刘衍智1 易先锋1 纪雪亮1 蓝蔚1 范锟铻2 （通讯作者）
1.广东省工伤康复医院烧伤整形及烧伤康复科，广东广州 510440
2.深圳市第二人民医院烧伤整形科，广东深圳 518000
基金项目：广东省深圳市科技计划基金资助项目
项目编号：JCYJ20150330102720179
【摘要】目的 观察纳米银涂层中心静脉导管的体外抗菌性能。方法 采用抑菌圈实验及体外抗菌实验方法，分别测定纳米银涂层抗菌导管（实验组）和普通导管（对照组）对6种常见病原菌的抗菌效果。结果 抑菌圈实验：实验组纳米银涂层抗菌导管的抑菌圈直径(mm)明显大于对照组普通导管（P＜0.05）。体外抗菌实验：实验组纳米银涂层抗菌导管5个时相点的表面粘附细菌数均明显少于对照组普通导管（P＜0.05）。纳米银涂层抗菌导管5个时相点的表面粘附细菌数之间无显著性差异（P＞0.05）。结论 纳米银涂层中心静脉导管对各常见菌种具有强效、广谱的抗菌能力，且抗菌效果持久稳定。
【关键词】中心静脉导管相关性感染；生物膜；纳米银；抗菌导管
中心静脉导管相关性感染（central venous catheter-related infection, CVCRI）已成为医院获得性感染的重要组成部分，细菌粘附、定植于导管表面形成立体生物膜，并向血液中释放大量游离菌，导致机体反复迁延性感染，并对绝大多数抗生素耐药[1-3]；应用新型材料对中心静脉导管表面进行抗菌改性，破坏生物膜形成是治疗导管相关性感染的关键。
近年来随着纳米银抗菌材料在医学领域的发展，对其强效广谱抗菌机制的研究也逐步深入，独特的微观属性决定其抗菌活性远高于传统抗菌剂[4-5]。因此我们决定以普通导管为对照，研究新型的纳米银涂层中心静脉导管对各种常见病原体的抗菌效果。
1 材料与方法
1.1 实验材料及分组
纳米银涂层抗菌导管（实验组）：由清华大学深圳研究生院研制提供。普通中心静脉导管（对照组）：德国贝朗医疗有限公司。
1.2 实验菌种
金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌（ATCC 25922）、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌。其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌为质控标准菌株；其余均为院内感染标本中分离所得的临床菌株。以上菌种均由深圳市第二人民医院检验科提供。
1.3 实验方法
1.3.1 抑菌圈实验
①用增菌盐水将各实验菌种制备成105cfu/ml新鲜菌悬液。②十字划线法将白色念珠菌菌悬液均匀涂布到沙氏平板上；其余5种细菌菌悬液均匀涂布到各自MH平板上。③将含菌平板标记为左右对称的两部分，即抗菌导管组（实验组）和普通导管组（对照组），并在各自区域中央插入相应导管（长度约8mm）。④操作完成的平板置于37℃电热恒温箱中培养24h后，以导管中心为圆心，测量其与最近菌落间的距离（mm），可视为抑菌圈半径，乘以2即得直径。
各菌种重复5次，所得数据用±S表示，SPSS19.0统计软件进行配对t检验，P＜0.05有统计学意义。
1.3.2 体外抗菌实验
①将抗菌导管和普通导管剪成若干1cm长小段；分别浸泡入足量无菌生理盐水中；于37℃电热恒温箱中保存待用。②于24h、7d、14d、21d、28d五个时相点分别取出6支导管，放入相应1.5ml离心管中；加入等量108cfu/ml新鲜菌悬液充分浸没导管，37℃恒温培育24h。③24h后将导管取出，清洗后装入盛有1ml增菌盐水的离心管中；用高频振荡器振荡10min，使导管表面粘附的细菌充分洗脱分离，溶于增菌盐水中，形成待测菌悬液。④吸取0.2ml待测菌悬液，滴入平板上；无菌L棒将其均匀推平；37℃恒温培养24h后记录各平板上形成的菌落数。
各菌种各时相点重复实验5次，所得数据用±S表示，SPSS19.0统计软件进行配对t检验和单因素方差分析。P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 抑菌圈实验结果
金黄色葡萄球菌t=42.46, P＜0.001；表皮葡萄球菌t=5.87, P＜0.001；大肠埃希菌t=14.15, P＜0.001；铜绿假单胞菌t=16.81, P＜0.001；鲍曼不动杆菌t=28.86, P＜0.001；白色念珠菌t=13.02, P＜0.001。
