一、小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其重组真核表达载体的构建（论文文献综述）
马敏星[1]（2021）在《核心岩藻糖基转移酶FUT8在乳腺癌中的分子调控机制研究》文中研究说明糖基化参与癌症的许多基本分子和细胞生物学过程。其中,核心岩藻糖基化与各种癌症之间存在许多联系。目前研究发现只有一种糖基转移酶（FUT8）能催化核心岩藻糖基化。本论文首先收集参考文献和GEO数据,进行了系统的综述和荟萃分析,以阐明FUT8与恶性肿瘤的临床病理特征和生存之间的关系。接着,论文以乳腺癌为模型,对miR-10b将FUT8表达进行调控的具体机制进行探究,最终结果如下:1.使用荟萃分析发现,FUT8与某些恶性肿瘤类型和患者生存率的临床病理特征有关。首先,我们系统地鉴定了7篇文章和35个微阵列数据集（涉及6124例患者和10种肿瘤类型）以纳入荟萃分析。结果表明,FUT8表达与一种或多种临床病理参数具有显着相关性。这些参数包括患者的性别,分子亚组,组织学等级,TNM分期,雌激素受体,孕激素受体和复发状态等。其次,还发现FUT8表达水平与非小细胞肺癌,乳腺癌,弥漫性大B细胞淋巴瘤,胃癌和神经胶质瘤的总体存活率相关。FUT8表达还与非小细胞肺癌,乳腺癌和结直肠癌的无病生存率以及胰腺导管腺癌的无复发生存率相关。2.利用生物信息学方法发现大多数癌症中,FUT8在癌组织中的表达相较配对正常组织明显上调,并且乳腺癌中FUT8的表达明显高于其他岩藻糖基转移酶。其次,组织芯片和临床样本染色结果显示乳腺癌组织中FUT8的表达较正常乳腺组织为高。通过实验发现过表达FUT8能促进细胞迁移和EMT过程,而干扰FUT8的表达能抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭。3.利用体内和体外实验证明MDA-MB-231细胞中FUT8的敲低使癌细胞对阿霉素更敏感。敲低FUT8表达可减少乳腺癌细胞增殖,并增加细胞凋亡。FUT8敲低的MDA-MB-231细胞中CD44+/CD24-的干性细胞比例减少。最后,在肿瘤干细胞多次成球传代后发现:FUT8敲低的MDA-MB-231细胞成球数目明显低于FUT8表达正常组,由此可判断出此基因表达和肿瘤干细胞自我更新存在相关性。4.预测发现AP-2γ是miR-10b的生物学靶基因。利用TCGA数据库研究结果发现乳腺癌中AP-2γ低表达,而正常乳腺组织中则表达水平高;AP-2γ高表达可抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭。通过小鼠实验发现过表达AP-2γ可以抑制癌细胞FUT8表达,并且可以抑制肿瘤生长和转移。miR-10b可结合在AP-2γ的3’UTR区进而阻碍其表达。5.通过Pathway Commons预测AP-2γ可以通过STAT3/p-STAT3间接调节FUT8。过表达AP-2γ后,FUT8和p-STAT3表达显着降低;并且随着乳腺癌细胞中STAT3的磷酸化水平被逐渐抑制,FUT8的表达量逐渐下降。利用免疫共沉淀实验发现AP-2γ与STAT3间的结合更加牢固,而AP-2γ与p-STAT3之间的结合较弱。染色质免疫沉淀技术结果显示p-STAT3和FUT8启动子区域存在结合。最终发现miR-10b/TFAP2C/p-STAT3/FUT8的新型调控通路在乳腺癌中,尤其是三阴型乳腺癌中,通过调控FUT8表达,进而影响乳腺癌的增殖和转移。
冷继雄[2]（2021）在《基于细胞工程改造哺乳动物细胞生产杂合型N-聚糖》文中指出蛋白质N-糖基化修饰是真核生物中最常见的翻译后修饰之一,其影响着蛋白质的结构和功能,包括蛋白质的折叠、分子识别、稳定性以及免疫原性等。然而,在哺乳动物细胞中表达生产重组蛋白仍然面临着一些难题。其中最主要问题是重组蛋白上N-聚糖的异质性,这会对重组蛋白的功能和稳定性产生不利影响,如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用以及重组蛋白在体内的半衰期等。目前,随着基因编辑技术,细胞工程以及糖工程等多门学科的发展,可针对蛋白质糖基化位点和其上修饰的聚糖结构进行改造,来减少甚至消除N-聚糖的异质性,进而改善重组蛋白的特性。因此,构建适用于生产均一糖基化修饰重组蛋白的哺乳动物细胞表达系统已成为生物药物行业的研究热门。本研究的主要结果如下:1.基于CRISPR Cas9基因编辑技术在人胚肾细胞293（HEK293）内首先敲除N-糖基化途径中高尔基体甘露糖苷酶Ⅱ（MAN2A1/A2）,阻断复杂型N-聚糖的合成,得到双基因敲除细胞株M2D-KO。随后进一步敲除α1,6-岩藻糖基转移酶（FUT8）去除核心岩藻糖修饰,最终得到三基因敲除细胞株DF-KO。2.通过凝集素染色和细胞膜N-聚糖质谱分析技术鉴定敲除细胞株细胞膜上N-聚糖结构,结果表明两株敲除细胞均无法合成复杂型N-聚糖。双基因敲除细胞株M2D-KO细胞膜上N-聚糖以含有核心岩藻糖修饰的杂合型N-聚糖为主,而三基因敲除细胞株DF-KO细胞膜上N-聚糖以不含有核心岩藻糖修饰的杂合型N-聚糖为主。随后在两株敲除细胞株内表达分泌型重组蛋白溶酶体酸性脂肪酶（lysosomal acid lipase A,LIPA）和Fc。两种重组蛋白经纯化后,使用外切糖苷酶处理和质谱分析技术鉴定其N-糖基化修饰,结果显示M2D-KO和DF-KO细胞株表达的重组蛋白上N-聚糖分布与其细胞膜上的基本一致。3.为进一步降低DF-KO细胞株中高甘露糖型的水平,本研究分别通过在DF-KO细胞株中过表达编码曲霉Aspergillus saitoi菌株以及人源的α1,2-甘露糖苷酶的基因MsdS和MAN1A2。质谱结果显示过表达编码人源的α1,2-甘露糖苷酶基因MAN1A2降低了细胞中高甘露糖型的表达。因此,本研究成功构建了表达均一杂合型N-聚糖修饰的细胞株,为工业生产医药糖蛋白或重组蛋白提供了理论基础。
陈云[3]（2021）在《糖基转移酶GL24971的异源表达及其过表达对灵芝多糖合成的影响》文中指出真菌多糖大多从食、药用真菌中提取而来,已广泛应用于传统饮食和药物,其中灵芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharide,GLP）是应用范围较广的代表之一,具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节和肠道菌群调节的作用。灵芝多糖的合成途径较复杂,以核苷酸糖为供体的多糖的合成机制尚不清晰,因此,本研究基于前期对灵芝的全基因组序列注释和转录组水平分析,选取与多糖合成相关的葡萄糖基转移酶GL24971进行研究,初步探究葡萄糖基转移酶GL24971对灵芝发酵的影响,主要研究内容和结果如下:（1）从灵芝中获取葡萄糖基转移酶GL24971的编码基因片段,对该酶的氨基酸序列进行比对分析,发现它与其他来源的大型真菌中糖基转移酶3家族（GT3）的氨基酸序列高度相似,能催化葡聚糖链的延伸;在此基础上构建大肠杆菌重组菌株E.coliBL21（DE3）/pET28a-GL24971,实现了酶的异源表达。通过优化诱导温度、诱导剂添加浓度和表达载体,增加了目的蛋白的可溶性表达量;（2）构建灵芝过表达的重组质粒exp-GL24971-eGFP,该质粒以灵芝来源的gpdi为启动子,带有潮霉素抗性筛选标记,并将荧光蛋白eGFP与目的基因融合,作为标记基因。使用聚乙二醇（PEG）转化法将过表达质粒转化至灵芝原生质体,通过激光共聚焦显微镜观察检测到eGFP荧光信号,同时qRT-PCR检测结果表明过表达的转化菌株中目的基因的转录水平提高,选择过表达水平最高的两株灵芝转化菌株T1和T2,进一步对其展开灵芝多糖合成过程的相关研究;（3）对过表达的转化菌株进行液体发酵,探究过表达葡萄糖基转移酶GL24971对灵芝菌株多糖合成与生长情况的影响。结果表明,葡萄糖基转移酶GL24971的过表达提高了单位菌体胞外多糖的产量,最大产量为0.07 mg·mg-1,相对于原始菌株提高了132.4%,同时胞内多糖的产量降低了10.7%;葡萄糖基转移酶GL24971的过表达使得转化菌株胞外多糖组分中葡萄糖的比例增加,半乳糖的比例减少;发酵过程中,菌体形态及生长也发生改变,原始菌株菌体形态不规则,表面较粗糙,而转化菌株的菌体形态基本为球形,表面较光滑;微观形态探究结果显示,细胞壁中的几丁质和β-1,3-葡聚糖含量整体水平下降,结束发酵时,几丁质和β-1,3-葡聚糖含量分别降低了16.7%、29.3%;生物透射电镜（TEM）观察的结果表明,发酵过程中,转化菌株细胞壁的平均厚度都降低。
黄一帆[4]（2021）在《人类衍生细胞综合糖基化谱图 ——以HEK293为模式细胞的糖链预测研究》文中研究说明糖类与核酸、蛋白质、脂质并称为四大生物大分子。人体内糖基化修饰广泛参与包括信号传导在内的各项生理活动。糖类物质的代谢与受精过程、细胞分化、组织发育、免疫作用、神经系统的形成和细胞癌变等生命现象息息相关。细胞糖链结构的探索研究对理解糖链相关的生物代谢过程具有重要意义。与蛋白质和核酸相比,糖链结构复杂多变,这为糖链结构的鉴定增加难度。虽然此前预测糖链结构的相关研究降低了糖链鉴定的难度。然而这些研究仍然存在一些局限性,例如目前对于糖链结构预测的研究只停留于评估特定的糖基化修饰通路,如N-糖基化,缺乏对于整个细胞内错综复杂的糖基化修饰的全局预测。此外这类研究并未应用于人体细胞的糖基化水平分析。因此亟需开发一种更简便的分析工具,用于人体细胞糖链结构系统性的预测研究。近年来高通量测序（RNA-seq）技术逐渐成熟,利用基因转录数据进行代谢水平的预测成为可能。为了解决糖链分析研究领域的难题,本研究以HEK293为模式细胞,整合转录信息到糖基化代谢通路,将糖基化过程可视化,并探索利用转录信息预测糖链结构的新方法。本研究的目的是开发一种简单易懂的糖基化代谢通路可视化工具,构建鸟瞰式的评估体系,综合预测人类衍生细胞中糖基化基因转录水平差异对糖链结构的影响。主要研究结论如下:（1）本研究基于最新的文献报道收录951个糖基化相关基因,根据糖基化基因涉及的生物学功能分为30类,并绘制19类糖基化代谢谱图。