屈树新[1]2002年在《磷酸钙生物陶瓷骨诱导过程的早期细胞分化和骨特征蛋白表达研究》文中认为本文运用透射电镜、X射线衍射、拉曼光谱、扫描电镜和免疫组织化学等方法，结合磷酸钙生物陶瓷诱导成骨过程中组织形态学观察，着重研究了诱导成骨过程中早期间充质细胞的来源、分化、骨基质的分泌、矿化、新骨／磷酸钙界面的超微结构以及骨发生过程中特征蛋白的表达，在蛋白水平上和透射电镜下分别提供了磷酸钙陶瓷骨诱导性的新证据；同时，研究了磷酸钙骨诱导过程中骨形态发生蛋白(BMP-2和BMP-4)及受体BMPR2的表达，为确证磷酸钙陶瓷骨诱导作用和解释其机理提供了实验根据。 对磷酸钙植入狗肌肉后早期的透射电镜研究，观察到长入孔隙的微血管附近密集排列着具有丰富内质网、胞体体积较大、在形态学上类似于活跃的前成骨细胞的细胞，在新生的血管或外周有些具有不规则形态的细胞，从形态和位置推测前者后者，后者可能就是骨诱导作用所必须的可向骨组织细胞分化的间充质细胞。透射电镜观察还发现前成骨细胞和成骨细胞分泌胶原纤维。 对磷酸钙植入狗肌肉后新骨矿化和新骨／磷酸钙界面的透射电镜研究，观察到新形成的磷酸钙盐以外延生长的方式直接在磷酸钙陶瓷的表面沉积，新形成的磷酸钙盐是一种低结晶度的、非化学计量的、针状的骨磷灰石，除含有Ca和P元素外，还含有Na、K和S等元素，对新形成的骨基质的理化和微区分析表明，其组成和结构类似于骨矿物。X射线衍射、电子衍射的结果证明磷酸钙陶瓷中的β-TCP相随着植入体内时间的增加而降解；拉曼光谱分析表明磷酸钙植入体内后其表面对蛋白质的吸附，其中包括一些对细胞粘附起作用的蛋白质。上述结果表明，在蛋白质等生物分子调制下磷酸钙从陶瓷表面外延生长，可能是骨诱导过程中骨矿物形成的一种机制。 通过免疫组织化学证实了骨特征蛋白——骨涎蛋白和骨的主要有机质——Ⅰ型胶原在磷酸钙骨诱导过程中的不同时间和部位的表达，从特征蛋白表达和 四川大学博士学位论文细胞功能给出了磷酸钙陶瓷诱导成骨作用的证据，也是磷酸钙陶瓷诱导成骨过程是正常的骨形成而不是病理性钙化的一个证据。 利用免疫组织化学方法，研究了诱导间充质细胞向成骨细胞分化的典型生物化学信号分子——BMPs及其受体BMPRZ在磷酸钙骨诱导过程中的表达。证明在新骨发生之前，靠近磷酸钙陶瓷孔壁表面和一些管状组织周围有BMP－2的表达，同时长入磷酸钙陶瓷孔隙的一些体积较大、呈多边形或不规则形的细胞表达BMPRZ，表明不仅在磷酸钙陶瓷骨诱导过程中有内源性的BMPS的表达而且存在可能接受＊M卜2刺激的靶细胞：在植入6O天后的标本中，发现新生骨组织的不同部位分别有BMP－2和BMP4的表达，其强度有些差异，表明机体中不同的内源性BMPS在磷酸钙的骨诱导过程中的不同阶段可能起不同的作用。
王海力[2]2005年在《磷酸钙生物陶瓷骨诱导过程中超微结构和组织形态统计学研究》文中指出自从上世纪九十年代初,我国张兴栋与国外少数学者同时发现钙磷生物陶瓷在非骨部位的骨形成现象后,骨诱导观点经过十几年研究已经得到广泛的接受,具有良好生物活性的磷酸钙骨替代陶瓷材料的研究日益被关注。合理解释钙磷材料的骨诱导性,必须从分子生物学,基因表达,超微结构等角度进行深入研究,以了解其机理。骨诱导机理的研究,对于新一代骨诱导生物材料的研究和开发具有重要的科学意义和巨大应用前景。 目前骨诱导机理的探索和现象解释主要以光学显微镜下组织形态学的观察结果为基础。由于光学显微镜的分辨率限制,难以对新生组织各阶段的细胞形态结构以及分化过程做出准确观察,因此本文运用透射电子显微镜、扫描电镜,结合光学显微镜,对不同时期新生组织的形态学和细胞超微结构进行了观察。重点观察和研究骨诱导早期,孔隙中新生组织的长入,成骨细胞的形成,类骨质的分泌钙化,以及新骨/磷酸钙界面的结构改变等,为研究骨诱导机理提供了更充分的证据。 本实验通过生物组织超薄电镜切片技术,制作出了符合TEM检测要求的未脱钙硬组织超薄切片和半脱钙硬组织超薄切片。经TEM观察,确证成骨早期过程表现为:新生肉芽结缔组织长入材料孔隙—成纤维细胞沿孔壁生长和增殖—靠近孔壁的成纤维细胞向成骨前提细胞分化—这些早期的成骨细胞分泌胶原纤维和类骨质—类骨质中钙磷沉积形成骨基质—分化后期的成骨细胞包埋进骨基质中形成骨细胞—骨小梁结构沿孔壁形成—孔隙中心组织纤维化,髓腔结构形成。