刘都户[1]1999年在《血管内皮生长因子在人胃癌中的表达及其对胃癌形成和发展的作用》文中研究表明肿瘤诱发的血管生成在肿瘤的生长及转移过程中起着重要的作用。针对肿瘤血管生成的抗肿瘤治疗已显示出了良好的前景。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor VEGF)最初是从体外培养的豚鼠肝癌细胞无血清培养基中发现的。实验发现，VEGF通过与其受体作用既可以提高血管通透性，有利于血浆蛋白外渗，又可有选择地直接作用于血管内皮细胞，刺激其分裂增殖。许多其它促血管生成因子的促血管生成作用的发挥也是通过VEGF而最后起作用的。总之，VEGF对血管生成中关键环节——血管内皮细胞的持续增殖有着无可替代的直接作用。研究发现，许多实体肿瘤均高表达VEGF，提示以VEGF／VEGFR为靶点的抗实体肿瘤治疗必将有良好的应用前景。 为探讨VEGF及其受体KDR在人胃癌中的表达水平、临床意义及对胃癌产生与发展的可能作用，我们首先应用免疫组织化学及蛋白免疫印迹检测研究了VEGF及其受体KDR在人胃癌组织细胞中的表达，分析了VEGF的表达与肿瘤血管生成及胃癌临床病理特征的关系；之后应用基因重组技术构建了正义及反义VEGF_(165)mRNA真核表达载体，通过脂质体介导的基因转染技术将携带VEGF正义及反义mRNA的真核表达载体转入SGC—7901细胞，建立了高表达及低表达VEGF的SGC—7901细胞株；进一步对高表达及低表达VEGF的细胞从生长特性、集落形成、细胞周期、蛋白质表达、致瘤情况等方面进行了研究，主要内容
王日雄[2]2014年在《基于胃癌血管生成的褪黑素核受体作用靶点研究》文中提出胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,表现为进展快、生存期短、预后较差。如何提高胃癌的生存率仍是目前临床面临的一大挑战。肿瘤的生长、转移和预后均与血管生成相关。肿瘤血管生成是一个多因子参与的多步骤过程,阻断其中任何一步,都将阻止肿瘤血管生成,因此肿瘤的血管生成系统已成为一个崭新的抗肿瘤治疗靶点。近年来大量研究证实褪黑素具有抗肿瘤作用,其中核受体可能是其发挥抗瘤作用的重要途径。而褪黑素与褪黑素核受体、胃癌血管生成三者之间直接联系的研究尚未见公开报道。本研究旨在探讨乏氧条件下,褪黑素抑制胃癌血管生成及其与褪黑素核受体的关系及相关机制,从而为胃癌的生物学治疗提供新的思路和途径,为应用开发奠定一定基础。1.褪黑素体外抗人胃癌细胞血管生成作用及其对褪黑素核受体的影响为研究褪黑素体外抗人胃癌细胞血管生成作用及其对褪黑素核受体的影响,本部分研究建立不同浓度时间点褪黑素对人胃癌细胞株干预模型,CCK-8、ELISA、实时荧光定量RT-PCR、免疫印迹等方法检测人胃癌细胞增殖活性及VEGF、Angiopoietin、Angiostatin、褪黑素核受体m RNA与蛋白表达的变化。结果显示:(1)褪黑素抑制人胃癌细胞MGC-803、SGC-7901、AGS增殖,呈时间剂量依赖性,100μmol/L氯化钴(Cobalt Chloride,Co Cl2)模拟的化学性低氧可促进人胃癌细胞SGC-7901增殖;(2)高浓度褪黑素可下调人胃癌细胞SGC-7901VEGF m RNA与蛋白表达表达;(3)高浓度褪黑素可下调人胃癌细胞SGC-7901核受体RZR/RORγ表达。2.褪黑素体外抗人胃癌细胞SGC-7901血管生成机制及褪黑素核受体RZR/RORγ作用靶点研究为研究褪黑素体外抑制人胃癌细胞SGC-7901血管生成的可能机制,本部分研究建立乏氧条件下3 m M浓度褪黑素干预24h对人胃癌细胞SGC-7901的体外模型,反义核酸技术(si RNA)沉默核受体RZR/RORγ,观测对细胞增殖活性的影响;实时荧光定量RT-PCR、免疫印迹法检测SGC-7901细胞核受体RZR/RORγ、SENP1、HIF-1α、VEGF m RNA及蛋白表达;利用si RNA技术沉默核受体RZR/RORγ表达探讨SENP1、HIF-1α、VEGF信号通路在褪黑素抑制人胃癌细胞SGC-7901细胞血管生成中的作用。