进一步开发并构建了自动化绘图网络工具。该工具整合糖基化基因表达谱到代谢通路图中,使用箭头样式表示相关基因参与糖基化反应的详细信息,实现对糖链代谢过程的可视化,直观描述具体糖链结构的合成潜力。利用该分析工具发现HEK293细胞糖基化代谢通路图中的糖链结构与已报道的细胞糖基化能力基本一致。（2）在HEK293细胞的质谱和凝集素染色鉴定中,证实HEK293细胞能够完成多种糖基化修饰。在末端修饰糖链表位的研究中,证实代谢通路上转录丰度过低的糖基转移酶基因对糖链结构起到决定性作用。在O-糖合成途径相关的研究中发现预测结果高度拟合质谱鉴定的糖链结构种类,能够准确预测糖链合成的潜力。对人类衍生型细胞的糖基化基因表达数据库和已报道的糖链鉴定结果进一步分析,发现当预测阈值TPM为1时,本研究的预测工具能够广泛应用于人类衍生型细胞的糖链预测工作。（3）本研究使用凝集素染色技术对40株N-糖链合成缺陷的敲除细胞系组成的细胞库进行检测,证实凝集素染色分析能够捕捉到敲除细胞表面糖链结构的变化。研究发现表达高甘露糖型N-糖链的敲除细胞系表面的糖链表现出高度聚类,而且末端修饰结构中只有聚乳糖胺修饰异常上调。对其中7种具有代表性的N-糖合成相关基因缺陷型细胞系的质谱分析发现,生产高甘露糖型N-糖链的细胞系T-KO和MGAT1-KO的糖脂组分发生显着改变。通过对转录组数据的分析,发现T-KO中多个糖基化基因受到转录调控,并找到了T-KO细胞中表型发生改变的潜在原因:神经酰胺合成酶基因（CERS1）、透明质酸合成酶2基因（HAS2）、N-乙酰葡糖胺差向异构酶基因（RENBP）等转录水平显着上调。基于上述发现,本研究使用瞬时荧光定量PCR（RT-q PCR）验证了T-KO细胞中上述基因的转录上调。在随后的深入研究中发现,CERS1基因转录水平的上调增加了对应脂质底物的合成;HAS2的转录水平上调增强了细胞向胞外释放透明质酸的能力;RENBP转录水平的上调促进了Glc NAc转化为Man NAc的异构作用。结合T-KO细胞中N-糖链末端不能被修饰这一特征,本研究发现由于糖核苷酸底物UDP-Glc NAc不能被N-糖链利用而积累导致细胞压力。细胞通过适应性转录调控机制,上调HAS2、CERS1和RENBP等基因的转录水平,从而改变糖核苷酸底物的消耗途径,降低细胞内UDPGlc NAc或Glc NAc含量。（4）本研究将人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas,HPA）数据库中肝脏和小肠的转录组信息输入到糖基化代谢通路可视化工具中,证实了由于大量关键的糖基转移酶转录量低,糖基化过程受到限制。因此,肝脏细胞内O-糖种类较单一,以核心1结构及唾液酸修饰的结构为主。然而,在粘蛋白表达能力强的消化功能相关的器官小肠内,绝大多数糖基转移酶的高度表达是O-糖链结构种类丰富多样的主要原因。在37种人类组织器官O-糖相关基因的表达谱分析发现,在功能类似的器官中,如消化器官的转录模式趋近而聚类,揭示了O-糖链合成中关键糖基化酶蛋白的高度表达对消化道相关器官中O-糖链结构丰富度和复杂度的贡献。在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas Program,TCGA）数据库和基因型组织表达数据库（The Genotype-Tissue Expression project,GTEx）中人类结肠样本的转录组测序数据的分析中,成功地预测出癌变过程中糖基化修饰水平的改变。本研究工作收录了涉及糖基化的基因,通过代谢谱图描绘人类细胞糖基化过程中的详细信息,证明了转录组信息能够用于糖链结构的预测。同时转录分析能够敏锐地捕捉到细胞内受到转录调控的糖基化基因,对细胞内糖链组分发生的改变作出解释。此外本研究的网络工具可用于人类衍生型细胞的糖基化水平的预测,一方面揭示细胞分化过程中糖基化基因表达谱的改变,从而形成与器官功能相适应的糖基化差异;另一方面能够预测如癌变等病理过程前后的糖链结构变化。这一研究有望在未来为疾病的治疗和生物标记物的发现提供新思路。
徐僡[5]（2021）在《类黄酮3-O-糖基转移酶调控马缨杜鹃花色呈色的机制研究》文中研究说明马缨杜鹃（Rhododendron delavayi）,是杜鹃花目的一种常绿灌木或小乔木,其花朵色泽鲜艳,呈深红色或亮红色,具有较高的观赏价值,且其根、茎、叶、花均可药用,具有清热解毒,止血凉血、调经等多种药用价值。花色苷属于类黄酮化合物,是植物体中的一类重要次生代谢物,同时也是影响植物花色形成的最主要物质之一。在其生物合成路径中,类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶（3GT）位于该途径下游,是花色苷合成所需的关键酶,它通过对花色素进行糖基化修饰进而增加花色苷的稳定性和水溶性。对马缨杜鹃花色苷的成分分析结果表明,在其花瓣中含量最多的花色苷为3-O-糖基化花色苷,占总花色苷含量的93%以上。因此,类黄酮3-O-糖基转移酶（3GT）在马缨杜鹃花色呈色过程中发挥关键作用。因此,本文将马缨杜鹃花瓣中花色苷的定性定量分析结果与表达量分析数据相结合,利用相关性分析成功筛选并克隆得到了2条控制马缨杜鹃花色苷合成的关键类黄酮3-O-糖基转移酶基因（Rd3GT1和Rd3GT6）。表达量分析显示,Rd3GT1和Rd3GT6在马缨杜鹃各组织中均有表达,且伴随着马缨杜鹃开花过程中,Rd3GT1的表达量呈逐渐上升的趋势,而Rd3GT6则相反。随后,对Rd3GT1和Rd3GT6基因进行了理化参数、酶的催化活性位点等分析,并完成其真核表达载体与原核表达载体的构建,通过拟南芥、烟草的遗传转化与体外酶活分析验证以上两个基因参与调控马缨杜鹃花色呈色的功能。以上研究结果将为探究马缨杜鹃花色形成机制及杜鹃花色改良研究提供理论依据。主要研究结果如下:1.马缨杜鹃花色呈色关键3GT基因的筛选高效液相分析显示,在马缨杜鹃花瓣中共检测到八种花色苷,分别为飞燕草素半乳糖苷、矢车菊素半乳糖苷、飞燕草素鼠李糖苷、矢车菊素葡萄糖苷、矢车菊素阿拉伯糖苷,其余三种均为矢车菊素类花色苷衍生物。伴随马缨杜鹃开花过程中,总花色苷含量呈逐渐下降趋势,但无论在哪个开花时期,3-O糖基化花色苷的含量始终最多,可占到花瓣总花色苷含量的93.68～96.31%。随后,基于花瓣中花色苷的积累模式与类黄酮3-O糖基转移酶表达量之间的相关性分析,成功筛选出2条影响马缨杜鹃花色呈色的关键类黄酮3-O-糖基转移酶基因（Rd3GT1和Rd3GT6）。2.Rd3GT1和Rd3GT6的克隆及生物信息学分析利用RT-PCR方法成功克隆到Rd3GT1和Rd3GT6,其开放阅读框长度分别为1395 bp、1365 bp,编码465、455个氨基酸,预测蛋白大小分别为50.459 KD、49.556 KD。Rd3GT1和Rd3GT6均属于糖基转移酶GT-B超家族,含有糖基转移酶家族特有的PSPG保守结构域,也具有糖基转移酶的催化活性位点和与糖基供体相互作用的氨基酸残基。系统进化分析显示,Rd3GT1与茜草科咖啡的糖基转移酶亲缘关系最近,Rd3GT6与杜鹃花科越橘的糖基转移酶亲缘关系最近。3.Rd3GT1和Rd3GT6真核表达载体的构建及其遗传转化成功构建过表达载体pBI121-Rd3GT1、p BI121-Rd3GT6,并将其转入拟南芥3GT突变体中。结果证明,克隆得到的Rd3GT1和Rd3GT6是类黄酮3-O-糖基转移酶基因,可在植物体内发挥功能。随后,将以上两个基因转入模式植物烟草中,以验证其对花色形成的影响。结果显示,转基因烟草花瓣颜色加深,同时花色苷种类由原来的2种增加至5种,表明该基因具有调控花色苷合成的功能,可以用于植物花色的改良。4.Rd3GT1和Rd3GT6原核表达载体的构建及体外酶活检测成功构建原核表达载体pET32a（+）-Rd3GT1、p ET32a（+）-Rd3GT6,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。将制备得到的纯度较好的可溶性重组蛋白分别以矢车菊素为底物、UDP-葡萄糖为糖基供体进行酶活检测。结果显示,Rd3GT1、Rd3GT6重组蛋白均可催化矢车菊素生成相应的糖苷,证明Rd3GT1、Rd3GT6均具有类黄酮3-O-糖基转移酶的活性,为后续进行Rd3GT1和Rd3GT6的底物特异性及糖基供体特异性研究奠定了重要基础。
袁泓明[6]（2020）在《基于基因编辑技术制备CD163基因修饰猪及α-Gal/Neu5Gc/Sda缺失猪》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）是一种世界性传染病,每年都给养猪业造成巨大的经济损失。该综合症由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起;其特征表现为母猪繁殖力低,并伴随着呼吸障碍、仔猪生长缓慢、高发病率和高致死率等。目前防控PRRSV的主要方式是疫苗免疫,但由于病毒存在免疫逃逸机制和抗体依赖性增强效应,因而疫苗免疫的效果并不显着。研究表明,猪CD163是PRRSV感染宿主细胞的关键受体。CD163蛋白第五结构域（SRCR5）是介导PRRSV与宿主细胞相互作用的关键结构域。在病毒的感染过程中,SRCR5与病毒GP2a、GP4蛋白二聚体结合,从而介导PRRSV入侵宿主细胞。因此SRCR5也是制备抗PRRSV克隆猪的良好的基因操作靶点。猪与人有着高度同源的基因序列,并且与人体器官在大小、功能、解剖学特征、生理学功能等方面也具有高度的相似性;因此,猪被认为是解决人类器官短缺的最理想的异种器官移植供体。然而,在临床实验程中,猪到非人灵长动物的异种器官移植会发生严重的超级性免疫排斥反应,从而使供体器官短时间内丧失功能,造成移植失败。目前发现的可引起免疫排斥反应的猪源细胞表面抗原主要有α-Gal（α-1,3半乳糖）、Neu5Gc（N-羟乙酰神经氨酸）和血型抗原Sda。近年来快速发展的CRISPR/Cas技术以及碱基编辑技术已经成功地被应用于多种动物,包括小鼠、斑马鱼、兔、猪、羊等。该技术在动物抗病育种及异种器官移植等领域显示出其重大的应用价值。