河北省任丘市华北石油管理局总医院肾内科 河北任丘 062552）
【摘 要】目的：观察高糖培养的小鼠肾脏足细胞中凋亡发生的情况，探讨传统线粒体凋亡途径在糖尿病小鼠肾脏足细胞凋亡发生中的可能作用，以便更深入的了解糖尿病肾损伤的潜在分子机制。方法：常规培养小鼠足细胞，将分化成熟的足细胞经无血清培养基同步化12h后分为分成2组：正常糖对照组(NG)：D-葡萄糖1g／L；高糖刺激组(HG)：D-葡萄糖4.5g／L，分组干预刺激24h、48h、72h，透射电镜观察细胞超微结构改变；TUNEL法及流式细胞术检测细胞凋亡；流式细胞术检测线粒体跨膜电位；免疫细胞化学和Western blot检测足细胞中Caspase-3蛋白的表达变化；Western blot检测Cytochrome C蛋白的表达变化。结果：1、透射电镜结果显示，正常足细胞结构完整，足突形态细长、规则，基底膜无明显增厚，可见少许微绒毛、细小突起。高糖组肾小球基底膜不规则增厚，部分足突增宽、融合，近曲小管上皮细胞内可见空泡，线粒体部分嵴消失；2、流式细胞术及TUNEL法结果均显示：高糖刺激组较正常对照组细胞凋亡数显著升高；3、高糖培养组较正常对照组足细胞线粒体膜电位明显下降；4、免疫组化结果：高糖培养组细胞内Caspase-3蛋白表达明显增强，正常糖对照组仅有少量阳性表达；5、Western blot结果：高糖培养组Cytochrome C、Caspase-3表达较正常对照组增高。结论：高糖刺激的足细胞线粒体膜电位明显下降，释放到胞质中的Cytochrome C增高，Caspase-3表达上调，提示高糖刺激引起了足细胞中线粒体功能障碍，其相关凋亡途径可能参与了足细胞的凋亡过程，并在DN的发生和发展中起着关键作用。
【关键词】糖尿病肾病；线粒体功能障碍；足细胞；高糖；线粒体膜电位
【中图分类号】R318 【文献标识码】B 【文章编号】1764-8999（2015）7-0799-02
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病常见且严重的微血管并发症之一。足细胞是肾小球滤过屏障的重要成分，在维持肾小球通透性、抵抗毛细血管内的静水压、维持毛细血管襻的结构稳定等方面发挥重要作用。大量研究证实，足细胞损伤是DN发病的启动机制之一，损伤后的足细胞数量减少在肾小球硬化的发生过程中起着关键性的作用。凋亡是导致足细胞丢失的重要因素，在DN的发病机制中起着关键作用。本实验模拟体内高糖环境，观察不同时间点体外培养的小鼠足细胞的凋亡情况，并通过检测线粒体膜电位以及相关凋亡因子caspase-3、Cyt-c的表达变化，探讨线粒体功能障碍在糖尿病肾病足细胞凋亡中的作用。
1 材料与方法
1.1 足细胞培养、传代及冻存
1.1.1足细胞培养 将冻存足细胞在37℃水浴中复苏后移入培养瓶，加入含10%胎牛血清的1640 培养液，置于33℃、5% CO2培养箱中孵育使其增殖；相差显微镜观察细胞形态，细胞成熟分化后可用于实验。
1.1.2 细胞传代 将足细胞培养液以胰蛋白酶-EDTA法洗涤、消化后，高速离心，按所需的接种密度接种于培养瓶。
1.1.3 细胞冻存 以33℃培养的增殖态足细胞按照4℃30min、-20℃30-60min、-80℃过夜、液氮罐长期保存的顺序进行冻存。
1.2细胞实验分组 将实验细胞分成2组：正常糖对照组（NG）：D-葡萄糖1g／L；高糖培养组（HG）：D-葡萄糖4.5g／L，分别经细胞同步化、分组干预刺激24、48、72h后收集细胞及上清液，进行相关指标的检测。
1.3 透射电镜观察足细胞形态学改变 收集细胞干预72h后的足细胞，PBS冲洗，1000r/min离心5min，使细胞成团，小心吸取上清，加入2.5%戊二醛固定，包埋，超薄切片，透射电镜观察NG、HG组细胞的超微结构改变。
1.4 方法
1.4.1分别采用TUNEL法、流式细胞术检测细胞凋亡
1.4.2免疫细胞化学检测足细胞中Caspase-3蛋白的表达
1.4.3 Western blot检测Cyt-c、Caspase-3蛋白的表达
1.4.4流式细胞术检测线粒体跨膜电位（mitochondrial tranmembrane pitentials，ΔΨm） 收集刺激后24、48、72h细胞，制成1-2×106/ml细胞悬液，加入Rh123探针，避光孵育10min，离心（1000rpm，4min），在流式细胞仪上检测荧光强度，激发波长为470-490nm，发射波长为515-565 nm。
1.5 统计学处理
所有数据采用SPSS 13.0统计软件包进行分析。计量资料以均数±标准差()表示；组间不同时间点的比较采用析因设计的方差分析，两两比较采用LSD方法分析。统计结果以P<0.05为显著性差异判断标准。
2 结果
2.1 足细胞的形态学特征
透射电镜观察，正常足细胞结构完整，足突形态细长、规则，基底膜无明显增厚，可见少许微绒毛、细小突起。高糖组肾小球基底膜不规则增厚，部分足突增宽、融合，近曲小管上皮细胞内可见空泡，线粒体部分嵴消失。
2.2 足细胞凋亡的检测
分别采用TUNEL法、流式细胞术两种检测方法，高糖刺激组细胞凋亡率在48h时均明显高于正常对照组，并呈时间依赖性（Table 1）。
2.3 免疫细胞化学结果
免疫细胞化学显示Caspase-3在胞浆胞核均有表达，呈棕黄色颗粒状。对照组阳性表达较弱，高糖刺激后，表达增强（Fig. 1）。
3 讨论
糖尿病肾病是糖尿病严重并发症之一，其临床特征为持续性蛋白尿并进行性进展至终末期肾衰竭。诸多研究表明，足细胞结构及功能异常与肾小球滤过屏障选择渗透性的改变有关，而肾小球通透性增加、电荷屏障功能障碍，导致白蛋白滤过增加而出现蛋白尿。因而探索足细胞的发病机制、寻找有效的防治措施，成为控制和延缓糖尿病肾病进展的重要课题。