通过细胞超微形态及其功能随时间变化的研究,反向推断新生结缔组织中的成纤维细胞是骨诱导新骨组织的细胞来源。 此外,为了降低个体差异造成的误差,定量地描述骨诱导,我们采用生物医用统计学方法对叁种动物种属的叁个植入时间段的骨诱导性进行了定性和定量的统计分析,通过对新骨诱导形成的组织形态学观察,获得了大量的实验数据。通过收集定量的样本数据—每个样品切片新生骨组织面积相对于孔隙界面的比值,进而展开计数资料和计量资料的统计学分析,建立适合本研究的统计学分析模型。统计结果显示:1,动物种属对骨诱导性能有影响,统计显示
谭言飞[3]2007年在《磷酸钙生物陶瓷骨诱导过程中细胞基因表达的研究》文中指出多孔磷酸钙生物陶瓷不仅具有良好的生物相容性，在一定条件下还表现出骨诱导性，即不用外加生长因子或活体细胞可以在非骨部位诱导骨组织形成，在治疗骨缺损等方面中具有光明的应用前景。已有研究表明多孔磷酸钙具有骨诱导性的材料学因素主要包括(1)多孔结构；(2)相组成；(3)结晶度和力学性能等。前期动物植入实验结果表明多孔双相陶瓷在体内具有较强的成骨诱导能力，因此本论文实验主要采用多孔的HA／TCP双相陶瓷。在骨诱导机理研究中，对于材料诱导的靶向细胞一直是猜测和假设骨髓基质细胞或在植入部位出现的未分化的血管末梢干细胞，然而缺乏直接的体内和体外数据证明，间充质细胞的来源问题需要进一步研究。另外，在干细胞向成骨细胞分化过程中大量的基因参与表达，从材料——基因表达的关系进行看，钙磷材料可以诱导细胞内控制成骨发育的关键基因在细胞中的上调表达吗?哪些不同的材料学因素影响这些基因的表达?这些问题构成了本论文的研究内容。在磷酸钙材料的骨诱导过程中，处于未分化的间充质干细胞、定向的基质干细胞、早期骨祖细胞、后期骨祖细胞、前成骨细胞到成骨细胞等，都可能是磷酸钙陶瓷材料诱导的靶向细胞。本文主要采用了成骨细胞、骨髓基质细胞、骨骼肌母细胞等可以向骨细胞分化的细胞类型研究了磷酸钙陶瓷骨诱导过程中对细胞的诱导分化作用，并从分子生物学水平提供了骨诱导的证据。首先，研究了多孔磷酸钙陶瓷体外对原代培养的骨髓基质细胞的诱导作用。多孔磷酸钙陶瓷在植入狗的非骨部位一定时间后组织学观察可以在陶瓷的孔隙中形成骨组织，因此，抽取小鼠骨髓，分离培养原代的骨髓基质细胞，体外与各种多孔的磷酸钙陶瓷材料复合培养，研究其对原代细胞的诱导作用。如果能观察到多孔磷酸钙陶瓷对分离培养的骨髓基质细胞起到骨诱导作用，即骨髓基质细胞为骨诱导过程中的靶向细胞，那么在培养一定时间后应该可以观察到骨组织的形成。为验证这一假设，设计了扩散盒模型，即多孔磷酸钙陶瓷与分离培养的大鼠骨髓基质细胞一起装入到扩散盒中，然后植入到动物肌肉中，以屏蔽宿主的自身细胞，利用动物自身的血液循环和营养环境，植入一定时间后，观察其成骨情况。在植入半年后，组织学切片观察到多孔陶瓷孔隙里面已形成骨组织，证实了这一假设，进一步为钙磷陶瓷的骨诱导性提供直接证据。其次，体外培养研究了磷酸钙陶瓷材料的材料学因素对成骨细胞骨诱导过程中细胞的生长、增殖、骨相关基因的表达等。体外培养情况下，细胞通常是生长在材料的表面上，因此，以多孔磷酸钙陶瓷形成类骨磷灰石层后为研究材料，研究材料表面形貌变化对成骨细胞的影响；同时，由于不同相成份和不同烧结温度下的磷酸钙陶瓷在培养基中的溶解性不一样，对细胞的影响也不一样，故同时还采用了多种不同相成份和烧结温度的磷酸钙陶瓷材料。结果表明钙磷陶瓷不同的相成份和烧结温度能够影响骨相关基因的表达，其表面形成类骨磷灰石层后能促进成骨细胞对骨钙素和Ⅰ型胶原基因的表达。最后，由于肌肉组织中也存在大量的多能干细胞类型，因此以骨骼肌母细胞(C2C12系)为细胞模型，我们研究了多孔磷酸钙陶瓷对肌母细胞的骨诱导过程中骨特异基因的表达情况。多孔磷酸钙陶瓷在骨诱导过程中，即骨的形成过程中，同时伴随着细胞的成骨定向分化及骨相关基因(Cbfal，OCN，TypeⅠcollagen，Osteopontin等等)的表达。Cbfal为多能干细胞向成骨细胞分化的关键调控因子，通过进一步定量研究多孔磷酸钙陶瓷对骨骼肌母细胞骨诱导过程中Cbfal和OCN基因的表达情况发现，骨诱导过程中伴随着干细胞的这一分化过程，Cbfal，这一关键基因被激活并高效表达，从而引起细胞进一步分化，出现确定成骨细胞功能的标志性基因OCN的表达。