本研究旨在通过CRISPR/Cas9技术制备抗PRRSV的CD163基因修饰猪,探究BE4-Gam系统在猪基因编辑中的适用性并利用BE4-Gam系统制备α-Gal/Neu5Gc/Sda缺失猪,为今后构建异种移植抗原缺失猪提供新思考。本研究共包含三方面的实验内容。第一部分实验研究中,我们利用CRISPR/Cas9系统成功地用猪CD163SRCR3基因序列替换猪CD163 SRCR5基因序列,制备了CD163SRCR3猪;利用CRISPR/Cas9系统制备了CD163 SRCR5敲除的CD163E7D猪。后续实验结果表明,正常生理情况下,CD163SRCR3猪和CD163E7D猪两者血清中游离的Hp含量与野生型猪没有显着差异;并且CD163SRCR3猪、CD163E7D猪外周血单个核细胞（PBMCs）来源的巨噬细胞（PMMs）都具备对Hb-Hp复合物的清除能力。最后,我们分离了CD163SRCR3猪、CD163E7D猪和野生型猪来源的肺泡巨噬细胞（PAMs）用于体外感染HP-PRRSV。实时荧光定量结果显示,CD163SRCR3猪、CD163E7D猪来源的PAMs都可以有效的在体外抑制HP-PRRSV的增殖;与CD163E7D猪相比,CD163SRCR3猪来源的PAMs对HP-PRRSV的抑制作用更显着。在第二部分实验中,我们针对猪α-Gal、Neu5Gc和Sda等抗原合成基因GGTA、CMAH和B4GalNT2分别设计了一条相应的sgRNA,用以探究BE4-Gam系统在猪细胞内的适用性。实验结果表明,BE4-Gam系统在胎儿成纤维细胞（PFFs）和孤雌囊胚中GGTA1、B4GalNT2、CMAH基因目的位点分别可实现5.3%-10.1%和66.7%-71.4%的单基因编辑效率;在PFFs和孤雌囊胚GGTA1、B4GalNT2、CMAH基因目的位点分别可实现7.5%和18.1%的3基因编辑效率。同时,在实验过程中,BE4-Gam系统实现了单一的编辑产物,没有Indels现象发生。与BE4-Gam系统相比,我们进一步的研究表明AncBE4max系统在孤雌囊胚及胎儿成纤维细胞目的基因位点可以提升近5倍的单基因编辑效率,在胚胎水平可实现71.4%的3基因编辑效率。在第三部分实验中,我们利用BE4-Gam系统、SCNT技术和IVF技术获得了GGTA1、B4GalNT2、CMAH基因突变的F0代克隆猪。对F0代克隆猪的脱靶检测结果显示,在潜在脱靶位点我们未发现脱靶突变。IFA抗原检测结果也表明,我们成功制备了α-Gal、Neu5Gc和Sda同时缺失的巴马香猪仔猪。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9系统和BE4-Gam系统分别成功的制备了抗HP-PRRSV的CD163SRCR3猪、CD163E7D猪和α-Gal/Neu5Gc/Sda抗原缺失猪,为维护养猪业的稳定及生物医药的发展奠定了良好基础。本研究也证实了BE4-Gam系统在猪细胞内的适用性,为今后构建异种器官移植猪、更精确的动物性状改良及人类疾病模型的构建提供高效的技术手段。
霍海龙[7]（2016）在《版纳微型猪近交系5个潜在相关猪→人异种器官移植免疫排斥反应基因的克隆、表达及功能生物信息学分析》文中指出当前器官移植治疗疾病面临的最大问题是供体器官严重缺乏,器官衰竭患者多因无法及时得到供体器官而死亡。异种器官移植已成为目前科学界和医学界公认的解决供体器官短缺的有效途径,猪已被认为是最理想的非人灵长类异种器官移植的供体。猪→人异种器官移植的主要屏障是超急性排斥反应（HAR）,α1,3半乳糖（α1,3Gal）是引起HAR的主要抗原。临床上将清除了 α1,3Gal的猪器官移植给狒狒,仍会发生排斥反应,提示在猪体内还存在其他非α1,3Gal异种抗原。为了早日实现猪→人异种器官移植的临床应用,广大医学和科研工作者把目光转向了非α1,3Gal基因的挖掘和功能研究。本试验以有望成为猪→人异种器官移植良好供体的版纳微型猪近交系（BMI）为研究材料,以与猪→人异种器官移植免疫排斥反应潜在相关的CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALMT2等5个非α1,3Gal基因为候选基因,从分子、蛋白、细胞水平同时入手,验证这5个基因与猪→人异种器官移植免疫排斥反应的相关性。首先从mRNA水平分离并鉴定这些基因的完全CDS编码区序列,并进行免疫相关多组织转录表达水平的qPCR检测分析,获得其在mRNA水平的表达情况;然后采用Western Blot方法进一步对相同组织进行验证,获得其在蛋白水平的表达情况;构建目的基因和绿色荧光报告基因GFP的融合表达载体,转染示踪进行细胞水平的验证;并对相关蛋白质进行基本信息、特征信息、结构域、功能位点、高级结构等功能生物信息学分析。结果表明猪CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因的全长CDS序列分别为1734 bp、1590 bp、894 bp、861 bp、1509 bp,并提交到GenBank获得了认证。qPCR分析和Western Blot验证表明CMAH mRNA和OXSR1 mRNA均在颌下腺组织中表达最高;CD80 mRNA在脾组织中表达最高;ASGR1 mRNA在肝脏中特异表达,在其它组织中不表达;B4GALNT2 mRNA在扁桃体中表达最高;揭示同一基因在不同组织和不同基因在相同组织中差异表达的现象,也说明基因主要在哪些组织发挥重要的功能,为下一步深入研究提供了线索,这些重要组织将是我们后续研究该基因功能以及进行基因敲除和基因修饰研究的靶组织。构建了CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因和绿色荧光蛋白AcGFP1真核融合表达载体,并将其转染猪肾上皮PK15细胞进行瞬时表达,均检测到了绿色荧光表达。在此基础上为了研究这些猪的基因与人免疫排斥反应的相关性,将这些真核融合表达载体转染人脐静脉内皮细胞HUVEC进行表达,均检测到了稳定表达的绿色荧光,表明CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因与猪→人异种器官免疫排斥反应相关。为进一步研究这些基因在猪→人异种移植排斥反应中的分子机制奠定了基础。为深入了解基因编码的蛋白质的相关功能性质,我们对相应蛋白质进行了功能生物信息学分析,包括分析其氨基酸组成、分子式、分子量、等电点、消光系数、半衰期、原子组成、不稳定系数、脂肪指数、亲水系数等蛋白质基本信息;疏水性、跨膜结构、卷曲螺旋、信号肽、固有无序性、亮氨酸富集的核输出信号、亚细胞定位等蛋白质的特征信息;结构域和功能位点（磷酸化和糖基化）;二级结构和三级结构等。这些蛋白质的基本信息、特征信息、结构域、功能位点以及高级结构的生物信息学分析为CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2 5个蛋白质的进一步功能研究和验证提供了理论依据,也为下一步进行猪→人异种器官免疫排斥反应相关基因的联合敲除和基因修饰提供了参考数据。本研究填补了猪→人异种器官移植非超急性排斥反应α1,3Gal基因研究之外的空白,本研究结果可为版纳微型猪近交系猪→人异种器官移植利用提供基础数据资料,同时也为促进版纳微型猪近交系的开发和利用提供科学依据。
陈时锦[8]（2012）在《广西巴马小型猪α-1，3半乳糖转移酶基因过表达载体和RNAi载体的构建及其沉默效率检测》文中提出α-1,3半乳糖转移酶（α-1,3-galactosyltransferase, a-1,3GT）基因又被称为GGTA1基因,其编码的α-1,3半乳糖转移酶负责催化细胞表面Galα1-3Gal-β1-4GlcNAc-R结构的糖表位,（?）α-Gal表位合成。由于人类在进化过程中GGTA1基因失活,α-Gal表位丢失,并相应地产生了大量该表位的天然抗体,因此,α-13-半乳糖苷转移酶是异种器官移植中产生超急性免疫排斥（hyperacute rejection, HAR）的主要诱因。为探讨应用RNAi技术沉默GGTA1基因的效率,本研究针对广西巴马小型猪α-1,3GT基因,设计并构建了GGTA1基因过表达载体以及特异性RNAi干扰载体,并在细胞水平对其沉默效率进行检测,为将来进一步获得α-1,3GT基因沉默巴马小型猪,构建异种器官移植用巴马小型猪模型奠定基础。本试验根据NCBI上发布的猪α-1,3GT基因cDNA序列设计引物,且在引物上下游分别加入HindⅢ与BamHⅠ两个酶切位点。以广西巴马小型猪肝脏组织中的总RNA为模板,进行RT-PCR。产物经纯化,连接,转化和扩增后测序。测序结果显示分别成功克隆得到了广西巴马小型猪缺失第五外显子（GGTA1-1,1080bp）的GGTA1基因cDNA序列及完整的GGTA1基因cDNA序列（GGTA1-2,1116bp）;将测序正确的阳性克隆质粒pMD18-GGTA1-1、 pMD18-GGTA1-2载体经（?）pDsRed1-N1和HindⅢ双酶切,纯化连接并BamHⅠ构建及pDsRed1-GGTA1-1重组真核表达载体；最后,利pDsRed1-GGTA1-2用脂质体介导法将重组质粒导入PK-15细胞中培养,（Lipofectamine2000）经转染24h后,置于倒置显微镜下观察其在细胞中的表达情况。结果表明重组质粒的均能在PK-15细胞中表达,pDsRed1-GGTA1-1、pDsRed1-GGTA1-2为下一步进行α-1,3GT基因的沉默实验奠定基础。为了筛选能有效抑带（?）GGTA1基因表达的小干扰RNA,本研究利用RNAi技术在PK-15细胞中沉默该基因,并对其沉默效率进行了检测。首先,以pLLU2G载体为骨架,设计并构建了pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2（?）（?）pLLU2G-shGGTA1-3共3个针对巴马小型猪GGTA1基因的RNAi载体及阴性对照载体pLLU2G-shGGTA1-control。载体通过脂质体法转染PK-15细胞,以pDsRed1-GGTA1-1作为阳性对照,lipofectamine2000与DMEM分别空转作为空白对照。然后分别应用荧光定量PCR（qRT-PCR）与Western blot对其进行沉默效率检测。荧光定量PCR结果显示,pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2（?）（?）pLLU2G-shGGTA1-3抑制效率分别为85.02%、86.05%和83.85%。阴性对照pLLU2G-shGGTA1-Control、 lipofectamine2000空白对照组一与空转染DMEM空白组二无抑制效果,阳性对照组pDsRed1-GGTA1-1高表达GGTA1基因。Western blot检测结果表明,pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2和pLLU2G-shGGTA1-3这3个干扰实验组GGTA1蛋白几乎为痕量表达,这与荧光定量PCR检测结果一致。阴性对照组pLLU2G-shGGTA1、Control、lipofectamine2000空白对照组一与空转染DMEM空白组二蛋白表达水平无明显差异,阳性对照组pDsRed1-GGTA1-1中GGTA1蛋白表达水平明显高于空白对照组。以上结果表明,设计得到的GGTA1基因3个shRNA核心序列均能有效抑制GGTA1的表达,其中pLLU2G-shGGTA1-2抑制效率最高,达到86.05%,可用于沉默巴马小型猪的GGTA1基因,构建异种器官移植用的小型猪模型。
