倾去培养基，PBS清洗2次，加0.25%胰酶细胞消化液0.3ml，待大部分细胞变圆后加20%FBS完全培基2ml，巴氏吸管反复吹打，将细胞完全脱离培养瓶，制成单细胞悬液。细胞计数后，4℃预冷PBS液洗1次，800r离心3min，弃上清；4%多聚甲醛固定液室温固定15min；PBS漂洗3次，800r离心3min；加入FACS Buffer液（2%BSA，0.1%TritonX-100），4℃，30min；将细胞分入3只流式管，分别标记空白管、对照管和待测管；在待测管中加入兔抗大鼠GS单克隆抗体（1：200），对照管加入PBS，空白管不加，4℃，孵育1小时。PBS漂洗2次，800r离心3min，弃上清。待测管和对照管均加入FITC标记山羊抗兔IgG（1：100），4℃，避光孵育1h；PBS漂洗3次，800r离心3min，弃上清，加500μlPBS重悬，上机检测。
1.5 RT-PCR检测
从A、B两组中各取1瓶细胞，分别进行如下操作：预冷的PBS液漂洗细胞1次，加TRIzol充分裂解细胞，然后转移至无RNA酶的1.5ml离心管中，室温静置5min；按200μl氯仿/mlTrizol加入氯仿，剧烈震荡15s后室温下静置3min；4℃，12000r离心15min，小心吸取上层水相至新的EP管中（注意不要吸到白色沉淀物）；按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5min；4℃，12000r离心10min，弃上清，可见RNA呈白色胶东状附于管底；按1ml75%乙醇/mlTrizol加入预冷75%乙醇，震荡离心管，悬浮沉淀，与乙醇充分接触进行洗涤；4℃，7500r离心5min，弃上清；将离心管倒扣在滤纸上吸干液体，冰上晾干5min；加入0.1%DEPC水20μl，使RNA溶解，紫外分光光度计定量分析RNA的纯度和浓度，RNA纯度=OD260/OD280；各取5μl总RNA，按RT-PCR试剂盒说明进行扩增，扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳，溴化已锭显色后进行图像分析。RT-PCR扩增产物序列、退火温度及片段长度见表1：
表1 RT-PCR扩增产物序列及片段长度
1.6免疫荧光组织化学检测
A、B两组中各取2瓶细胞，分别标出A1、A2，B1、B2。4瓶细胞均倾去培养基，PBS清洗细胞2次，4%多聚甲醛固定液固定15min；PBS漂洗3次，加透化封闭Buffer液（3%BSA，5%山羊血清，0.3%TritonX-100），37℃，30min；巴氏吸管吸去细胞表面的液体，A1、B1加兔抗大鼠GS单克隆抗体（1：100），A2、B2用PBS代替一抗作阴性对照，4℃过夜。次日PBS漂洗3次；A1、B1、A2、B2均加二抗FITC标记山羊抗兔IgG（1：100），37℃，1h；PBS漂洗3次，加DAPI原液5min；PBS漂洗3次，荧光显微镜下观察并照相。
1.7细胞计数及统计学方法
荧光显微镜下观察，随机选取10个非重叠视野（10×），紫外光激发下计数每个视野100个蓝色细胞核（DAPI染色），然后转换成绿色激发光，计数该区域显示绿色荧光的细胞数，计算表达GS的细胞阳性率。细胞阳性率=表达绿色荧光的细胞数/蓝色细胞核数×100%，SSPS 13.0统计软件分析，采用两样本近似t检验，取P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 Müller细胞的形态学特征
细胞接种后48小时即有部分细胞开始贴壁，细胞由圆形逐渐变成梭形，部分细胞聚集贴壁生长，而后逐渐向周围延伸生长，细胞呈扁平状；6天后大部分细胞贴壁，可见培养基中漂浮有细胞碎屑及少量未贴壁细胞，培养基颜色由红色逐渐变成淡黄色。B组细胞开始第一次换液，及时清除未贴壁细胞及死亡的细胞碎屑，更换新鲜培养基继续培养。第8天对A组细胞进行第一次换液，方法同B组。按上述方法分别对A、B组细胞进行换液传代培养，1个月后观察，两组细胞胞体呈扁平不规则状生长，胞浆丰富，核呈圆形或卵圆形，相邻的细胞相互形成网状；A、B组细胞对比发现，A组细胞形态较B组杂乱，B组细胞形态基本一致，且A组细胞密度明显少于B组（图1）。
3 讨论