结果发现:(1)应用si RNA技术沉默核受体ROR/RZRγ能明显拮抗褪黑素对人胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制作用,提示褪黑素抑制肿瘤细胞增殖与褪黑素核受体RZR/RORγ有关;(2)乏氧条件下,3 m M浓度褪黑素干预24h后明显下调SGC-7901核受体RZR/RORγ表达,并下调SENP1、HIF-1α、VEGF m RNA及蛋白表达;(3)沉默核受体RZR/RORγ可部份上调SENP1、HIF-1α、VEGF m RNA及蛋白表达,提示褪黑素可能通过核受体RZR/RORγ抑制胃癌血管生成。3.褪黑素体内抗荷胃癌祼鼠血管生成影响及其核受体机制为研究褪黑素体内抗荷胃癌祼鼠血管生成作用及其与核受体RZR/RORγ的关系,本部分研究应用人胃癌细胞SGC-7901建立荷胃癌祼鼠模型,不同浓度褪黑素干预后,运用免疫组化、实时荧光定量RT-PCR、免疫印迹等方法检测相关因子的表达变化。结果发现:(1)褪黑素能够缩小荷胃癌祼鼠的肿瘤体积,减轻肿瘤重量,达到抗肿瘤作用;(2)褪黑素在抑制肿瘤生长过程中下调肿瘤组织核受体RZR/RORγ表达并下调SENP1、HIF-1α、VEGF、MVD表达,抑制肿瘤血管生成影响肿瘤增殖;(3)褪黑素下调肿瘤组织核受体RZR/RORγ表达,表明褪黑素可能通过核受体RZR/RORγ途径实现抗荷胃癌祼鼠移植瘤血管生成从而抑制肿瘤生长的作用。综上所述,体内外实验证实褪黑素能够抑制人胃癌细胞SGC-7901血管生成作用,其机制包括通过下调核受体RZR/RORγ表达,并通过核受体RZR/RORγ抑制SENP1、HIF-1α、VEGF表达,从而抑制肿瘤血管生成,抑制肿瘤细胞生长。
时岚[3]2009年在《PIP5KL1在肿瘤发生发展中的功能研究》文中进行了进一步梳理4-磷酸-磷脂酰肌醇-5-激酶(phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases-like 1,PIP5KL1)为磷酸磷脂酰肌醇激酶(PIPKs)家族的新成员。初步的功能研究发现PIP5KL1在细胞内主要起支架作用,使其它的4-磷酸-磷脂酰肌醇-5-激酶(PIP5K)成员定位到特定部位,并激活其活性,在那里生成3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PI(3,4,5)P_3)。另有报导PIP5KL1具有诱导细胞的凋亡和坏死的作用。但是关于PIP5KL1与肿瘤发生发展相关性的研究目前还未见报道。本研究建立了PIP5KL1蛋白的原核高效表达体系及纯化方法,并应用该方法获得一定数量和纯度的原核重组表达蛋白,同时用该蛋白作为抗原,制备了多克隆抗体,为后续工作提供了研究基础。此外,构建了真核表达质粒pcDNA3-1-PIP5KL1,转染宫颈癌Hela细胞和胃癌BGC823细胞。观察发现,转染PIP5KL1后肿瘤细胞生长缓慢、增殖速度降低、迁移能力受到抑制。将处理后的细胞注射到裸鼠皮下,发现形成肿瘤的时间推迟、生长变慢、体积减小、重量减轻。进一步验证了PIP5KL1对肿瘤细胞的生长抑制,并显示出PIP5KL1作为分子药物用于肿瘤治疗的潜在价值。为了进一步探讨PIP5KL1与癌症发生发展的关系,本研究采用免疫组化方法检测癌及正常组织芯片中PIP5KL1的表达情况,结果发现在胃癌及正常胃组织中PIP5KL1的表达具有显著性差异,提示PIP5KL1可能抑制了胃癌的发生发展。于是又探讨了其作用分子机理,结果发现PIP5KL1抑制了Akt的活化,提示了PIP5KL1可能通过参与PI3K-Akt信号通路的调节,从而抑制了肿瘤细胞的增殖与迁移。综上所述,本研究首次为PIP5KL1影响肿瘤细胞增殖、迁移能力以及参与胃癌的发生发展提供了直接的证据,展现出良好的临床应用前景。
