王洁[1]1999年在《丹酚酸的抗脑缺血作用及其机制研究》文中提出随着人口老龄化趋势的出现，脑血管意外的发病率日渐升高，其中缺血性脑疾患发病率又远高于出血性脑疾患，发病后病人常遗留有语言、运动、感觉障碍，并伴有智能、情感活动的改变。目前对这类疾病仅能对症治疗，效果不佳，故因而寻找有效的防治脑缺血的药物就成为基础和临床药理学研究中的一项迫切任务。 丹参作为我国传统的中药材之一，最早在《神农本草经》上已有记载。现代科学研究发现，丹参的主要药用成分为其干燥根及根茎，化学成分可分为脂溶性和水溶性两种。水溶性成分的基本结构为丹参素，即3，4-二羟基苯乳酸[(3，4-hydroxybenzyl)lactic acid]，后者的主要活性成分为丹酚酸类。总丹酚酸(total salvianolic acids,SAs)分为丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C及迷迭香酸等化合物，HPLC证实为丹酚酸B(salvianolic acid B，SA-B)由三分子丹参素和一分子咖啡酸组成。以往我室工作证明丹酚酸A，B均具有较强的抗氧化，抗心肌缺血的作用。目前文献报道脑缺血与氧化损伤关系密切，本论文对丹酚酸在脑缺血中的脑保护作用及可能的机制，从整体、器官和细胞水平进行了系统、深入的研究，并与传统的抗氧化剂Vit E作了比较。 临床上脑中风病人以局部脑缺血为多见。鉴于目前脑缺血尚不能预测，临床上主要是脑缺血的对症治疗。基于这样的目的和研究基础，首先利用大鼠局灶性脑缺血模型，从整体水平观察了阻断大鼠大脑中动脉2h后给予总丹酚酸及其单体丹酚酸B的药效，并与Vit E比较，
杜冠华[2]1995年在《丹酚酸药理作用及作用机制》文中研究表明丹酚酸(Salvianolic acids)是从传统中药丹参(Radix Salvia miltiorhizae)中提取的有机酸类物质。丹酚酸可分为数种，主要有丹酚酸A，丹酚酸B(Sal A，Sal B)及其类似化合物。在此基础上对丹酚酸的化学结构进行改造，分别得到了乙酰化丹酚酸A(Sal AA)，乙酰化丹酚酸B(Sal BA)等化合物(见本文第65页)。 为了对丹参的药理作用有更深入更广泛的认识，本文对丹参的主要水溶性成分--丹酚酸的药理作用进行了研究，并对其作用机制进行了探讨，为丹酚酸可能的临床用途和丹参的全面研究提供了实验依据。本研究的主要内容有以下几个方面： 1．抗氧化及清除自由基的作用特点： 1．1 丹酚酸抗肝微粒体脂质过氧化作用，丹酚酸类化合物及其乙酰化物对VitC-NADPH系统和半胱氨酸-Fe~(2+)反应系统引起的大鼠肝微粒体或脑组织脂质过氧化反应均有很强的抑制作用，其抑制肝微粒体脂质过氧化反应的IC50分别为：Sal A 0.76 μ mol·L~(-1)，Sal AA 2.32 μ mol·L~(-1)，SalB 1.25 μ mol·L~(-1)，Sal BA 36.4 μ mol·L~(-1)，Ros 27.3 μ mol·L~(-1)。比维生素E的IC50低数百至数千倍。 1．2 清除羟自由基的作用．丹酚酸及其乙酰化物，对EDTA-Fe~(2+)反应系统产生的羟自由基具有很强的清除作用，与阳性对照药甘露醇比较，同样作用时，丹酚酸A的浓度比甘露醇小近1000倍，表现出很强的清除自由基作用。 1．3 捕捉超氧阴离子的作用．丹酚酸对黄嘌呤代谢过程中产生的超氧阴离子具有很强的清除作用，其IC50分别为：Sal A 1.71，Sal AA 0.67，SalBA 39.5，Ros 0.722 μ mol·L~(-1)．但丹酚酸对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用较弱，表明捕捉超氧阴离子可能是这些药物的直接作用。
王洁, 吴俊芳, 张均田[3]1999年在《总丹酚酸的抗脑缺血研究》文中研究表明目的探讨总丹酚酸对脑缺血的影响及其相关机制。方法脑缺血模型采用ＭＣＡＯ，离体测定总丹酚酸对脂质过氧化、超氧阴离子、羟自由基的作用。结果发现在ＭＣＡＯ模型上，总丹酚酸１２５～２５ｍｇ·ｋｇ－１有缩小脑梗塞面积、减轻脑水肿之功效，离体研究发现，总丹酚酸抗氧化作用极为明显，５～５０ｍｇ·Ｌ－１时可抗Ｆｅ２＋半胱氨酸诱导的肝微粒体脂质过氧化、清除黄嘌呤黄嘌呤氧化酶体系产生的超氧阴离子、清除Ｆｅ２＋Ｈ２Ｏ２体系产生的羟自由基作用，且同等剂量下均强于对照药ＶｉｔＥ。结论总丹酚酸有抗脑缺血作用，机制与抗氧化有关。