刘美,朱圣明,郑鸿,王宇,王竹,杨娅君,伍艳霞,曾养志,王艳萍[9]（2012）在《中国近交系版纳微型猪α1,3-半乳糖基转移酶基因剪接变异体的克隆及其在人类细胞中的表达》文中提出目的克隆中国近交系版纳微型猪（Chinese Banna Minipig Inbred Line,BMI）的α1,3-半乳糖基转移酶（α1,3-GT）基因并分离其剪接变异体,构建其真核表达载体并观察BMIα1,3-GT基因在人肺腺癌A549细胞中的表达和功能。方法提取BMI肝组织总RNA,RT-PCR扩增全长的α1,3-GTcDNA,并克隆到pMD18-T载体,挑选15个阳性克隆进行测序,获得GT1、GT2两种基因剪接变异体。将GT1、GT2克隆到pEGFP-N1上构建其真核表达载体,分别命名为pN-GT1、pN-GT2。将pN-GT1、pN-GT2分别转染人肺腺癌A549细胞,RT-PCR检测转染细胞中α1,3-GT mRNA的表达,倒置荧光显微镜和流式细胞术观察转染细胞上α-半乳糖基（α-Gal）的表达,流式细胞术检测人血清中IgM抗体和补体C3与转染细胞上α-Gal的结合。结果在BMI中发现了碱基长度为1116bp和1080bp的两个α1,3-GT基因剪接变异体,后者缺失了外显子5。pN-GT1或pN-GT2转染的A549细胞中,均检测到了α1,3-GT mRNA和α-Gal的表达,转染细胞膜上也检测到IgM和C3的沉积,且两种转染细胞中α-Gal的表达及IgM和C3的沉积没有差异（P>0.05）。结论成功克隆了BMI的α1,3-GT基因,并发现两种α1,3-GT基因剪接变异体。两种基因剪接变异体转染的细胞中,均检测到α1,3-GT mRNA的表达且α1,3-GT能催化合成具有生物学效应的α-Gal,这为BMI用于异种移植中涉及α1,3-GT基因操作的研究提供了基因背景资料。
喻凤[10]（2011）在《细胞表面α1,3半乳糖基化对肝癌细胞致瘤性的影响》文中认为目的:观察人肝癌细胞表面? 1,3半乳糖基（? 1,3 Gal）表位的表达对肝癌细胞生物学特性的影响以及进一步探讨利用鼠?1,3半乳糖基转移酶（α1,3 galactosyltransferase,α1,3 GT）进行肝癌基因治疗的可行性。方法:1.构建含有鼠α1,3 GT全长cDNA基因的真核表达质粒pcDNA3.1-GT:采用RT-PCR方法从小鼠心脏组织中扩增α1,3 GT基因的全长cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）内,从而构建含有全长α1,3 GT基因的重组真核表达质粒pcDNA-GT,经双酶切鉴定后,对pcDNA-GT中的目的基因进行测序。2.建立鼠α1,3 GT稳定转染的肝癌细胞株Huh7-GT:①利用脂质体Lipofectamine? 2000将pcDNA-GT转染到人肝癌细胞系Huh7中,经G418抗性筛选得到稳定转染的阳性细胞克隆,命名为Huh7-GT,同时转染空载体pcDNA3.1的稳转细胞株Huh7-pcDNA作对照;②利用RT-PCR法检测α1,3 GT mRNA在Huh7-GT中的表达;③然后利用直接免疫荧光法和流式细胞术观察α1,3-半乳糖基表位在Huh7-GT细胞表面的表达情况;④接着利用补体依赖的细胞杀伤试验观察人正常血清对Huh7-GT的杀伤效应,以进一步证实α1,3-半乳糖基表位在Huh7-GT细胞表面的表达。3.体外试验观察Huh7-GT致瘤性的变化:①利用MTT法检测Huh7-GT细胞的生长速度;②利用平板克隆形成试验检测Huh7-GT细胞克隆形成能力的变化;③流式细胞术进一步检测其细胞凋亡情况的变化。4.观察Huh7-GT在裸鼠体内的成瘤情况:取裸鼠12只,分为3组,平均每组4只,在每组裸鼠皮下分别注射Huh7-GT细胞,Huh7-pcDNA细胞和亲本Huh7细胞,观察这三组裸鼠的成瘤时间、瘤体大小和重量。结果:1.从小鼠心脏组织中扩增出一大小约1100bp的基因片段,经酶切鉴定证实该基因片段成功地克隆到真核质粒pcDNA3.1中,最后DNA测序证实该目的基因片度为全长1080bp的鼠α1,3 GT基因cDNA,遂将构建的重组真核质粒命名为pcDNA3.1GT。2.分别将pcDNA3.1-GT和pcDNA3.1空载体质粒转染Huh7细胞, G418抗性筛选后分别获得稳转细胞株Huh7-GT和Huh7-pcDNA;经RT-PCR法检测发现在Huh7-GT细胞中有α1,3 GT mRNA的表达,而在Huh7-pcDNA和Huh7细胞中没有检测到α1,3 GT mRNA的表达;直接免疫荧光法和流式细胞术观察发现在Huh7-GT细胞表面有α1,3-半乳糖基化表位的表达,Huh7-pcDNA和Huh7细胞表面没有观察到α1,3-半乳糖基化表位的表达;补体依赖的细胞杀伤试验进一步证实人正常血清对Huh7-GT有明显的杀伤效应。3. MTT法证实Huh7-GT细胞生长速度明显减慢;平板克隆形成试验发现Huh7-GT细胞单克隆形成能力减弱,流式细胞术检测发现Huh7-GT细胞凋亡增多;4.裸鼠成瘤试验发现Huh7-GT细胞组裸鼠的成瘤时间与对照组相比延长,瘤体体积和重量均小于对照组。结论:细胞表面的α1,3半乳糖基化可明显减弱肝癌细胞的致瘤性;本研究为肝癌的基因治疗提供了一条新的思路。
二、小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其重组真核表达载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其重组真核表达载体的构建（论文提纲范文）
（1）核心岩藻糖基转移酶FUT8在乳腺癌中的分子调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 蛋白质的糖基化修饰概述 |
| 1.2.1 蛋白质糖基化修饰分类 |
| 1.2.2 N-糖基化修饰 |
| 1.2.3 O-糖基化修饰 |
| 1.2.4 GPI锚定修饰 |
| 1.3 癌症中的糖基化 |
| 1.3.1 岩藻糖基化与癌症 |
| 1.4 核心岩藻糖基化 |
| 1.4.1 岩藻糖基化供体合成 |
| 1.4.2 核心岩藻糖基转移酶和催化机理 |
| 1.4.3 肿瘤相关生物学功能 |
| 1.5 乳腺癌 |
| 1.5.1 流行病学概述 |
| 1.5.2 乳腺癌病理简介 |
| 1.5.3 乳腺癌的分子分型 |
| 1.5.4 乳腺癌的分期 |
| 1.5.5 乳腺癌中的岩藻糖基化 |
| 1.6 MicroRNA |
| 1.6.1 MicroRNA概述 |
| 1.6.2 MicroRNA与糖基化 |
| 1.7 本课题的立题依据及主要研究内容 |
| 1.7.1 立题依据及研究意义 |
| 1.7.2 主要研究内容 |
| 第二章 FUT8表达与多种恶性肿瘤临床病理和预后相关性的系统评价及荟萃分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 文献检索策略 |
| 2.2.2 纳入与排除标准 |
| 2.2.3 文献质量评价 |
| 2.2.4 数据提取 |
| 2.2.5 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 文献检索与筛选结果 |
| 2.3.2 纳入研究的特征 |
| 2.3.3 FUT8 表达与各种类型恶性肿瘤临床病理特征的关系 |
| 2.3.4 FUT8 表达在各种类型恶性肿瘤生存中的预后价值 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 FUT8在乳腺癌中的表达及对细胞表型的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 TCGA数据库芯片挖掘及分析 |
| 3.2.2 乳腺癌FUTs表达芯片挖掘及分析 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.2.5 试剂配置 |
| 3.2.6 细胞培养相关 |
| 3.2.7 细胞构建 |
| 3.2.8 细胞及组织总蛋白提取 |
| 3.2.9 Western& Lectin Blot |
| 3.2.10 细胞表型相关 |
| 3.2.11 免疫组化和免疫荧光染色 |
| 3.2.12 统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 乳腺癌组织中FUT8 表达的生物信息学分析 |
| 3.3.2 乳腺癌组织中FUT8表达变化 |
| 3.3.3 FUT8 在临床组织及细胞中的表达对比 |