吴敏[4]2016年在《组织因子及其剪切体在胃癌组织中表达的临床意义及作用机制研究》文中研究表明组织因子(tissue factor,TF)是一种分子量为47kDa的膜性糖蛋白,不仅作为凝血激活因子,在多种生物学过程尤其在肿瘤生长与转移中具有重要意义。TF表达为两种自然发生的蛋白亚型,膜结合的全长TF(flTF)和选择性剪切亚型组织因子(asTF)。实验和临床证据均表明,在肿瘤中有异常的TF表达,并促进肿瘤生长与转移。TF及其剪切亚型(剪切体)的表达和功能的调节受多种因素影响。肿瘤相关刺激信号可调节TF的表达。作为TF转录后调节机制,microRNA直接或间接控制TF的表达和功能。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。目前证实胃癌中有TF表达异常,并且其表达水平与肿瘤的多种生物学行为有关。但asTF在胃癌中的临床意义及调节机制尚不完全明了。本实验通过自行设计asTF的引物和探针应用qRT-PCR方法检测人胃癌组织中flTF、asTF mRNA的表达水平并分析与临床病理的相关性,应用Cox模型探讨其在患者生存时间等预后因素中的价值。体外研究了促炎因子TNF-α刺激胃癌MKN28细胞后flTF、asTF mRNA表达水平的变化。由于长链非编码RNA(lncRNAs)可以作为一种竞争性内源性RNA(ceRNA)与miRNA相互作用,参与靶基因的表达调控,并在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。我们通过构建慢病毒pLVX-H19 lncRNA-shRNA下调载体系统,TF过表达载体,qRT-PCR法检测基因表达水平,WesternBlot检测TF蛋白表达水平,CCK8法测定细胞生长活力,Transwell检测细胞侵袭能力,探讨lncRNA H19与miRNA19a(miR-19a)相互作用通路在胃癌细胞中对flTF、asTF基因表达的调控机制,为TF的转录后调节途径的靶向治疗提供理论依据。本课题结果提示:(1)meta分析结果表明,TF阳性表达与肿瘤区域淋巴结转移之间存在一定的相关性(P=0.001),单变量与多变量相关生存分析TF阳性表达与肿瘤生存、预后之间均存在明显的相关性(P值均<0.0001);我们未发现TF阳性表达与肿瘤瘤体大小、生长之间有相关性;关于asTF在肿瘤中表达及临床意义的研究报道较少,检索到的文献原始数据不足,无法完成meta分析。(2)本研究通过自行设计的检测astf的引物和taqman探针将上游引物设计在第四、第六外显子的连接处,达到了避免同时扩增出fltf基因片段的目的,可高效、准确地检测fltf及astf的基因表达。(3)胃癌组织中fltfmrna相对定量[7.45(0.34~33.68)]显著高于正常胃组织[3.00(1.36~5.02)],胃癌组织中astfmrna相对定量[0.88(0.07~26.00)]显著高于正常胃组织[0.33(0.03~0.97)],差异均有统计学意义(p<0.01)。fltf与astf基因表达水平与性别、年龄、tnm分期、肿瘤大小、组织学分型和化疗敏感性等相关因素的关系差异均无统计学意义(p>0.05)。log-rank生存分析显示fltfmrna低表达组[33.83(25.24~42.43)]比高表达组[18.18(13.32~23.04)]平均术后生存时间显著延长15.66个月(χ2=6.185,p=0.013)。astfmrna低表达组[25.32(21.19~29.45)]比高表达组[20.50(12.51~28.48)]平均术后生存时间显著延长4.82个月(χ2=4.604,p=0.032)。fltfmrna与astfmrna都是低表达组与fltfmrna或astfmrna有一组高表达组比较,平均生存时间(月)及95%ci分别为28.96(24.90~33.00)、23.40(16.27~30.51),患者术后平均生存时间显著延长5.56个月(χ2=4.548,p=0.033)。fltfmrna与astfmrna同时低表达组与fltfmrna与astfmrna同时高表达组比较,平均生存时间(月)及95%ci分别为31.07(23.21~38.92)、11.13(6.90~15.36),患者术后平均生存时间显著延长19.94个月(χ2=13.005,p=0.000)。fltfmrna与astfmrna有一组高表达组较同时高表达组胃癌患者平均生存时间显著延长16.92个月(χ2=6.346,p=0.012)。