陈永红[4]2001年在《丹酚酸B保护线粒体和抗神经细胞凋亡作用及其作用机制研究》文中进行了进一步梳理目前研究表明，线粒体损伤及细胞凋亡在多种神经系统疾病，如急慢性缺血性脑损伤，Alzheimer’s病(AD)、Parkinson’s病(PD)、Hungtington’s(HD)病的发病机制中发挥着重要的作用。线粒体不仅是细胞内能量的主要来源，而且是细胞内自由基的主要产生地。此外，线粒体还可以通过多种途径参与细胞凋亡过程，包括释放Caspase激活因子(细胞色素C)、改变电子传递、使膜电位丧失、细胞氧化还原状态改变、参与前凋亡或抗凋亡的Bcl-2家族蛋白的形成。因此寻找有效的保护线粒体、抑制细胞凋亡的药物，可以改善能量代谢，降低自由基损伤，减少细胞凋亡，从而对多种神经系统疾病发挥治疗作用。 丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)是由传统中药一丹参内提取出来的有效成分。体内外实验表明，它具有良好的抗氧化作用。本研究采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型和6-OHDA诱导Caspase 3高表达PC12细胞凋亡模型，应用行为学、生化、组化、细胞生物和分子生物等实验方，法，从整体、线粒体、细胞和分子水平等诸多方面观察了Sal B对线粒体功能的保护和抗细胞凋亡作用，并探讨其作用的可能机制。 第一部分：丹酚酸B对大鼠缺血再灌注脑损伤模型的保护作用 采用栓线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，观察丹酚酸B对大鼠行为学，缺血大脑皮层能量物质ATP、葡萄糖无氧酵解产物以及体内自由基清除剂SOD、GSH和脂质过氧化产物MDA等生化物质的影响。结果表明，大鼠脑缺血前10min静脉注射丹酚酸B 10mg／kg可明显改善由缺血再灌注脑损伤所致的神经症状异常，降低脑缺血再灌注大鼠休克指数，使其在倾斜板上停留的时问延长。同时，丹酚酸B 10mg／kg还可对脑能量代谢产生有益影响，使缺血大脑皮层内ATP含量升高，乳酸堆积减少；
王洁, 张均田[5]1999年在《总丹酚酸抗脑缺血与抗血栓的关系》文中指出目的研究总丹酚酸抗脑缺血与脑血栓的关系。方法采用大鼠大脑中动脉缺血模型，观察总丹酚酸对脑缺血的影响；采用在体动静脉血栓法，观察总丹酚酸对血栓形成的影响，并取血测ＰＧＩ２，ＴＸＡ２及内皮素含量的变化。结果发现总丹酚酸１２５～２５ｍｇ·ｋｇ－１可降低脑梗塞面积和水肿，减少血栓湿重，并降低脑缺血后高水平的ＴＸＡ２，但对ＰＧＩ２则无影响，从而改变ＰＧＩ２／ＴＸＡ２的比值，总丹酚酸亦可降低脑缺血后血中内皮素的含量，２５ｍｇ·ｋｇ－１的ＶｉｔＥ则无上述作用。结论总丹酚酸的抗脑缺血作用与抑制血栓形成有关。
杨倩[6]2012年在《双丹口服液中主要有效成分丹酚酸B配伍丹皮酚治疗动脉粥样硬化的作用及其机制》文中研究表明1研究目的双丹口服液系收载于《中国药典》（2005、2010年版）一部的中药标准制剂，由丹参、牡丹皮组成，功能为活血化瘀、通络止痛，用于瘀血痹阻所致的胸痹，症见胸闷、心痛。双丹口服液是临床常用制剂，治疗胸痹的有效率达到90%以上，并且能显著改善中医症候。但双丹口服液成分复杂，作用机制不明，难以得到国际认同；因此，对双丹口服液进行分子中药二次开发，阐明其治疗胸痹的机制，有着重要的意义。本课题采用其主要有效成分丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）与丹皮酚（Paeonol，Pae），按照双丹口服液中的含量和配比进行配伍组方，组成分子中药，发挥二者协同作用。采用建立体内动物模型，体外冠状动脉组织培养，人脐静脉内皮细胞模型等方法，探讨和揭示分子中药Sal B配伍Pae抗动脉粥样硬化、扩张冠脉血流、保护内皮细胞的作用及其机制，为源于双丹口服液的分子中药新药二次开发提供实验依据。2方法2.1建立同时测定双丹口服液中主要有效成分Sal B及Pae含量的方法：采用HPLC法测定双丹口服液中Sal B和Pae的含量，色谱条件为色谱柱SinoChrom ODS-BP C18（4.6mm×250mm，5μm，Yilite），柱温30°C，检测波长280nm，流速1mL·min-1，C18保护柱，流动相采用甲醇及2%的冰醋酸梯度洗脱，洗脱条件如下：甲醇-2%冰醋酸（12∶88）12min，甲醇-2%冰醋酸（50∶50）1min内调整到甲醇-2%冰醋酸（70∶30）至到30min，进样量10μL。