智伟[4]2017年在《材料及力学因素对磷酸钙陶瓷骨诱导性的影响》文中指出目前研究认为在磷酸钙生物陶瓷骨诱导性潜能中发挥作用的材料特性包括:化学成分、宏观及微观几何结构和孔隙率。此外,生物体的种属及植入部位也会影响材料的骨诱导活性。尽管对磷酸钙生物陶瓷骨诱导现象的生物机制进行了大量的研究,却仍缺乏对这些机制的系统性理解,这限制了生物陶瓷在临床骨再生治疗中的广泛应用。本研究综合考虑磷酸钙生物陶瓷的宏观孔隙结构和微结构表面特性在异位骨形成中的作用,以及生理环境下应力刺激对骨发生、发育及动态平衡起到的重要作用,从体内应力环境、支架孔隙结构和支架内细胞受到的力学刺激之间的相关性角度入手,基于生物力学调控理论,对生物材料通过自身结构特征调控骨诱导发生的机制进行探讨。为深入研究磷酸钙生物陶瓷与骨诱导发生的相关性机制提供新途径,并对优化设计可控骨诱导性的磷酸钙生物陶瓷提供实验和理论依据。包括以下内容:(1)将具有不同宏观孔隙形状和尺寸的羟基磷灰石颗粒堆积支架(HA spheres accumulating scaffolds, HASAs)和羟基磷灰石颗粒造孔支架(HAporogen-pore scaffolds,HAPPs)植入狗的背肌和腹腔,系统比较宏孔形状和尺寸对支架异位成骨能力的影响。并构建叁维支架理论模型,对支架内微流体动力环境进行流动仿真模拟,探讨材料的宏观结构因素通过微流体动力途径转换为骨诱导调控信号的相关性。研究表明宏孔尺寸和形状对HA多孔支架骨诱导性有显着的影响,并且这种影响是两种结构变量共同作用的结果。流体仿真计算结果表明微流体动力环境影响支架内新骨形成和分布。研究发现微流体动力环境是材料的宏孔结构因素转换为骨诱导生物调控信号的重要途径。(2)通过调节溶胶-凝胶体系中HA/Chitin的质量比制备具有不同表面微形貌(粗糙度、比表面积和微孔隙率)的HA球形颗粒。体外细胞实验结果证实材料表面微形貌对BM-MSCs的生物行为有明显影响,多孔粗糙表面在与BM-MSCs复合初期更有利于细胞的增殖,后期则利于细胞骨向分化。细胞在与致密光滑表面复合初期因增殖很快受限,因此提前促进了 BM-MSCs的骨向分化。总体来说多孔粗糙表面对BM-MSCs具有更好的促增殖和分化作用。每种表面都具有良好的细胞相容性。体内动物实验结果表明,本研究所用的具有不同表面微形貌的HA多孔颗粒支架均具有良好的生物相容性,而粗糙表面更利于支架植入体内非骨部位后的异位骨形成。(3)在体外构建生理-微振动应力环境,研究微振动应力刺激(振幅≤50μm、强度<1×g、频率范围在1-100Hz的极低幅度、低强度、低频率的力学环境,MV)对羟基磷灰石多孔支架材料上复合的BM-MSCs成骨分化和细胞外基质矿化的影响,探讨微振动对羟基磷灰石生物活性及生物力学性能的影响,以及与羟基磷灰石陶瓷骨诱导性之间的关联性。研究发现微振动应力环境能提升HA多孔支架生物矿化能力,有利于构建成骨环境;微振动应力环境通过叁维多孔支架发生力学信号转换诱导BM-MSCs成骨分化;并且微振动应力环境和HA多孔支架协同提高了 BM-MSCs成骨相关基因Cbfal/Runx2、Col-I、ALP、OC的表达和成骨特征性蛋白ALP的表达。(4)将HA颗粒堆积支架(HASAs)植入实验动物腹腔内构建体内组织工程骨移植物,修复自体股骨节段性骨缺损,以探讨利用多孔贯通生物材料支架在体内自然生理环境异位培养组织工程化骨移植物修复大节段承重骨缺损的可能性。同时,也探讨腹腔作为自体生物反应器构建特定形状、大体积的组织工程骨移植物的可能性。研究证明腹腔内低血供、低应力负荷和缺少干细胞源性物质的生理环境具有作为体内生物反应器构建组织工程化骨移植物的可能。并成功将腹腔中构建的具有自体骨组织的骨移植物应用于节段性承重骨缺损修复。