多因素cox模型分析显示,fltf及astf均是胃癌独立的预后风险因素(hr=6.03,95%ci=1.02~35.71,p<0.05)及(hr=10.74,95%ci=2.32~49.59,p<0.01)。(4)体外实验发现tnf-α刺激下胃癌mkn28细胞的lncrnah19和fltf及astfmrna表达水平增高而mir-19a表达水平降低。mir-19a可与tf3’utr结合抑制其表达,mir-19a可抑制胃癌细胞的tf蛋白水平的表达,fltf/astf可促进胃癌细胞的增殖和侵袭能力,而mir-19a可抑制其促增殖和侵袭作用。下调lncrnah19可促进mir-19a表达水平增高,降低astf/fltf表达水平,抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力。综上所述,我们自行设计的astf引物和taqman探针可较准确地检测astf的基因表达。研究发现astfmrna的表达与fltfmrna一样,在胃癌组织中高表达,且与临床病理无相关性,但与预后密切相关,其表达水平与胃癌患者术后生存时间负相关,联合fltf的基因表达水平预测患者生存时间更有意义。证实tnf-α可体外促进胃癌MKN28细胞TF表达增加,且受lncRNA H19与miR-19a通路的转录后调控,参与促进胃癌的发生与发展。asTF与flTF以及lncRNA H19可作为胃癌预后判断的重要生物学指标。本研究不仅发现了胃癌发生发展过程中TF相关的lncRNA H19与mi R-19a的转录后调节通路,而且为asTF与fl TF以及lncRNA H19在胃癌的靶向免疫治疗提供了实验基础,具有一定的临床应用价值。
梁树辉[5]2009年在《胃癌血管特异结合肽GEBP11的鉴定及其对血管生成的抑制作用》文中研究指明【背景】血管生成是肿瘤发展过程中的重要条件之一,肿瘤组织微血管生成的进程、性质和密度直接关系到肿瘤生长、侵袭、转移的能力及预后,肿瘤血管诊断与治疗逐渐成为研究热点。然而,有关的肿瘤血管检测手段和治疗药物尚不令人满意,这主要与缺乏肿瘤血管特异性靶向分子及相关技术手段的不足有关。研究表明,肿瘤血管具有分子异质性,鉴定这些异质性分子并研究其作用,检测其表达水平并动态监测其变化规律,有可能为肿瘤血管靶向性诊断与治疗提供特异性靶向分子。目前肿瘤血管生成的评价主要靠免疫组化染色进行MVD计数,难以从功能上评价血管生成活性,而近年发展的分子成像技术有望实现肿瘤血管生成的可视化定量检测及动态实时追踪。受体靶向性核素内放射治疗与肿瘤血管抑制治疗相结合的肿瘤血管放射受体治疗,成为近年研究的一个热点,有望解决肿瘤血管抑制治疗中的一些问题。分子成像技术及放射受体治疗均有赖于高亲和力的特异性靶向分子。前期工作中,我们通过噬菌体随机肽库筛选获得胃癌血管内皮细胞特异结合肽GEBP11,并对其结合活性进行了初步鉴定。【目的】1、进一步深入鉴定该短肽与胃癌血管内皮细胞的结合特性及其体内胃癌血管靶向性;2、利用该短肽制备同位素探针,进行荷人胃癌裸鼠SPECT成像规律及受体放射治疗的初步研究;3、明确GEBP11短肽对胃癌血管生成的影响,并初步探讨其作用机制。【方法】1、通过蓝色噬斑形成实验及GEBP11、IN11噬菌体在荷瘤裸鼠体内的竞争抑制实验检测噬菌体体内归巢的特异性;2、免疫荧光技术检测GEBP11在荷瘤裸鼠体内的结合特异性;3、免疫细胞化学或荧光检测GEBP11在Co-HUVECs中的定位及内化;4、免疫组织荧光检测GEBP11在人胃癌组织中的结合特异性;5、采用直接法~(99)Tc~mO_4~-标记GEBP11,采用NBS法~(131)I标记GEBP11,纸层析法测定标记率、放射化学纯度等;6、放射自显影鉴定GEBP11同位素探针的结合活性;7、受体放射配基结合分析实验鉴定受体亲和力及受体细胞密度;8、同位素示踪技术检测~(131)I-GEBP11在荷瘤裸鼠体内的生物学分布;9、SPECT成像技术进行荷人胃癌裸鼠体内~(99)Tc~m-GEBP11显像;10、MTT细胞增殖实验、荷瘤鼠抑瘤实验评价~(131)I-GEBP11对内皮细胞及荷瘤鼠肿瘤的抑制能力;11、免疫组织化学染色计数瘤组织MVD;12、病理学HE染色、血液血细胞分析及生化指标检测观察肝脏损伤及骨髓抑制情况;13、Matrigel管状结构形成实验、鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验、小鼠体内Matrigel