| 3.3.4 FUT8对MCF10A细胞运动和增殖能力的影响 |
| 3.3.5 FUT8 对乳腺癌细胞恶性行为的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 FUT8表达对乳腺癌化疗敏感性及癌细胞干性影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂和材料 |
| 4.2.2 主要设备 |
| 4.2.3 试剂配制 |
| 4.2.4 MTS检测细胞增殖 |
| 4.2.5 小鼠皮下成瘤实验 |
| 4.2.6 免疫组织化学染色 |
| 4.2.7 组织凋亡TUNEL染色 |
| 4.2.8 流式细胞仪检测CD44~+/CD24~-肿瘤细胞 |
| 4.2.9 肿瘤干细胞成球培养 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 干扰FUT8 表达促进乳腺癌MDA-MB-231 细胞化疗敏感性 |
| 4.3.2 干扰FUT8 表达对肿瘤干细胞的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 MiR-10b通过AP-2γ调节FUT8表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要试剂和材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 细胞 |
| 5.2.4 Western& Lectin Blot |
| 5.2.5 细胞构建 |
| 5.2.6 构建干扰AP-2γ的细胞株 |
| 5.2.7 免疫荧光染色 |
| 5.2.8 人乳腺癌组织芯片免疫组化染色 |
| 5.2.9 细胞划痕实验 |
| 5.2.10 Transwell迁移实验 |
| 5.2.11 细胞增殖实验 |
| 5.2.12 双荧光素酶报告实验 |
| 5.2.13 小鼠转移瘤实验 |
| 5.2.14 免疫组织化学染色 |
| 5.2.15 组织凋亡TUNEL染色 |
| 5.2.16 统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 mi R-10b的目标基因生物信息学筛选 |
| 5.3.2 人乳腺癌组织芯片检测AP-2γ的表达 |
| 5.3.3 人乳腺癌细胞中AP-2γ的表达情况 |
| 5.3.4 乳腺癌中AP-2γ表达调控FUT8 水平 |
| 5.3.5 AP-2γ对 MDA-MB-231 增殖、迁移的影响 |
| 5.3.6 AP-2γ过表达促进MDA-MB-231 在小鼠体内的转移 |
| 5.3.7 乳腺癌中mi R-10b调控AP-2γ表达 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 乳腺癌中AP-2γ通过STAT3调控FUT8的分子机制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要试剂和材料 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 试剂配置 |
| 6.2.4 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 6.2.5 染色质免疫沉淀(Ch IP) |
| 6.2.6 Western Blot |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 AP-2γ通过STAT3 介导调控FUT8 表达 |
| 6.3.2 AP-2γ与 STAT3 结合相较与 p-STAT3 更加牢固 |
| 6.3.3 p-STAT3和FUT8 启动子区域直接结合 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 课题展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间科研成果 |
| 作者介绍 |
| 1.基本情况 |
| 2.教育背景 |
| 3.攻读博士学位期间的其它奖励 |
（2）基于细胞工程改造哺乳动物细胞生产杂合型N-聚糖（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物药物与医药重组蛋白 |
| 1.1.1 生物药物简介 |
| 1.1.2 医药重组蛋白简介 |
| 1.1.3 医药重组蛋白的表达生产 |
| 1.2 蛋白质的N-糖基化与均一性糖基化 |
| 1.2.1 蛋白质的N-糖基化 |
| 1.2.2 均一性糖基化 |
| 1.3 本论文研究意义与主要内容 |
| 1.3.1 本论文研究意义 |
| 1.3.2 本论文主要内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 试剂、酶及耗材 |
| 2.1.4 主要培养基和溶液的配制 |
| 2.1.5 主要设备与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 编码α1,2-甘露糖苷酶的基因MsdS表达质粒的构建 |
| 2.2.2 贴壁型哺乳动物细胞培养 |
| 2.2.3 CRISPR Cas9基因编辑技术介导的基因敲除 |
| 2.2.4 凝集素染色分析细胞膜N-聚糖 |
| 2.2.5 质谱分析细胞膜N-聚糖 |
| 2.2.6 重组蛋白LIPA的瞬时表达与纯化 |
| 2.2.7 外切糖苷酶处理 |
| 2.2.8 重组蛋白Fc的稳定表达 |
| 2.2.9 重组蛋白Fc的纯化 |
| 2.2.10 重组蛋白上N-聚糖的质谱分析 |
| 2.2.11 蛋白质印迹法 |
| 2.2.12 MsdS的稳定表达 |
| 2.2.13 免疫荧光定位 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 HEK293野生型细胞内复杂型糖型合成的阻断 |
| 3.1.1 双基因敲除细胞株M2D-KO的构建 |
| 3.1.2 凝集素PHA-L4、ConA以及LCA分析M2D-KO细胞膜N-聚糖 |
| 3.1.3 质谱分析M2D-KO细胞膜N-聚糖 |
| 3.2 M2D-KO细胞内核心岩藻糖的去除 |
| 3.2.1 三基因敲除细胞株DF-KO的构建 |
| 3.2.2 凝集素LCA分析DF-KO细胞膜N-聚糖 |
| 3.2.3 质谱分析DF-KO细胞膜N-聚糖 |
| 3.3 M2D-KO和DF-KO细胞所表达分泌型重组蛋白上N-聚糖的鉴定 |
| 3.3.1 外切糖苷酶鉴定重组蛋白LIPA的N-聚糖 |
| 3.3.2 质谱分析重组蛋白LIPA的N-聚糖 |
| 3.3.3 质谱分析重组蛋白Fc的N-聚糖 |
| 3.4 DF-KO细胞内高甘露糖型含量的降低 |
| 3.4.1 DF-KO细胞内过表达编码α1,2-甘露糖苷酶的基因MsdS和MAN1A2 |
| 3.4.2 DF-KO细胞膜高甘露糖型含量的变化 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A:质谱数据分析结果 |
| 附录B:作者在攻读硕士学位期间发表的文章 |
（3）糖基转移酶GL24971的异源表达及其过表达对灵芝多糖合成的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 真菌多糖 |
| 1.2 灵芝多糖 |
| 1.2.1 灵芝多糖的生物活性研究 |
| 1.2.2 灵芝多糖生物活性的影响因素 |
| 1.2.3 灵芝多糖的生物合成途径 |
| 1.2.4 提高灵芝多糖产量的策略 |
| 1.3 糖基转移酶的研究进展 |
| 1.3.1 细菌中的糖基转移酶 |
| 1.3.2 植物中的糖基转移酶 |
| 1.3.3 真菌中的糖基转移酶 |
| 1.4 立题意义与研究内容 |
| 1.4.1 立题意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒与引物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌重组菌株的构建 |
| 2.2.2 大肠杆菌重组菌株的表达 |
| 2.2.3 异源表达条件的优化 |
| 2.2.4 灵芝过表达质粒的构建 |
| 2.2.5 灵芝过表达质粒的转化 |
| 2.2.6 灵芝菌株的培养 |
| 2.2.7 相对转录水平测定 |
| 2.2.8 多糖产量及单糖组分的分析 |
| 2.2.9 菌体形态分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 大肠杆菌重组菌株的构建与表达 |
| 3.1.1 目的基因的克隆与分析 |
| 3.1.2 重组菌株的构建 |
| 3.1.3 重组酶的表达 |
| 3.1.4 表达条件的优化 |
| 3.2 灵芝过表达菌株的构建 |
| 3.2.1 重组质粒的构建与转化 |
| 3.2.2 基因相对转录水平分析 |
| 3.3 过表达葡萄糖基转移酶GL24971对菌株的影响 |
| 3.3.1 菌株形态分析 |
| 3.3.2 菌球尺寸分析 |
| 3.3.3 细胞壁的变化 |
| 3.3.4 多糖产量及单糖组成的变化 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）人类衍生细胞综合糖基化谱图 ——以HEK293为模式细胞的糖链预测研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 细胞中的糖链 |
| 1.2.1 糖链的生物代谢过程 |
| 1.2.2 糖链的生物学功能 |
| 1.2.3 生物医药糖蛋白 |
| 1.2.4 N-糖基化修饰过程 |
| 1.2.5 O-糖基化修饰过程 |
| 1.2.6 糖脂 |
| 1.2.7 糖链Glc NAc末端修饰 |