范红松[5]2002年在《Ca-P生物陶瓷表面/界面的形成、表征及其对材料骨诱导性的影响》文中提出充分调动人体自我康复能力，达到病变或缺损组织或器官的永久性修复，是当代生物医学科学发展的目标。实现这一目标的关键是必须发展出具有仿生结构的替换材料并赋予其诱导组织再生的生物功能。磷酸钙是自然骨的无机组成，不仅具有良好的生物相容性，且能和新骨形成化学键性结合，特别是近年来发现的钙磷生物材料可具有骨诱导性，有可能诱导骨组织再生，重建病变或缺损的骨，并实现其永久修复。但Ca-P生物材料是否具有骨诱导性一直存在争议，其中一个重要原因是对骨诱导机理的解释不够完善。材料植入体内后与宿主的反应首先并通过表面／界面发生，材料的表面／界面及其行为应当与材料的骨诱导性直接相关。本文通过材料表面／界面及其形成、表征的影响因素和与材料生物学性能关系的研究，探讨了材料的表面／界面及其行为与材料骨诱导的关系。 材料与宿主间的相互作用，是涉及许多因素的一个十分复杂的过程，为简化研究模型，揭示各主要因素的作用，本文首先通过体外实验，逐个研究了各主要的材料学和生物环境因素对磷酸钙陶瓷表面／界面的形成和表征的影响；进一步通过具有不同表面／界面特征的磷酸钙陶瓷对蛋白质和骨组织细胞黏附和细胞分化、增殖的体外实验，对影响材料生物学性能的表面／界面特征进行了初步探讨；最后，通过体内实验，验证和修正体外实验结果，并通过综合分析得出结论。 体外模拟实验研究发现，在水溶液体系中，几乎所有Ca-P陶瓷通过溶解——沉积反应均可在其表面生成二次结晶的磷灰石层，但形成磷灰石表面层的能力和表征强烈受到材料组成、结构和溶液介质组成的影响。微环境中一定浓度的钙离子、磷酸根离子和碳酸根离子的存在是形成碳酸化羟基磷灰石表面层的必要条件。与此同时，溶液中的CO_3~(2-)离子及其他Na、Mg等离子亦可随Ca~(2+)、PO_4~(3-)的沉积进入磷灰石晶格，导致含CO_3~(2-)等离子的结晶不完善的磷灰石层形成，这种磷灰石层正好与骨磷灰石的组成和结构相对应，通常称之为类骨磷灰石。影响Ca-P材料形成类骨磷灰石层能力的关键因素是材料的溶解性，并与其相组成、多孔结构及显微结构及结晶完整性密切相关。几种多孔磷酸钙陶瓷形成类骨磷灰石层的能力排序为：HA／TCP＞烧结不完善的HA＞高温烧结的HA，与CaP陶瓷骨诱导能力正好对应。体内外研究亦发现，溶液介质组成及材料组成和结构等因素强烈影响其表面类骨磷灰石层的特征。蛋白质等有机大分子可增进磷灰石晶体成核并抑制其过度生长，所形成的磷灰石层，以蛋白质连接HA微晶构成的网状层为特征，与之对比，在无蛋白质及有机大分子的溶液介质中形成的磷灰石层以片状磷灰石结晶为特点。前者更近于生物矿化的骨的特征。 体外蛋白吸附，骨组织细胞培养及体内实验表明，由结晶不完善的HA微晶和有机大分子参与和调制形成的网状结构的磷灰石层可有效地锚附蛋白、细胞并为细胞分化和增殖以及骨组织形成提供适宜的条件；与之对比，无蛋白质等有机大分子参与形成的片状磷灰石结晶形成的磷灰石层，即使其组成结构类似于骨磷灰石，仍可被蛋臼和细胞识别出为非骨基质。前者表征着与材料生物学性能有关，或有利于增进材料生物学性能，特别是骨诱导性的特征，在此种意义上，准确的类骨磷灰石层可定义为：由蛋白质等有机大分子参与和调制形成的碳酸化的非化学计量的类似网状结构的磷灰石层。 进一步的体内实验研究证明，具有上述特征的类骨磷灰石层的多孔磷酸钙陶瓷及可于体内形成类骨磷灰石层的多孔CaF陶瓷具有明显的诱导成骨作用，反之则不表现出或仅微弱地表现出骨诱导作用。结合以前研究结果，可以得出：具有一定特征的类骨磷灰石层的形成是诱发CaI生物材料骨诱导性的一个必要条件。
王朝元[6]2003年在《磷酸钙生物陶瓷对成骨细胞骨相关基因表达影响的体外实验研究》文中研究表明接受临床骨修复患者的数量已仅次于输血患者，骨缺损已经成为威胁人类健康的主要疾患之一。长期以来，用于骨组织修复的材料主要是自体骨和同种异体骨。自体移植主要的缺点是来源极为有限，而且以伤治伤。同种异体骨移植存在免疫性和供体传染疾病的危险。 磷酸钙陶瓷(羟基磷灰石、磷酸叁钙及羟基磷灰石／磷酸叁钙复合材料等)是一类典型的生物活性陶瓷。除具有良好的生物相容性外，磷酸钙生物陶瓷还具有良好的骨传导性并可与骨形成化学键合。近年来更发现具有特定组成和结构的磷酸钙陶瓷还可诱导骨形成。 然而，磷酸钙陶瓷生物相容性和生物活性的机理至今尚未被充分阐明。