Plug诱导血管生成实验分析GEBP11对血管生成的影响;14、MTT细胞增殖实验、细胞周期及凋亡分析、细胞侵袭迁移实验、细胞粘附实验探讨GEBP11抑制血管生成的细胞机制;15、基因表达谱芯片技术筛选GEBP11短肽作用Co-HUVECs后的差异表达基因。【结果】1、GEBP11体内胃癌血管靶向性及其结合特性的进一步鉴定IN11噬菌体在肿瘤组织回收的滴度显著高于对照噬菌体或其在对照组织中回收的滴度,而对照噬菌体在各组织之间的差别不大。GEBP11短肽对IN11噬菌体向荷瘤鼠肿瘤组织的归巢具有抑制作用,并且,随着GEBP11短肽浓度的升高,移植瘤内的归巢噬菌体数量逐渐下降,抑制率逐渐增高。荷瘤鼠体内荧光共定位分析显示,肿瘤组织中GEBP11短肽与抗Ⅷ因子抗体分布一致,而对照肽或在心脏、肌肉等对照组织无明显着色。免疫细胞化学或荧光染色显示,GEBP11短肽在Co-HUVECs胞膜及核周胞浆着色,而在HUVECs、GES细胞、胃癌SGC7901细胞及AGS细胞上呈阴性或弱阳性反应。激光共聚焦免疫荧光染色结果显示,4℃孵育时GEBP11主要结合于内皮细胞胞膜,给予内化条件37℃孵育后,结合于胞膜受体的GEBP11短肽可被内化入胞内。免疫组织荧光染色结果显示,GEBP11短肽在人胃癌组织上与CD31抗体着色位置一致,而对照肽URP无阳性反应,慢性胃炎组织上亦未见明显着色。2、GEBP11核素探针在荷人胃癌裸鼠体内的SPECT成像直接法将~(99)Tc~mO_4~-标记于GEBP11,纸层析法测定其标记率达90-98%,比活度大于100Ci /mmol,~(99)Tc~m-GEBP11在体内外具有良好的稳定性。NBS法将~(131)I标记于GEBP11,纸层析法测定其标记率达90%,比活度大于10Ci /mmol,具有良好的稳定性。放射自显影结果显示,~(99)Tc~m-GEBP11及~(131)I-GEBP11与Co-HUVECs的结合明显强于HUVECs,而对照标记肽~(99)Tc~m-URP或~(131)I-OXT在Co-HUVECs上无明显结合。受体放射配基结合分析实验结果显示,相同~(99)Tc~m-GEBP11标记肽浓度时,Co-HUVECs与标记肽的结合量高于HUVECs,均呈饱和曲线。Scatchard作图示GEBP11与Co-HUVECs、HUVECs的Kd值分别为1.972nM、2.489nM,两种细胞受体密度分别为5.7×105/细胞、3.3×105/细胞。放射性同位素示踪技术检测~(131)I-GEBP11在荷瘤裸鼠体内的生物学分布结果显示,~(131)I-GEBP11注入体内2小时后,肿瘤内放射活性高出大多数器官,随时间的延迟,肿瘤内放射性活性下降相对较慢,致使它与其它非肿瘤器官的相对比值逐渐增高,最高比值可达15以上。~(131)I-GEBP11在体内多数器官清除较快,肾脏内放射性最高,清除时间长。SPECT成像结果显示,~(99)Tc~m-GEBP11在体内相对聚集于肿瘤部位,随时间延长渐强,T/NT逐渐增高,12h后开始高于心血池本底,18-24h肿瘤灶显示更加清晰,是比较理想的显像时段。~(99)Tc~m-URP对照组SPECT显像无肿瘤部位放射性浓聚现象。3、~(131)I-GEBP11对荷人胃癌裸鼠移植瘤的抗肿瘤效应体外细胞杀伤实验显示,~(131)I-GEBP11对内皮细胞增殖有抑制作用,呈浓度依赖性;Na~(131)I对内皮细胞无特异性杀伤作用;GEBP11浓度达10μg/ml时开始表现出对内皮细胞增殖的抑制作用。抑瘤实验结果显示,eADM肿瘤抑制率最高,为64.9%,~(131)I-GEBP11次之,为56.3%,Na~(131)I、GEBP11无明显抑瘤作用。~(131)I-GEBP11、eADM及GEBP11组可明显延长生存期。