2.2 体外抗菌实验结果
金黄色葡萄球菌组从第24小时到第28天 5个时相点，实验组与对照组导管表面粘附的细菌数比较，P值均小于0.05；表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌统计结果相同，5个时相点P值均小于0.05。而对各菌种的实验组及对照组不同时相点导管表面粘附的细菌数行单因素方差分析，P值均大于0.05，差异无显著性。
3 讨论
发生CVCRI时，残留在表皮层、皮脂腺和毛囊等处的致病菌从导管周围皮肤逐渐移动到导管的外表面，最终到达导管内面，首先在非特异性理化因素作用下粘附形成原始菌膜，随后细菌分泌如糖蛋白、脂多糖等细胞外基质并逐步堆积、增厚，最终形成有助于细菌存活、具有特异性三维结构的成熟生物膜[6-7]。膜中细菌通过细胞外基质的保护和免疫逃逸机制，耐药性比浮游细菌提高了1000倍以上，可不断释放出游离菌，并随导管直接进入体内导致感染。
在了解CVCRI的发病机制后，如何破坏生物膜的形成才是治疗中心静脉导管相关性感染的关键。最有效、最直接的方法就是对导管表面进行抗菌改性，使其具有抵抗病原微生物的作用；病原体无法在导管表面粘附、定植形成生物膜，也就从根本上杜绝了CVCRI的来源[8]。
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而纳米银材料独特的微观属性决定其微量高效的理化性质，不仅可释放Ag0形式的银粒子，与细菌代谢关键酶中特定的蛋白基团结合，导致菌体代谢障碍死亡；也可间接产生活性氧自由基O2-，破坏菌体遗传物质中的磷酸二酯键，引起核苷酸链的断裂，阻断复制、转录等过程而导致病原体死亡[9-10]。体外抗菌实验研究表明：纳米银制剂对多种凝固酶阴性葡萄球菌、条件致病的非发酵菌、肠杆菌属、多数真菌等都表现出强效、广谱的抗菌效果[11-13]；作为非生物源性的无机抗菌材料，目前亦未发现致病菌对纳米银产生任何耐药情况；是本次实验的理想材料。
本实验所用抗菌导管制备的另一关键步骤是将纳米银颗粒通过物理改性技术吸附在聚氨酯内部，使其免于氧化、不易脱落，在导管内外表面浇注成膜后，纳米银抗菌成分可通过扩散作用缓慢释放出来，达到长效抗菌的目的。研究表明[14]：各种导管在5天内的感染率无统计学意义， 7天左右相对安全， 2-3周后导管感染率明显上升，参照临床上中心静脉导管留置的时间，所以将试验分为24h、7d、14d、21d、28d几个阶段，能清楚的显示抗菌导管抗菌率的长期变化趋势。另据多中心调查研究显示[15-17]：皮肤表面共栖菌和院内感染常见菌为CVCRI主要致病菌种；本实验选取金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌6种，涵盖了革兰氏阳性菌（G+）、革兰氏阴性菌（G-）及真菌 ，且分为标准菌及临床菌，菌种范围广，可充分证明广谱抗菌效果。
抑菌圈实验中，抗菌导管表面附着的纳米银微粒以自身为圆心，通过琼脂缓慢扩散到平板周围区域，形成的抑菌圈直径明显大于普通导管，表现出良好的广谱抗菌效果。体外抗菌实验中，纳米银微粒使导管表面堆积的细菌浓度显著降低，不能达到形成群体效应所需的阈值，细菌粘附基因被抑制，毒力侵袭因子和降解酶等也不能表达，最终无法形成生物膜；各实验组表面粘附细菌数均明显少于对照组，表现出良好的广谱抗菌效果；随着浸泡时间延长，抗菌导管表面粘附细菌数未显著增多，表现出长效抗菌能力。
综上所述，本实验证实纳米银涂层中心静脉导管具有强效广谱、持久稳定的抗菌能力，可有效防止CVCRI的发生，为需要长期置管的患者提供了新的选择，值得在临床推广和拓展应用。
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作者简介：刘衍智，男，硕士研究生，住院医师。广东省工伤康复医院烧伤整形及烧伤康复科，
通讯作者：范锟铻，男，主任医师、硕士生导师，国际烧伤学会（ISBI）委员，广东省医学会烧伤分会常委，《中华烧伤外科杂志》通讯编委。深圳市第二人民医院烧伤整形科。
论文作者:刘衍智1 易先锋1 纪雪亮1 蓝蔚1 范锟铻2 （通讯作者）
论文发表刊物:《医师在线》2018年第13期
论文发表时间:2018/11/8
标签：导管论文; 细菌论文; 静脉论文; 纳米银论文; 葡萄球菌论文; 烧伤论文; 实验组论文; 《医师在线》2018年第13期论文;