磷酸钙陶瓷的物理化学特征(化学组分、孔隙、表面微结构，液流等)如何影响成骨细胞的行为，特别是骨相关基因的表达尚未见报道。磷酸钙陶瓷的物理化学特征如何影响成骨细胞骨重建相关的RANKL／OPG系统的表达也未见报道。因此，本文试图通过定量检测体外培养于不同磷酸钙陶瓷表面的成骨细胞的细胞增殖及骨相关基因在mRNA和蛋白质水平的表达，研究不同磷酸钙陶瓷的物理化学特征对成骨细胞行为，特别是骨相关基因表达的影响，以便更深入的了解磷酸钙陶瓷的生物相容性和生物活性。 成骨细胞的某些基因的表达对骨代谢具有十分重要的意义。它们是：碱性磷酸酶，Ⅰ型胶原，骨钙蛋白，骨涎蛋白，骨桥蛋白和骨连蛋白。因为它们与成骨过程密切相关，故被称为骨相关基因。在这些基因中，除了碱性磷酸酶是一种细胞膜结合蛋白外，其他蛋白均为骨基质蛋白。 成骨细胞骨重建相关的RANKL／OPG系统对于成骨分化过程中的骨重建具有十分重要的意义。成骨细胞RANKL/OPG信号系统的发现是20世纪90年代末骨生物学研究领域的一个里程碑。OPG属于TNF受体超家族的成员之一。OPG的配体是一个已知的TNF配体家族的成员RANKL。成骨细胞合成RANKL和OPG，由于成骨细胞合成并分泌的OPG具有与破骨细胞膜表面受体RANK类似的结构，因而可以与破骨细胞表面RANK竞争性的结合成骨细胞分泌RANKL，从而抑制破骨细胞的活性和进一步成熟分化。 上述基因的表达对于自然骨发生、骨生长，骨折愈合及骨重建都具有十分重要的意义，标志着骨的正常发生和形成。在正常的骨生成过程中，这些基因的表达是受到严格的时序调控的。碱性磷酸酶和I型胶原一般在成骨分化的早期高度表达，而骨钙蛋白和骨涎蛋白则在成骨分化的晚期高度表达。上述骨相关基因在骨形成过程中的表达失控则可能导致骨生长发育异常。 组织非特异性碱性磷酸酶主要在肝脏、骨组织和肾脏中高度表达。该酶可以将磷酸脂降解产生Pi沉积于骨中。碱性磷酸酶在哺乳动物体内的功能包括水解磷脂，调节磷代谢。细胞膜上的碱性磷酸酶不仅可以调控磷酸根的转运，而且可以调控钙离子、脂肪、蛋白质、碳酸根的转运和N留K泵。 I型胶原是骨组织细胞外基质的主要有机组分。它是骨中的有机基质模板，限定了矿物晶体成核的位置和生长空间。 骨钙蛋白主要分布在骨和牙组织中。在骨发生和骨生长过程中，骨钙蛋白对于骨组织中轻基磷灰石的形成过程具有抑制作用，对于骨组织的矿化具有负调节作用。骨钙蛋白还可以和另外一种骨非胶原蛋白一骨桥蛋白结合成复合物形式，这种复合物可促进骨的吸收。 骨连蛋白对细胞外基质蛋白之间的相互作用发挥重要作用。其分子结构中含有钙结合位点，与骨组织的形成、分化和骨再建有着密切的关系。骨连蛋白可与二价金属离子、几种类型的胶原分子以及轻基磷灰石结合。 骨涎蛋白与钙离子和轻基磷灰石都有强的亲和力。另外，骨涎蛋白除可以与胶原蛋白共价结合，还可以诱导破骨细胞里的钙离子应答，促进破骨细胞的骨吸收。 RANKL/OPG信号系统发现较晚，它的主要生物学功能被认为是调节破骨细胞前体的分化，破骨细胞活性以及抑制破骨细胞凋亡，从而调控骨重建。 生物陶瓷对成骨细胞行为的影响是多层面的。在细胞水平上，它可以影响细胞的形态，勃附，增殖，迁移和分化等等。在分子水平上，它可以影响细胞的基因表达。基因表达的调控可以发生在mRNA转录水平，也可以发生在蛋白质翻译水平。在mRNA水平的调控与在蛋白质水平的调控机理不同。因此，定量或半定量检测mRNA的表达及蛋白的表达成为研究磷酸钙陶瓷对成骨细胞基因表达的关键技术。19%年，zreiqat建立了一种快速简便的用于mRNA半定量检测的方法(QlsH)。该方法已经多次成功的被用于检测体外培养细胞的成骨细胞骨相关基因的表达并用于生物材料生物相容性的初步评价和材料筛选。 本研究中，我们采用该技术研究骨相关基因的mRNA表达，而骨相关基因的蛋白表达则通过免疫细胞化学法测定。磷酸钙陶瓷的相组分通过XRD检测，陶瓷表面形貌通过扫描电镜观察。细胞在磷酸钙陶瓷上的勃附通过光学显微镜观察，细胞增值则用MTS实验检测。结果如下: 不同磷酸钙陶瓷的表面结构:本研究结果证实，1200℃烧结的不同相组分的磷酸钙陶瓷其表面的微结构和形貌有很大差异。纯的烃基磷灰石陶瓷表面晶体呈较为规则多边形，晶粒较大。双相磷酸钙陶瓷BCPI和BCPZ的表面形貌和?