~(131)I-GEBP11治疗组伴有血小板降低、肝功损伤等副反应,但明显轻于表阿霉素。免疫组化染色计数MVD显示,与NS组对照,~(131)I-GEBP11、GEBP11肿瘤组织MVD计数明显降低。4、GEBP11短肽抑制血管生成的作用及机制Matrigel管状结构形成实验、鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验、小鼠体内Matrigel Plug诱导血管生成实验结果显示,GEBP11能抑制内皮细胞的管状结构形成能力、抑制CAM及小鼠体内血管生成。MTT细胞增殖实验、细胞周期及凋亡分析、细胞侵袭迁移实验、细胞粘附实验显示,GEBP11短肽对Co-HUVECs及HUVECs的增殖表现出不同程度的抑制作用,对Co-HUVECs抑制作用更强,GEBP11能诱导内皮细胞的凋亡,而对细胞周期无明显影响。GEBP11对内皮细胞的基质降解和迁移有抑制作用,对内皮细胞的粘附也有抑制作用。采用Trizol法抽提细胞总RNA,经鉴定RNA质量合格。经探针标记、芯片杂交、染色及图像采集等实验步骤,结果显示芯片的杂交信号强度较高,pm_mean(探针信号均值)大于200,neg_control_mean(阴性对照均值)小于10(图44),共有30000以上个杂交点。表达差异2倍以上定为差异表达基因,分析发现,与Co-HUVECs相比,GEBP11处理后的Co-HUVECs中上调表达的基因有2104个,下调表达的基因有1202个;与HUVECs相比,Co-HUVECs中上调表达的基因有194个,下调表达的基因有579个。【结论】1、GEBP11具有活体内胃癌血管靶向结合的能力,它与胃癌血管内皮细胞膜受体特异结合后可被内化。2、~(99)Tc~m-GEBP11 SPECT成像能较好地显示体内肿瘤灶,~(131)I-GEBP11具有明显的抗肿瘤效应及较弱的毒副作用,为开发肿瘤血管成像核素探针及受体放射治疗新药奠定了基础。3、GEBP11具有抑制胃癌血管生成的作用,这可能通过抑制ECs增殖、基质降解及迁移、粘附能力实现。GEBP11作用于内皮细胞可引起多种基因表达变化,这为探讨GEBP11抑制血管生成的分子机制提供了重要线索。
史飞涛[6]2007年在《中期因子、血管生成素-2和血管内皮生长因子在胃癌中的表达及意义》文中研究表明背景与目的胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤，病因尚不十分清楚，一般认为与HP感染、饮食等环境因素以及遗传因素有关。与其他恶性肿瘤的生物学行为一样，胃癌同样具有侵袭与转移的特征。而且，由于胃癌的早期临床症状不明显，发现时往往已属中、晚期，使得早期诊断率很低，治愈率大大降低，预后差。因此，对胃癌侵袭与转移机制方面的研究非常必要和重要，其意义在于可以通过阻止肿瘤的侵袭与转移，配合手术、放疗、化疗等手段对肿瘤进行综合治疗，从而提高胃癌的治愈率，改善患者预后。肿瘤侵袭、转移的机制非常复杂，肿瘤细胞的侵袭和转移是个多阶段、多步骤、多因素、多基因的发展过程，是肿瘤细胞与机体(宿主)双方相互作用的结果。20世纪70年代初，Folkman等就提出“肿瘤的生长依赖血管形成”，肿瘤及其转移物的生长、维持必须有新生血管的形成来维持，新生的血管网不仅为肿瘤的生长提供养料及氧气，运走代谢产生的废物，而且还以旁分泌的形式刺激肿瘤的生长，并促进肿瘤细胞进入血液循环，向其它组织器官浸润转移。如果阻断新生血管的形成，肿瘤细胞将趋于坏死。而肿瘤血管生成受到正负两方面因子的调控：血管生成刺激因子和血管生成抑制因子。微血管密度(Microvessel density,MVD)是衡量血管生成的定量指标。CD34是特异性很强的血管内皮细胞标记物，目前可用来检测MVD。通过蛋白水平检测中期因子(midkine，MK)、血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang-2)、血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达情况并分析其与肿瘤间质血管新生的关系，探讨中期因MK、Ang-2、VEGF在胃癌中的表达以及在胃癌的发生、浸润和转移中的作用，及与肿瘤血管生成的关系及临床病理学意义，为胃癌的发生、浸润及转移的预测和预后判断提供参考依据。