足细胞亦称肾小球脏层上皮细胞，与肾小球基底膜（glomerular basement membrane, GBM）和毛细血管内皮共同构成肾小球血液滤过屏障。在生理状态下足细胞分泌基底膜的主要组成成分、维持基底膜的正常形态，调节超滤系数、防止蛋白质丢失，抵抗肾小球毛细血管静水压、稳定肾小球毛细血管网，是维持肾小球滤过屏障结构和功能正常的主要细胞之一。足细胞过多丢失会导致足细胞脱落位点GBM的裸露，裸露区域毛细血管袢在静水压的作用下向外膨胀，裸露的GBM与肾小球壁层上皮细胞形成透明样变的粘连带，最终导致肾小球硬化[1]。
足细胞数量减少的机制尚不完全明了，研究认为凋亡是其重要原因之一[2]，而线粒体跨膜电位的耗散与线粒体通透性改变在凋亡发生过程中起重要作用[3]。细胞色素C(Cytochrome C, Cyt-c)从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。Cyt-c从线粒体释放到细胞浆后，在dATP存在的条件下能与凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating facter-1，Apaf-1)，结合，形成一寡聚凋亡体，继而激活caspase-9并促进Cyt-c、dATP、Aapf-1与caspase-9结合形成凋亡复合体；被激活的caspase-9尚可激活下游的Caspase效应分子caspase-3、caspase-6和caspase-7等，这些蛋白酶通过多种途径裂解核纤层破坏细胞结构、灭活或下调与DNA修复有关的酶，引起细胞DNA修复功能丧失、核酸内切酶激活、DNA裂解等，最终导致细胞凋亡。
在糖尿病大鼠肾损害过程中，DM组大鼠肾组织抗氧化防御能力受损，肾脏ΔΨm明显降低，证明高糖可导致线粒体发生损伤[5]。我们的研究结果显示，高糖刺激的足细胞凋亡率于48小时时较正常对照组明显升高，并随时间延长呈增多趋势。同时我们用罗丹明Rh123标记两组细胞，然后用流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化发现，结果示高糖刺激组较正常糖对照组足细胞线粒体膜电位下降，且各时间点Cyt-c、Caspase-3表达较正常糖对照组增强，提示高糖刺激足细胞后可能通过引起线粒体功能障碍，Cyt-c的释放，促发了Caspase细胞凋亡级联反应，Caspase-3凋亡途径被激活并参与了高糖诱导的足细胞凋亡机制。尽管这种作用机制尚未完全清楚，推测可能与下列因素有关：胞质及线粒体基质中Ca2+超载、氧化应激过度、能量耗竭引起线粒体功能受损，凋亡基因激活等级联反应，这些环节互为因果，形成恶性循环，最终可导致细胞受损或凋亡[6]；体内外实验中均证实，高糖可引起氧化反应簇（reactive oxygen specie, ROS）产生增多，线粒体既是ROS产生的主要部位，也是ROS攻击的首要靶点，高血糖时，ROS增多可能是线粒体损伤的主要原因，而线粒体功能障碍引起细胞凋亡又可能在糖尿病肾脏损害的发生和发展中起着关键作用。因此，保护肾脏线粒体功能，防护线粒体氧化损伤，可成为防治DN的新策略，并为临床新型药物的研发提供重要思路。
参考文献：
[1] Pavenstadt H, Kriz W, Kretzler M. Cell biology of the glomerular podoeyte. Physiol Rev, 2003, 83(1): 253-307
[2] Lopez-Neblina F, Toledo AH, Toledo-Pereyra LH. Molecular biology of apoptosis in ischemia and reperfusion. J InvestSurg, 2005, 18(6): 335-350
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[4] Zhan RZ, Wu C, Fujihara H, et al. Both caspase-dependent and caspase-independent pathways may be involved inhippocampal CA1 neuronal death because of loss of cytochrome c from mitochondria in a rat forebrain ischemia model. Cereb Blood Flow Metab, 2001, 21: 529-540
[5] 王丽, 吴晨光, 方春钱. 左旋精氨酸对糖尿病大鼠的肾脏保护作用. 江苏大学学报, 2010, 20 (1): 32-35
[6] Zhu S, Stavrovskaya IG, Drozda M, et al. Minocycline inhibits cytochrome c release and delays progression of amyotrophic lateral sclerosis in mice. Nature, 2002, 417: 74-78
论文作者:罗俊,吴晖,郭箭,赵文艳,沈毅慧
论文发表刊物:《中医学报》2015年7月
论文发表时间:2015/10/16
标签：细胞论文; 线粒体论文; 肾小球论文; 凋亡论文; 电位论文; 基底论文; 对照组论文; 《中医学报》2015年7月论文;