高阳[7]2010年在《激光快速成形技术制备磷酸钙陶瓷涂层及其生物学性能研究》文中研究指明为了改善钛金属植入材料生物活性差,植入体内后与骨组织无法形成骨结合的不足,本研究通过激光快速成形(Laser rapid forming,LRF)技术在纯钛表面制备磷酸钙陶瓷涂层,期望将金属良好的力学性能与生物陶瓷的生物活性相结合,并通过生物学性能评价,探索该材料与骨界面早期成骨的生物机制,为LRF技术制备钛基磷酸钙陶瓷涂层材料在临床应用提供理论和实验基础。方法:1.将80% CaHPO4·2H2O和20% CaCO3混合粉末为原料,采用LRF技术在纯钛基体材料表面上原位合成磷酸钙陶瓷涂层,检测成形涂层的微观组织结构、化学成分和物相组成;采用含血清的DMEM细胞培养液为模拟体液,通过浸泡试验,观察试件表面微观形貌变化,评价其表面诱导类骨磷灰石沉积的能力。2.根据相关国家标准和行业标准,通过体外细胞毒性试验(GB/T 16886.5-2003)、溶血试验(YY/T 0127.1-1993)和口腔粘膜刺激试验(YY/T 0279-1995),评价成形涂层的生物安全性。3.将成骨细胞在成形涂层表面进行体外培养,抛光纯钛作为对照组,采用MTT法、流式细胞仪、形态分析和real time RT-PCR方法,检测材料和细胞相互作用后引起的细胞黏附、增殖和成骨相关基因表达的变化。4.将成形涂层和抛光纯钛植入体分别植入兔股骨内,于4周和8周后,通过组织形态学观察评价植入体—骨界面,了解植入体与骨组织的愈合情况和相互反应。结果:1.采用激光功率400W,扫描速度100mm/min、送粉量3.0g/min、搭接率为35%的工艺参数,以80wt%CaHPO4·2H2O和20wt% CaCO3混合粉末为原料,原位合成法制备了钛基磷酸钙陶瓷涂层。涂层表面表面分布着大量的Ca、P、O元素和少量的Ti、C元素,成形涂层主要物相为生物活性陶瓷β-TCP,成形涂层可分为陶瓷层、过渡层以及基材叁个层次,结合界面过渡连续无裂纹,实现了良好的冶金结合。2.模拟体液浸泡试验结果表明,LRF磷酸钙陶瓷涂层可能具有诱导磷灰石沉积的能力,从而促进磷灰石的成核沉积和晶体生长。3.体外细胞毒性试验结果显示LRF磷酸钙陶瓷涂层材料无细胞毒性;溶血试验结果显示其溶血率小于5%,具有良好的血液相容性;口腔粘膜刺激试验结果显示其对粘膜无刺激性。4. LRF磷酸钙陶瓷涂层材料可以促进其表面培养成骨细胞的早期黏附和增殖,该作用与其表面的拓扑结构和化学组成有关;LRF磷酸钙陶瓷涂层材料通过调整骨相关基因的表达量,调控了成骨细胞的细胞周期,可以促进细胞DNA合成、细胞分裂和增殖。5. LRF磷酸钙陶瓷涂层植入体具有良好的生物活性,可以与骨组织紧密结合,具有明显的加快骨组织形成和改建的作用。结论:以CaHPO4·2H2O和CaCO3粉末为原料,采用LRF技术原位合成法制备了钛基磷酸钙陶瓷涂层材料,成形涂层的物相组成和微观组织结构均较理想,具有可靠的生物安全性和良好的细胞相容性,同时可以诱导类骨磷灰石的沉积,加速骨组织的形成和改建,缩短植入体的骨结合时间。
许国华[8]2006年在《转Ad-hBMP-7基因组织工程化纳米人工骨的研究》文中研究表明本课题研究了骨组织工程的叁个基本要素：细胞支架、种子细胞和细胞因子，探索了采用机械化学法合成纳米磷酸钙颗粒，采用有机泡沫浸渍法构建纳米磷酸钙生物玻璃复合骨支架；探索了胎盘间充质干细胞的分离、培养、特性鉴定及其向成骨细胞诱导，研究了胎盘源性成骨细胞作为骨组织工程种子细胞的可行性；采用腺病毒为载体进行胎盘源性成骨细胞BMP-7基因转染，构建转基因胎盘源性成骨细胞纳米磷酸钙复合人工骨。结果显示构建的纳米磷酸钙生物玻璃复合骨支架具有良好的物理学特性、组织相容性和成骨诱导活性；胎盘源性成骨细胞具有典型的成骨细胞特性，可作为骨组织工程的种子细胞；采用腺病毒为载体的基因转染成功的进行了hBMP-7基因转染，转基因成骨细胞能够良好表达目的基因，体内成骨活性明显增强；构建的转Ad—hBMP-7基因组织工程化纳米人工骨无急性毒性反应和溶血反应，动物实验中成功的修复了大段承重部位的骨缺损。证明构建的转基因纳米人工骨具有良好的骨替代作用。
朱向东[9]2006年在《磷酸钙生物陶瓷表面结构和性质与蛋白质特异性吸附》文中研究指明生物材料植入体内后的初始事件是蛋白质在植入体表面的吸附，吸附的蛋白质对于随后的细胞行为以及植入体的最终效果起着十分重要的作用。磷酸钙生物材料具有与人体骨组织的无机成分相似的特点而被广泛用作骨修复替换材料，其优良的生物学性质已得到了充分的证实。因此磷酸钙生物材料的蛋白质吸附行为，尤其是对骨相关蛋白质的特异性吸附是目前生物材料科学基础研究的前沿课题，对于揭示磷酸钙生物材料生物活性本质和骨诱导机理具有非常重要的意义。由于以往的研究大多集中在单一的羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)上，而且普遍使用的是体外单一蛋白体系，对于不同组成和结构的磷酸钙生物材料蛋白吸附的机理认识不充分，尤其是不同蛋白质之间的竞争吸附本质及其与材料本身的化学性质和结构的内在联系方面没有给出确切的信息。