| 1.2.8 SLC35C1与GDP-Fuc转运蛋白 |
| 1.2.9 HAS2 与透明质酸 |
| 1.3 鉴定糖链结构的常用方法 |
| 1.3.1 基于质谱技术的糖组学 |
| 1.3.2 基于凝集素染色技术的糖组学 |
| 1.3.3 糖链结构分析常用方法的评估 |
| 1.4 糖链研究相关的数据库工具及其标准 |
| 1.4.1 CAZy数据库 |
| 1.4.2 细胞代谢途径数据库 |
| 1.4.3 糖链符号命名法标准 |
| 1.5 哺乳动物细胞生产糖链结构的预测 |
| 1.6 细胞转录组测序技术 |
| 1.7 人类肾胚细胞HEK293 |
| 1.8 预测系统的统计学评估分析 |
| 1.8.1 二元分类器与混淆矩阵 |
| 1.8.2 ROC曲线 |
| 1.8.3 约登指数 |
| 1.8.4 F1 分数 |
| 1.9 立题依据及研究意义 |
| 1.10 本论文主要的研究内容 |
| 第二章 构建自动化绘制糖基化代谢通路网络工具 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 糖基化基因与涉及的代谢通路的信息来源 |
| 2.2.2 糖基化代谢通路图的绘制和处理 |
| 2.2.3 网络工具的搭建 |
| 2.2.4 转录丰度相关算法规定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 糖基化相关基因分类和收录 |
| 2.3.2 糖基化代谢通路途径的可视化绘制及转录信息的整合 |
| 2.3.3 网络工具的使用 |
| 2.3.4 HEK293 细胞糖基化代谢途径的可视化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 对模式细胞HEK293 糖链预测的研究分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 细胞培养的材料与方法 |
| 3.2.2 质谱实验的材料与方法 |
| 3.2.3 凝集素染色的材料与方法 |
| 3.2.4 转录组分析 |
| 3.2.5 糖基化代谢反应数学模型的建立 |
| 3.2.6 大肠杆菌培养基配制 |
| 3.2.7 构建质粒相关的试剂配制 |
| 3.2.8 大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞的制备 |
| 3.2.9 敲除质粒构建通用步骤 |
| 3.2.10 CRISPR-Cas9 系统在HEK293 细胞中进行基因敲除 |
| 3.2.11 重组质粒构建的通用步骤 |
| 3.2.12 稳定整合c DNA到 HEK293 细胞 |
| 3.2.13 流式细胞术检测抗体结合的HEK293 细胞 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 质谱技术鉴定HEK293 细胞中糖链组分 |
| 3.3.2 基于凝集素染色糖组学鉴定HEK293 细胞中糖链组分 |
| 3.3.3 基因编辑操纵糖链结构的合成表达 |
| 3.3.4 HEK293 细胞中质谱鉴定的粘蛋白型O-糖链 |
| 3.3.5 粘蛋白型O-糖链生物合成途径预测的评估 |
| 3.3.6 预测系统最佳阈值的确定 |
| 3.3.7 O-糖链代谢通路的分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 HEK293 细胞中高甘露糖型N-糖链调控的新发现 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞培养主要试剂、材料、仪器 |
| 4.2.2 质粒的构建 |
| 4.2.3 基因敲除 |
| 4.2.4 基因敲除细胞系及靶位信息 |
| 4.2.5 凝集素染色分析 |
| 4.2.6 质谱分析 |
| 4.2.7 聚类热图分析 |
| 4.2.8 转录水平分析 |
| 4.2.9 抑制剂处理 |
| 4.2.10 实时荧光定量PCR分析(RT-q PCR) |
| 4.2.11 测定HEK293 细胞分泌的透明质酸含量 |
| 4.2.12 液相色谱检测糖核苷酸 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 涉及N-糖链合成途径的基因缺陷的细胞库的分析 |
| 4.3.2 涉及N-糖链合成基因敲除的细胞系质谱组学分析 |
| 4.3.3 T-KO细胞中乳糖胺结构组分相对于野生型细胞上升 |
| 4.3.4 甘露糖苷酶-Ⅰ敲除细胞与野生型HEK293 细胞的转录组水平分析 |
| 4.3.5 敲除B3GNT5 基因验证N-糖链对糖脂组分的影响。 |
| 4.3.6 T-KO调控基因应对Glc NAc底物累积压力 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 GlycoMaple分析人类组织细胞糖基化水平 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 网络自动绘图工具可视化人类衍生细胞糖基化代谢途径 |
| 5.3.2 应用组织细胞的糖基化水平预测 |
| 5.3.3 使用GlycoMaple预测结肠癌变导致的糖链变化 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录 Ⅱ |
| 附录 Ⅲ |
（5）类黄酮3-O-糖基转移酶调控马缨杜鹃花色呈色的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 植物的花色与花色苷 |
| 1.2 花色苷 |
| 1.2.1 花色苷的结构 |
| 1.2.2 花色苷的分类 |
| 1.2.3 花色苷的生物合成 |
| 1.2.4 花色苷生物合成的影响因素 |
| 1.2.5 花色苷的功能 |
| 1.3 植物糖基转移酶研究进展 |
| 1.4 类黄酮3-O-糖基转移酶研究进展 |
| 1.5 本论文的研究意义与内容 |
| 2 马缨杜鹃花色呈色关键3GT基因的筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果及分析 |
| 2.2.1 花色苷的定性分析 |
| 2.2.2 花色苷的定量分析 |
| 2.2.3 马缨杜鹃花色呈色关键3GT基因的筛选 |
| 2.2.4 Rd3GTs在不同组织中的表达量分析 |
| 2.3 讨论 |
| 3 Rd3GTs的克隆及生物信息学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果及分析 |
| 3.2.1 Rd3GTs的克隆 |
| 3.2.2 Rd3GTs的生物信息学分析 |
| 3.3 讨论 |
| 4 Rd3GTs真核表达载体的构建及其遗传转化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果及分析 |
| 4.2.1 真核表达载体的构建 |
| 4.2.2 拟南芥3GT突变体的遗传转化 |
| 4.2.3 烟草的遗传转化 |
| 4.3 讨论 |
| 5 重组Rd3GTs蛋白的体外酶活分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 实验结果及分析 |
| 5.2.1 原核表达载体的构建 |
| 5.2.2 Rd3GTs在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达 |
| 5.2.3 Rd3GTs体外酶活检测 |
| 5.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间主要研究成果 |
（6）基于基因编辑技术制备CD163基因修饰猪及α-Gal/Neu5Gc/Sda缺失猪（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 基因组编辑技术研究进展 |
| 1.1 CRISPR系统的发展历程 |
| 1.2 CRISPR/Cas9 系统的改进及应用 |
| 1.3 单碱基编辑系统的发展历程 |
| 第2章 猪繁殖与呼吸综合征病毒受体研究进展 |
| 2.1 硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS) |
| 2.2 波形蛋白(vimentin) |
| 2.3 唾液酸黏附素(Sn) |
| 2.4 非肌性肌球蛋白重链9(MYH9) |
| 2.5 CD151 |
| 2.6 CD163 |
| 第3章 抑制PRRSV增殖相关研究进展 |
| 3.1 相关化合物对PRRSV增殖的影响 |
| 3.2 小分子RNA对 PRRSV增殖的影响 |
| 3.3 抗PRRSV克隆猪的相关研究进展 |
| 第4章 异种移植主要抗原分子相关研究进展 |
| 4.1 α-Gal |
| 4.2 Sda |
| 4.3 Neu5Gc |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 利用CRISPR/Cas9 技术制备CD163 基因修饰猪 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 BE4-Gam系统表达载体的构建及其效率验证 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 利用BE4-Gam系统制备α-Gal、Neu5Gc和 Sda缺失猪 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及攻读博士学位期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
（7）版纳微型猪近交系5个潜在相关猪→人异种器官移植免疫排斥反应基因的克隆、表达及功能生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 1 引言 |