材料与方法(1)组织标本来源于焦作市第二人民医院病理科2001年5月至2005年5月手术切除并经病理证实标本，术前均未放疗及化疗。所有标本均经10％甲醛固定，常规脱水后石蜡包埋。共选取64例胃癌标本、20例距肿瘤5cm以上的切缘正常组织标本。(2)免疫组化SABC法(StreptAvidin-Biotin Complex)检测MK、Ang-2、VEGF及CD34在胃正常粘膜及胃癌组织中的表达情况并计数MVD。(3)统计工具为SPSS13.0版软件包，统计方法采用x~2检验、t检验、方差分析以及spearman等级相关分析，并以P＜0.05作为有统计学意义的判定标准。结果(1)MK的分布特点MK蛋白阳性染色主要定位于胃癌细胞的胞质内，部分血管内皮细胞、血管壁亦可见阳性染色。正常胃黏膜组织中未见MK蛋白染色或仅见微弱染色，表达率为0；在胃癌组织中，表达率为76.6％，二者相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。(2)Ang-2的分布特点正常胃黏膜组织中未见Ang-2蛋白染色；Ang-2蛋白阳性染色主要定位于胃癌细胞的胞质内，表达率为84.4％；与正常胃黏膜相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。另外，内皮细胞及血管壁见较均匀的Ang-2阳性染色。(3)VEGF的分布特点在正常胃黏膜组织及癌细胞中均可见到VEGF阳性染色，阳性物质位于细胞浆和(或)细胞核。内皮细胞及血管壁见较均匀的VEGF阳性染色。VEGF在正常胃黏膜组织及胃癌组织中的表达率分别为15.0％和68.8％。差异有统计学意义(P＜0.01)。(4)微血管分布癌组织内微血管数量增多，分布呈异质性，形态不规则，部分血管无明显管腔或呈发芽状，正常组织区微血管分布较少而均匀，在胃癌组织及癌周正常组织的MVD平均值分别为30.089±8.294、15.012±7.134，两者差异有统计学意义(P＜0.01)。胃癌组MVD显著高于癌旁正常胃粘膜组(P＜0.01)。(5)MK、Ang-2、VEGF、MVD与胃癌组织分化程度的关系MK在高、中、低分化癌中的表达率分别为68.8％、76.9％、81.8％，MK的表达随着胃癌组织分化程度的降低呈一定上升趋势，但组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；Ang-2在高、中、低分化癌中的表达率分别为68.8％、84.6％、95.5％，组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)；VEGF在高、中、低分化癌中的表达率分别为56.3％、80.8％、63.6％，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；MVD均值分别为28.728±7.627、29.817±6.716、31.400±5.041，差别无统计学意义(P＞0.05)。(6)MK、Ang-2、VEGF、MVD与胃癌组织浸润深度的关系根据癌细胞在胃壁内浸润深度的不同，可将胃癌分为浸润未达到浆膜层组和浸润达到或超过浆膜层组。MVD的均值在浸润未达到浆膜层组和浸润达到或超过浆膜层组分别为26.700±7.598、32.123±7.844，随浸润深度的增加呈上升趋势，两组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)。MK在此两组内的表达率分别为58.3％、87.5％，随浸润深度的增加而增加，两组间比较差异亦有统计学意义(P＜0.01)。Ang-2在此两组内的表达率分别为75.0％、90.0％，虽然随着癌细胞浸润深度的增加呈一定的上升趋势，但组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。VEGF在此两组内的表达率分别为50.0％和80.0％，两组间比较差异亦有统计学意义(P＜0.01)。