因此本文从单蛋白、双蛋白和血清蛋白吸附以及体内扩散盒植入出发，系统地研究不同组成和结构的磷酸钙陶瓷的体内外蛋白吸附行为，初步探讨了磷酸钙陶瓷蛋白吸附的机理，揭示了不同组成和结构磷酸钙陶瓷在蛋白吸附行为的相似性和相异性。蛋白吸附行为由材料和蛋白质本身的性质所决定。材料表面电位、化学吸附位点、亲水性等表面化学性质是影响其表面蛋白质吸附的重要因素：蛋白质本身结构、表面电荷、分子结构稳定性、柔性等也是影响其在材料表面吸附的重要因素。由于磷酸钙陶瓷组成和结构及表面性质上的上的相似性，决定其具有相似的蛋白吸附行为。根据接触角和Zeta电位测试结果，磷酸钙陶瓷具有一定的表面疏水性，在生理pH条件下它们具有负的表面Zeta电位。光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)分析结果显示牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)吸附导致磷酸钙陶瓷颗粒表面Ca和P周围结合原子的键合情况发生了较为明显的改变，证实磷酸钙陶瓷的两种吸附位点(带正电的C点和带负电的P点)都与BSA的吸附有关。根据BSA在磷酸钙陶瓷颗粒表面的吸附结果，BSA在磷酸钙陶瓷颗粒表面的吸附都是一个非常快速的过程，可以用一级反应式来描述，同时还可以用Langmuir型吸附等温式来预测BSA在磷酸钙陶瓷表面的吸附行为。HA和双相磷酸钙(biphasic calcium phosphate，BCP)陶瓷颗粒在表面疏水性和Zeta电位上的差异是它们具有不同BSA吸附能力的主要原因。磷酸钙陶瓷颗粒表面的BSA饱和吸附量都远低于理论计算值，因而具有较低的表面蛋白覆盖率。BCP比HA有更小的表面Zeta电位绝对值而对BSA的吸附阻碍更小；同时BCP较强的表面疏水性可促使更多的BSA分子在BCP陶瓷颗粒表面吸附聚集。因此，BCP陶瓷比HA有更强的BSA吸附能力。材料表面的Zeta电位随溶液组成、pH值、离子强度等因素影响，并影响材料表面的蛋白吸附能力，二者的变化之间具有一定的相关性，可以通过磷酸钙陶瓷颗粒和BSA之间的静电作用来给予解释。根据不同溶液条件下磷酸钙陶瓷颗粒的表面Zeta电位测试和BSA吸附实验结果，HA、BCP和β-磷酸叁钙(β-tricalcium phosphate，β-TCP)叁种磷酸钙陶瓷的表面Zeta电位和BSA吸附量随溶液环境变化时都会产生相类似的变化规律。H~+、OH~-、PO_4~(3-)和Ca~(2+)是磷酸钙陶瓷的电势决定离子，溶液中pH值、PO_4~(3-)和Ca~(2+)浓度的变化决定磷酸钙陶瓷颗粒表面Zeta电位的极性和绝对值的大小，同时对BSA吸附量也会产生较大的影响；Na~+和Cl~-虽然不是磷酸钙陶瓷的电势决定离子，但是其浓度变化引起溶液离子强度的改变也会在一定程度上影响磷酸钙陶瓷颗粒的表面Zeta电位和BSA吸附，只不过这种影响要受到溶液中那些电势决定离子的制约。BSA和溶菌酶(lysozyme，LSZ)在HA、BCP和β-TCP叁种磷酸钙陶瓷颗粒表面具有类似的竞争吸附行为，LSZ比BSA在磷酸钙陶瓷颗粒表面有更高的吸附率，磷酸钙陶瓷对LSZ表现出更高的吸附亲和性。由此可以预测体液中的那些骨生长因子如BMP-2和TGF-β1等尽管含量很低，但是磷酸钙陶瓷对它们高的吸附亲和性极有可能使它们在磷酸钙陶瓷表面吸附聚集，这无疑对磷酸钙陶瓷骨诱导机理的解释是一个很好的补充。无论是在PBS还是在SBF中，随BSA／LSZ双蛋白体系中BSA和LSZ的浓度比例的不同，BSA和LSZ在磷酸钙陶瓷颗粒表面的竞争吸附过程有所差异。当体系中BSA和LSZ的浓度相当时，具有较低分子量的LSZ由于具有较大的扩散系数而先于BSA之前达到磷酸钙陶瓷颗粒表面并发生吸附，但是由于LSZ和BSA之间的静电吸引和磷酸钙陶瓷颗粒表面空余的吸附位点的存在，BSA仍然能够在表面吸附，只是吸附量较小。随着体系中BSA浓度比例的提高，磷酸钙陶瓷颗粒表面的初始蛋白吸附就逐渐变成以BSA吸附为主。但是由于高浓度条件下BSA分子的构象改变程度较小，使得BSA和磷酸钙陶瓷颗粒表面的相互作用变弱。而LSZ由于与磷酸钙陶瓷颗粒表面的吸附亲和性更强，随着时间的增长，先吸附的BSA分子就可能被后到达的LSZ所取代。因此，当体系中LSZ浓度一定的时候，LSZ在磷酸钙陶瓷颗粒表面的吸附几乎不受不受溶液中BSA浓度变化的影响。由于LSZ与骨生长因子蛋白有类似的分子量大小和电性质，由此可以预测体液中的那些骨生长因子如BMP-2和TGF-β1等尽管含量很低，但是磷酸钙陶瓷对它们高的吸附亲和性极有可能使它们在磷酸钙陶瓷表面吸附聚集。陶瓷孔隙结构对于其表面蛋白吸附具有重要影响。对多蛋白吸附体系，陶瓷表面同时表现出多层蛋白吸附行为。根据体外血清浸泡和体内扩散盒植入条件下不同表面结构磷酸钙陶瓷的蛋白吸附结果，相对于比表面积而言，磷酸钙陶瓷的孔结构大小和孔隙率对于其蛋白吸附量有着很大的贡献，其多孔结构特征大大提升了磷酸钙陶瓷的蛋白吸附能力。在体外血清蛋白吸附条件下磷酸钙陶瓷表面的蛋白吸附并不是纯粹的单分子层蛋白吸附，而是表现出多层蛋白吸附行为。磷酸钙陶瓷不仅能够吸附血液和组织液中那些含量比较高的蛋白质，而且对于Fibeonectin和TGF-β1这些与成骨密切相关的功能蛋白质也表现出较强的吸附能力。通过DS-PAGE电泳分析、Fibeonectin的免疫印迹分析和TGF-β1的ELISA定量分析结果显示，在体内扩散盒植入条件下磷酸钙陶瓷能够富集TGF-β1等生长因子蛋白，它们的TGF-β1吸附量随着吸附时间的延长而有显着的提高。HA、BCP和β-TCP在吸附的TGF-β1量上存在一定的差异，β-TCP的相对吸附量低于HA和BCP。多孔的BCP陶瓷吸附TGF-β1的量最大，这可能是它比HA和β-TCP有更强骨诱导能力的一个重要原因。