| 1.1 器官移植简介 |
| 1.2 供临床移植的器官供体严重缺乏 |
| 1.3 异种器官移植供体的选择 |
| 1.4 异种器官移植概况 |
| 1.5 版纳微型猪近交系(BMI)是潜在的猪→人异种器官移植供体 |
| 1.6 猪→人异种器官移植免疫排斥相关基因简介 |
| 1.6.1 猪胞苷磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因研究进展 |
| 1.6.2 猪氧化应激反应1(OXSR1)基因研究进展 |
| 1.6.3 猪共刺激因子CD80 (CD80)基因研究进展 |
| 1.6.4 肝脏去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)基因研究进展 |
| 1.6.5 β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(B4GALNT2)基因研究进展 |
| 1.7 本研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 购买试剂 |
| 2.1.2.1 RNA分析所需试剂 |
| 2.1.2.2 蛋白分析所需试剂 |
| 2.1.2.3 真核表达试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.3.1 RNA分析试剂 |
| 2.1.3.2 蛋白分析试剂 |
| 2.1.3.3 真核表达试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.2 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因扩增和序列分析 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 组织总RNA的提取和制备 |
| 2.2.3 组织总RNA质量和完整性检测 |
| 2.2.4 cDNA第一链合成 |
| 2.2.5 设计并合成PCR引物 |
| 2.2.6 PCR扩增及产物检测 |
| 2.2.7 PCR产物的回收纯化 |
| 2.2.8 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2与pMD18-T克隆载体连接 |
| 2.2.9 连接产物的转化、鉴定、质粒提取和序列测定 |
| 2.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因的表达研究 |
| 2.3.1 qPCR分析基因的多组织表达情况 |
| 2.3.1.1 引物设计 |
| 2.3.1.2 qPCR表达分析 |
| 2.3.2 Western Blot (WB)检测CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2蛋白的表达 |
| 2.3.2.1 组织总蛋白的提取 |
| 2.3.2.2 BCA法测总蛋白浓度 |
| 2.3.2.3 蛋白质变性 |
| 2.3.2.4 制作SDS-PAGE凝胶 |
| 2.3.2.5 Western Blot检测 |
| 2.3.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2真核表达分析 |
| 2.3.3.1 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALMT2真核表达引物设计 |
| 2.3.3.2 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2真核表达序列扩增 |
| 2.3.3.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2真核表达产物与pMD18-T重组克隆载体的构建 |
| 2.3.3.4 pIRES2-AcGFP1质粒的扩增、提取与保存 |
| 2.3.3.5 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2与pIRES2-AcGFP1重组真核表达载体的构建 |
| 2.3.3.6 培养转染用猪肾上皮PK15细胞 |
| 2.3.3.7 真核表达重组质粒转染PK15细胞 |
| 2.3.3.8 真核表达重组质粒转染的PK15细胞中总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 2.3.3.9 半定量PCR检测BMI CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2 mRNA表达量的差异 |
| 2.3.3.10 培养转染用人脐静脉内皮细胞HUVEC |
| 2.3.3.11 真核表达重组质粒转染HUYEC细胞 |
| 2.4 蛋白质序列的生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因序列扩增与分析结果 |
| 3.1.1 组织总RNA检测结果 |
| 3.1.2 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因PCR扩增结果 |
| 3.1.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因序列测定结果 |
| 3.1.3.1 CMAH基因序列 |
| 3.1.3.2 OXSR1基因序列 |
| 3.1.3.3 CD80基因序列 |
| 3.1.3.4 ASGR1基因序列测定结果 |
| 3.1.3.5 B4GALNT2基因序列测定结果 |
| 3.2 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因的表达分析结果 |
| 3.2.1 qPCR分析的CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2 mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.1.1 qPCR分析的CMAH mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.1.2 qPCR分析的OXSR1 mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.1.3 qPCR分析的CD80 mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.1.4 qPCR分析的ASGR1 mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.1.5 qPCR分析的B4GALNT2 mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.2 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2蛋白表达情况 |
| 3.2.2.1 BCA法测总蛋白浓度标准曲线的绘制 |
| 3.2.2.2 Western Blot分析BMICMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2蛋白表达情况 |
| 3.2.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2真核表达结果 |
| 3.2.3.1 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2真核表达序列扩增结果 |
| 3.2.3.2 pMD1 8-T-CMAH/OXSR1/CD80/ASGR1/B4GALNT2(真核表达序列)重组质粒菌液PCR和双酶切鉴定结果 |
| 3.2.3.3 pIRES2-AcGFP1质粒的鉴定 |
| 3.2.3.4 pIRES2-AcGFP1、pMD18-T-CMAH/OXSR1/CD80/ASGR1/B4GALNT2(真核表达序列)真核表达序列双酶切结果 |
| 3.2.3.5 真核表达重组质粒菌液PCR和双酶切鉴定结果 |
| 3.2.3.6 真核表达重组质粒在真核细胞中的表达 |
| 3.2.3.7 细胞总RNA电泳检测结果 |
| 3.2.3.8 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2细胞mRNA表达分析结果 |
| 3.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.1 CMAH蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.1.1 CMAH蛋白质序列的基本信息分析 |
| 3.3.1.2 CMAH蛋白质序列的特征信息分析 |
| 3.3.1.3 CMAH蛋白质的结构域和功能位点分析 |
| 3.3.1.4 CMAH蛋白质结构分析 |
| 3.3.2 OXSR1蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.2.1 OXSR1蛋白质序列的基本信息分析 |
| 3.3.2.2 OXSR1蛋白质序列的特征信息分析 |
| 3.3.2.3 OXSR1蛋白质的结构域和功能位点分析 |
| 3.3.2.4 OXSR1蛋白质结构分析 |
| 3.3.3 CD80蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.3.1 CD80蛋白质序列的基本信息分析 |
| 3.3.3.2 CD80蛋白质序列的特征信息分析 |
| 3.3.3.3 CD80蛋白质的结构域和功能位点分析 |