Müller细胞是一种特殊类型的神经胶质细胞，在脊椎动物的视网膜中，Müller细胞占视网膜各类细胞总数的90%以上。Müller细胞形态细而长，从内界膜延伸到外界膜，贯穿于整个视网膜，胞核位于内核层的中央部。过去认为脊椎动物的视网膜神经元不能再生，近年来大量研究表明，损伤可诱导视网膜Müller细胞去分化，表现出视网膜干细胞的特性[4-5]，进而再分化成各种神经元细胞，因此Müller细胞在视网膜神经元细胞的再生研究中越来越受关注[6-8]。为了深入研究视网膜Müller细胞的特性，建立简单快速纯化视网膜Müller细胞的方法显得尤为重要。
由于视网膜组织中含有多种细胞成分，如何通过简单快速的方法对Müller细胞进行纯化是开展下一步研究工作的前提；目前国内外对视网膜Müller细胞提纯的方法主要有组织块法和酶解法；由于组织块法是将视网膜组织分离后剪成细小碎块，组织块贴壁后依赖细胞的自身爬行生长，脱离组织块，然后再进行传代提纯，此方法获得高纯度Müller细胞的量极其有限，且周期长而逐渐被弃用。酶解法即通过消化酶进行消化传代，最常用的酶为胰酶细胞消化液。胰酶消化传代法通常使用胰酶将贴壁细胞完全消化脱壁，终止消化后收集细胞离心，然后加培养基进行分瓶培养。我们对SD大鼠视网膜Müller细胞进行消化传代提纯过程中，由于胰酶消化重新接种，细胞再次贴壁所需时间较长，换液过程中大量的Müller细胞亦容易被清除，并且胰酶的消化不均匀导致大量视网膜Müller细胞破坏，尽管该方法可获得高纯度Müller细胞，但细胞量有限，导致实验进展受限。我们通过方法的改良，命名为反复不完全胰酶消化传代法；反复不完全胰酶消化传代法是利用Müller细胞贴壁快且牢固的特点，通过反复轻度胰酶消化，使其它种类的细胞逐渐得以清除，未脱壁的Müller细胞很快生长至融合状态，可快速、大量获得高纯度的Müller细胞。
分别采用完全胰酶消化传代法和反复不完全胰酶消化传代法对原代SD大
鼠视网膜Müller细胞进行纯化培养1个月后，荧光激活流式细胞分选（FACS）检测发现，A组细胞中73.59%的细胞GS表达阳性，而B组则有98.32%的细胞表达阳性，结果表明，反复不完全胰酶消化传代法较完全胰酶消化传代法更易获得高纯度的Müller细胞。SD大鼠视网膜Müller细胞的表达物主要包括谷氨酰胺合成酶（GS）、波形蛋白（Vimentin）、丛状蛋白（Clusterin）、碳酸酐酶（Carbonic anhydrase）和细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP）等，其中谷氨酰胺合成酶（GS）和波形蛋白（Vimentin）为SD大鼠视网膜Müller细胞的特异性表达物，且表达量亦最高，因此我们采用半定量RT-PCR对比两组中GS和波形蛋白的表达量。凝胶电泳图结果经灰度扫描显示，A组中GS和Vimentin的灰度值分别为152.23和58.93，B组分别为206.77和194.88，说明采用反复不完全胰酶消化传代法培养的视网膜Müller细胞的纯度高于完全胰酶消化传代法。
谷氨酰胺合成酶（GS）是一种能将谷氨酸转化为谷氨酰胺的关键酶，且仅表达于Müller细胞中[9、10]，因此我们选用GS作为Müller细胞的特异性标志物进行免疫荧光细胞化学鉴定，结果显示两种传代方法均可获得较高纯度的Müller细胞，但不完全反复胰酶消化传代法培养的Müller细胞密度大，数量多且分布均匀。两组视网膜Müller细胞的胞浆、胞核均可见大量表达GS，其胞浆丰富，细胞呈扇形贴壁生长。
荧光显微镜10倍视野下A、B两组各选取10个非重叠区域，分别计算细胞阳性率，A组GS阳性表达率为81.8%±4.87%，B组GS的阳性表达率为97.6%±1.21%，采用两样本近似t检验进行统计学分析，t=-8.94，P<0.005，两种提纯视网膜Müller细胞的方法差异有统计学意义，提示反复不完全胰酶消化传代提纯视网膜Müller细胞法是一种简单、快速、有效的原代细胞培养技术，为进一步深入研究Müller细胞提供了先决条件，可推广应用。
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论文作者:王玉珏,李歆,张雪咏通讯作者
论文发表刊物:《兰大学报（医学版）》2018年6期
论文发表时间:2018/11/20
标签：细胞论文; 视网膜论文; 培养基论文; 不完全论文; 方法论文; 荧光论文; 神经元论文; 《兰大学报（医学版）》2018年6期论文;