陈希哲[10]2001年在《含孔磷酸钙陶瓷为支架基因转染自体细胞成骨能力研究》文中认为组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理，对病损组织结构和功能的修复与重建进行研究开发的一门新兴学科。其是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上的又一里程碑，标志着人类将走出单纯器官移植领域，步入组织、器官再造的新时代。 骨是最早在实验室中获得组织工程化的组织之一。组织工程骨修复亟需研究的内容包括：①能分化为成骨细胞的多能干细胞；②介导多能干细胞游走、分化、增殖的促生长和分化因子；③可吸收的细胞外基质或称支架以支持干细胞在骨缺损区的游走及附着；④在整个新骨形成过程中血管网的构成。基于以上要求，本实验进行了四部分研究：1 按目前学术界普遍认可的方法进行了大鼠骨髓基质细胞的诱导培养，大鼠骨髓基质干细胞在含有地塞米松、左旋抗坏血酸、β—磷酸甘油钠等的培养基中原代培养2周已具明显成骨细胞表型；利用梯密度离心法分离并培养大鼠骨髓内皮细胞，证实了大鼠骨髓内皮细胞具有W—P小体以及其它内皮细胞共有的特征。这两种细胞都属有限细胞系，可传代、冻存及复苏。此部分结果为后续实验打下了基础。2 进行噬菌粒载体pBK-BMP_2的扩增、提纯及酶切鉴定，并利用脂质体将此穿梭质粒转染大鼠骨髓基质干细胞。通过免疫组化、原位杂交及Western Blot印迹杂交检测，从分子水平和蛋白质水平直接或间接地证实经筛选后的细胞克隆能表达、分泌外源性的BMP_2。3 应用纤连蛋白对含孔磷酸钙陶瓷进行表面修饰并证实其有利于成骨细胞的贴附和成骨表型；建立封闭群动物SD大鼠骨组织工程模型并证实其对小型试材骨修复的研究结果更接近临床；将rhBMP_2转染的自体细胞复合同体骨髓基质干细胞并种植于含孔磷酸钙陶瓷上，回植原动物皮下或肌肉内均表现明显的异位成骨能力；这种基因转染自体细胞—陶瓷复合体用于颅骨极量骨缺损的修复可取得与自体成骨细胞移植相同的效果，间接说明了转染细胞能在体表达BMP_2并促使未转染的基质干细胞分化为成骨细胞。4 通过颈总动脉墨汁灌注及透射电镜观察，系统了解并分析自体细胞—陶瓷陈希哲 下四军医大学博士学位论又 一Z一要合汁颅g极量骨缺殒修复过程中血管生成与骨形成及陶瓷降解Z问的X系，1实山向兰ISOtlS提供的含孔磷酸钙陶瓷作为骨组织工程细胞支架有利于血育和骨的丙十，随时问推移陶瓷本导可以降解；种植的成骨细胞与新上的血管内皮别胞关系密切，推测其卜必有某些问于引发的信号转导级联效口。实验设计及技术路线如下图： — — 大鼠左恻殴、温骨骨钮 1 Me＊＊＊－－H＿7w～？ri 一J～＼ F－－s－－－－－－－ WWWk’G一4％：PJ LHerylerx ’tyxtew—“。二｛ilZJZtr－ 成骨纽胞诱导培养 刀卫sC。rhB卜IP。基因转染 ＼＼／ — ———＠p—— 一 细胞一囚瓷 体构鱼 大气颅骨极量骨 修复／、 异位骨形成 回 憾
参考文献：
[1]. 磷酸钙生物陶瓷骨诱导过程的早期细胞分化和骨特征蛋白表达研究[D]. 屈树新. 四川大学. 2002
[2]. 磷酸钙生物陶瓷骨诱导过程中超微结构和组织形态统计学研究[D]. 王海力. 四川大学. 2005
[3]. 磷酸钙生物陶瓷骨诱导过程中细胞基因表达的研究[D]. 谭言飞. 四川大学. 2007
[4]. 材料及力学因素对磷酸钙陶瓷骨诱导性的影响[D]. 智伟. 西南交通大学. 2017
[5]. Ca-P生物陶瓷表面/界面的形成、表征及其对材料骨诱导性的影响[D]. 范红松. 四川大学. 2002
[6]. 磷酸钙生物陶瓷对成骨细胞骨相关基因表达影响的体外实验研究[D]. 王朝元. 四川大学. 2003
[7]. 激光快速成形技术制备磷酸钙陶瓷涂层及其生物学性能研究[D]. 高阳. 第四军医大学. 2010
[8]. 转Ad-hBMP-7基因组织工程化纳米人工骨的研究[D]. 许国华. 第二军医大学. 2006
[9]. 磷酸钙生物陶瓷表面结构和性质与蛋白质特异性吸附[D]. 朱向东. 四川大学. 2006
[10]. 含孔磷酸钙陶瓷为支架基因转染自体细胞成骨能力研究[D]. 陈希哲. 第四军医大学. 2001
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