(7)MK、Ang-2、VEGF、MVD与胃癌淋巴结转移的关系根据胃癌有无淋巴结转移可将其分为无淋巴结转移组和有淋巴结转移组。在无淋巴结转移组内MVD的均值为24.700±8.677，低于有淋巴结转移组的34.022±7.305，两组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)。MK在此两组内的表达率分别为63.0％、86.5％，无淋巴结转移组低于有淋巴结转移组，两组间比较差异亦有统计学意义(P＜0.05)；Ang-2在此两组内的表达率分别为81.5％、86.5％，两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；VEGF在此两组内的表达率分别为51.9％、81.1％，两组间比较差异亦有统计学意义(P＜0.05)。(8)MK、Ang-2、VEGF、MVD与胃癌的临床分期的关系根据胃癌临床病理分期法将胃癌分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳ期。Ⅰa+Ⅰb期为一组，Ⅱ+Ⅲa期为一组，Ⅲb+Ⅳ期为一组。MVD在这三组中的均值分别为22.422±5.483、28.242±8.284、34.121±6.797，随着临床分期的进展，MVD均值增加，组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)；MK在Ⅰa+Ⅰb期、Ⅱ+Ⅲa期和Ⅲb+Ⅳ期的表达率分别为33.3％、73.1％、93.1％。在Ⅰa+Ⅰb期癌中的表达低于Ⅱ+Ⅲa期癌中的表达，后者又低于Ⅲb+Ⅳ期癌中的表达，差异有统计学意义(P＜0.01)；Ang-2在这三组中的表达率分别为88.9％、84.6％、82.8％，差别无统计学意义(P＞0.05)；VEGF在这三组中的表达率分别为22.2％、57.7％、93.1％，两组间比较差异亦有统计学意义(P＜0.01)。(9)MK、Ang-2、VEGF与MVD之间的关系64例癌中，MK阳性者49例，阴性15例，MK表达阳性组MVD均值为31.745±8.592，表达阴性组MVD均值为24.680±8.938，两组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)，MK表达阳性组MVD明显高于MK表达阴性组。Ang-2表达阳性组的MVD均值为31.306±9.046，阴性组的MVD均值为23.520±6.554，二者差异有统计学意义(P＜0.01)；VEGF表达阳性组的MVD均值为32.595±7.942，阴性组VEGF的MVD均值为24.575±9.287，二者差异有统计学意义(P＜0.01)。用Spearman等级相关分析，MK与VEGF表达呈正相关(r=0.264，P=0.035)；统计学结果表明MK与VEGF共阳性表达时的MVD值均显著高MK阳性而VEGF阴性或MK阴性而VEGF阳性组的MVD值(F=11.116，P=0.000)，MK、VEGF均为阴性表达时的MVD值最小，为22.300±6.347。用Spearman等级相关分析，Ang-2和VEGF之间表达无相关性(r=0.174，P=0.169)；但Ang-2与VEGF共阳性表达时的MVD值均显著高于其它各组的MVD值(F=10.483，P=0.000)，Ang-2、VEGF均为阴性表达时的MVD值最小，为18.260±4.564。结论(1)MK、Ang-2、VEGF蛋白与MVD在胃癌中的阳性表达显著高于正常胃黏膜组织。(2)MK、VEGF表达水平与胃癌的临床分期、浸润深度及淋巴结转移明显相关；MK和VEGF的阳性表达呈正相关关系，它们之间存在相互诱导或是协同效应，二者共同参与了胃癌的发展和转移过程。(3)Ang-2的高表达与胃癌的分化程度密切相关，分化程度越低，阳性表达越高。(4)抑制MK、Ang-2、VEGF的表达可能阻断胃癌血管的生成，从而减缓肿瘤的生长和转移。
参考文献：
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