| 3.3.3.4 CD80蛋白质结构分析 |
| 3.3.4 ASGR1蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.4.1 ASGR1蛋白质序列的基本信息分析 |
| 3.3.4.2 ASGR1蛋白质序列的特征信息分析 |
| 3.3.4.3 ASGR1蛋白质的结构域和功能位点分析 |
| 3.3.4.4 ASGR1蛋白质结构分析 |
| 3.3.5 B4GALNT2蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.5.1 B4GALNT2蛋白质序列的基本信息分析 |
| 3.3.5.2 B4GALNT2蛋白质序列的特征信息分析 |
| 3.3.5.3 B4GALNT2蛋白质的结构域和功能位点分析 |
| 3.3.5.4 B4GALNT2蛋白质结构分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 所研究基因mRNA水平的多组织表达差异分析 |
| 4.2 所研究基因对应蛋白质的组织表达分析 |
| 4.3 所研究基因细胞水平的真核表达分析 |
| 4.4 所研究基因编码蛋白质的功能生物信息学分析 |
| 4.5 问题及展望 |
| 5 小结 |
| 5.1 主要研究结果 |
| 5.2 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 在读研究生期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（8）广西巴马小型猪α-1，3半乳糖转移酶基因过表达载体和RNAi载体的构建及其沉默效率检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1、α-1,3半乳糖转移酶(GGTA1)基因研究进展 |
| 1.1 GGTA1基因定位 |
| 1.2 GGTA1的结构与功能 |
| 1.3 GGTA1与异种移植 |
| 1.4 存在的问题与发展前景 |
| 2、RNAi研究进展 |
| 2.1 RNAi发现 |
| 2.2 RNAi的作用机制 |
| 2.3 RNAi在哺乳动物中的应用 |
| 2.4 RNAi的应用前景 |
| 第二章 实验研究 |
| 试验一 广西巴马小型猪α-1,3半乳糖转移酶基因真核表达载体的构建及鉴定 |
| 1、材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌株及克隆载体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 普通试剂及来源 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 溶液与培养基的配制 |
| 2、实验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 总RNA的提取 |
| 2.3 RT-PCR扩增 |
| 2.4 PCR产物的纯化 |
| 2.5 连接pMD18-T克隆载体 |
| 2.6 pMD18-GGTA1重组质粒转化 |
| 2.7 重组质粒pMD18-GGTA1的鉴定 |
| 2.8 pDsRed1-GGTA1-1与pDsRed1-GGTA1-2载体的构建 |
| 2.9 重组质粒pDsRed1-GGTA1-1、pDsRed1-GGTA1-2在PK-15细胞中的表达 |
| 3、实验结果 |
| 3.1 广西巴马小型猪总RNA的提取 |
| 3.2 广西巴马小型猪GTTA1的RT-PCR扩增 |
| 3.3 广西巴马小型猪pMD18-GTTA1的菌液PCR鉴定 |
| 3.4 缺失第五外显子pMD18-GGTA1-1、未缺失第五外显子pMD18-GGTA1-2与pDsRed1-N_1双酶切 |
| 3.5 重组质粒pDsRedl-GGTA1-1(缺失第五外显子)和pDsRedl-GGTA1-2(未缺失第五外显子)菌液PCR鉴定 |
| 3.6 重组质粒pDsRed1-GGTA1-1和pDsRed1-GGTA1-2的双酶切鉴定 |
| 3.7 载体转染细胞的显微观察 |
| 4、讨论 |
| 4.1 序列分析 |
| 4.2 真核载体脂质体转染水平检测 |
| 5、结论 |
| 试验二 广西巴马小型猪α-1,3半乳糖转移酶基因RNAi载体的构建及其沉默效率的检测 |
| 1、材料 |
| 1.1 质粒、菌株与细胞 |
| 1.2 酶与试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.5 Western Blot主要试剂配制 |
| 2、方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 RNAi载体构建 |
| 2.3 菌液PCR筛选阳性重组子 |
| 2.4 干扰载体pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2、pLLU2G-shGGTA1-3、pLLU2G-shGGTA1-Control脂质体转染PK-15细胞 |
| 2.5 干扰载体沉默效率的检测 |
| 2.6 Western blot检测GGTA1蛋白水平的干扰效果 |
| 3、结果 |
| 3.1 pLLU2G-shGGTA1-1菌液PCR鉴定 |
| 3.2 pLLU2G-shGGTA1-2菌液PCR鉴定 |
| 3.3 pLLU2G-shGGTA1-3菌液PCR鉴定 |
| 3.4 干扰质粒转染PK-15细胞 |
| 3.5 细胞总RNA的提取 |
| 3.6 GGTA1基因与β-actin基因标准曲线的建立以及干扰载体沉默效率的检测 |
| 3.7 蛋白水平沉默GGTA1基因效率的检测 |
| 4、讨论 |
| 4.1 应用实时荧光定量PCR方法检测干扰质粒沉默GGTA1基因表达的效果 |
| 4.2 Western blot检测干扰质粒沉默GGTA1基因表达的效果 |
| 5、结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）中国近交系版纳微型猪α1,3-半乳糖基转移酶基因剪接变异体的克隆及其在人类细胞中的表达（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 动物、细胞及细菌 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 细胞培养 |
| 1.4.2 BMI α1, 3-GT cDNA的克隆及测序 |
| 1.4.3 构建BMI |
| 1.4.4 BMI α1, 3-GT基因真核表达载体的转染 |
| 1.4.5 转染细胞中α1, 3-GT |
| 1.4.6 转染细胞膜上α-Gal的表达 |
| 1.4.7 α-Gal与正常血清中IgM抗体的结合及C3补体的沉积 |
| 1.4.8 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 两种BMI α 1, 3-GT 基因剪接变异体的分离 |
| 2.2 BMI α1, 3-GT基因重组真核表达载体的鉴定 |
| 2.3 转染细胞中BMI α1, 3-GT mRNA的表达 |
| 2.4 α-Gal在人肺腺癌A549细胞膜上的表达 |
| 2.5 α-Gal与正常人血清中IgM抗体的结合及C3补体的沉积 |
| 3 讨论 |
（10）细胞表面α1,3半乳糖基化对肝癌细胞致瘤性的影响（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 真核表达载体PCDNA3.1-GT的构建和鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 小鼠А1，3-半乳糖基转移酶基因转染肝癌HUH7 细胞的功能研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 Α1,3GT 基因对人肝癌细胞裸鼠体内成瘤的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
四、小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其重组真核表达载体的构建（论文参考文献）
- [1]核心岩藻糖基转移酶FUT8在乳腺癌中的分子调控机制研究[D]. 马敏星. 西北大学, 2021(12)
- [2]基于细胞工程改造哺乳动物细胞生产杂合型N-聚糖[D]. 冷继雄. 江南大学, 2021(01)
- [3]糖基转移酶GL24971的异源表达及其过表达对灵芝多糖合成的影响[D]. 陈云. 江南大学, 2021(01)
- [4]人类衍生细胞综合糖基化谱图 ——以HEK293为模式细胞的糖链预测研究[D]. 黄一帆. 江南大学, 2021(01)
- [5]类黄酮3-O-糖基转移酶调控马缨杜鹃花色呈色的机制研究[D]. 徐僡. 贵州师范大学, 2021(09)
- [6]基于基因编辑技术制备CD163基因修饰猪及α-Gal/Neu5Gc/Sda缺失猪[D]. 袁泓明. 吉林大学, 2020(01)
- [7]版纳微型猪近交系5个潜在相关猪→人异种器官移植免疫排斥反应基因的克隆、表达及功能生物信息学分析[D]. 霍海龙. 云南大学, 2016(06)
- [8]广西巴马小型猪α-1，3半乳糖转移酶基因过表达载体和RNAi载体的构建及其沉默效率检测[D]. 陈时锦. 广西大学, 2012(03)
- [9]中国近交系版纳微型猪α1,3-半乳糖基转移酶基因剪接变异体的克隆及其在人类细胞中的表达[J]. 刘美,朱圣明,郑鸿,王宇,王竹,杨娅君,伍艳霞,曾养志,王艳萍. 四川大学学报(医学版), 2012(02)
- [10]细胞表面α1,3半乳糖基化对肝癌细胞致瘤性的影响[D]. 喻凤. 第四军医大学, 2011(04)