并对此测定方法进行了方法学考察，包括线性关系考察、精密度实验、重复性实验、稳定性实验、加样回收率实验。2.2Sal B配伍Pae对高脂诱导的大鼠动脉硬化的实验研究：高脂饮食配合灌胃丙基硫氧嘧啶建立大鼠动脉粥样硬化模型，分组给药4周后，测定大鼠的心率、血压、呼吸；血脂指标：血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、载脂蛋白A（APOA）、载脂蛋白B（APOB）；血清中氧化酶：一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的含量；并对主动脉血管进行了病理形态学的观察。2.3Sal B配伍Pae对离体大鼠冠状动脉收缩的影响：采用高K+溶液使冠脉去极化，使PDC通道开放，外钙内流，诱发细胞内肌浆网钙释放，细胞内钙离子浓度升高，引起冠脉平滑肌收缩，分别加入不同浓度的KCl、CaCl2溶液，观察给予Sal B配伍Pae后对其收缩的影响；Hist可与冠脉平滑肌细胞膜上的组胺受体结合，启动ROC通道，引起钙离子内流，诱发血管收缩，加入不同浓度的Hist溶液后考察Sal B配伍Pae对此种收缩的抑制作用；在无钙克氏液中加入Hist，考察Sal B配伍Pae对内钙释放所引起收缩的抑制作用，而后再加入Ca2+，考察其对外钙内流所引起收缩的阻滞作用。2.4Sal B配伍Pae对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型的保护作用及其机制：采用H2O2诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型，应用形态学观察方法，MTT检测细胞活性、Hoechst33342染色和电镜等方法考察Sal B配伍Pae对内皮细胞的保护作用，利用SYBR Green RT-PCR方法检测药物作用内皮细胞后凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA的表达变化；Western blot法检测内皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达。3结果3.1双丹口服液中Sal B及Pae的含量：双丹口服液中Sal B及Pae的含量分别约为12mg·mL-1及0.20mg·mL-1，所建立的含量检测方法简便可靠，峰型良好，稳定性，重现性，回收率均符合要求。3.2Sal B配伍Pae对高脂诱导的大鼠动脉硬化的影响：Sal B配伍Pae对动脉粥样硬化大鼠心率、血压、呼吸均无明显影响（P>0.05）；但能明显降低血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、丙二醛及NOS含量（P<0.05或P<0.01）、并能明显升高血清中高密度脂蛋白、超氧化物歧化酶和一氧化氮水平（P<0.05或P<0.01）；对血清中的载脂蛋白A、载脂蛋白也B有明显的调节作用（P<0.05或P<0.01）。病理组织学观察发现给药组对动脉内膜斑块，内膜增厚程度及结缔组织成分具有明显改善。3.3Sal B配伍Pae对离体大鼠冠状动脉收缩的影响：在克氏液中加入KCl的不同累积浓度，在无钙高钾的克氏液中加入CaCl2的不同累积浓度，在克氏液中加入Hist的不同累积浓度后，大鼠冠脉环均会出现量效依赖性收缩，在药物（Sal B配伍Pae）孵育后，给予同等程度的KCl、CaCl2、Hist刺激，量-效曲线均朝右下方移动，达到峰值时间延长且最大反应降低；在无钙克氏液中，Hist使标本收缩，达到峰值，CaCl2使冠脉环进一步收缩，给予药物Sal B配伍Pae后，对二相收缩均有明显的抑制作用；结果具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。3.4Sal B配伍Pae对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型的保护作用及其机制：Sal B配伍Pae含药血清组对H2O2损伤的细胞状态有所改善，并且呈剂量依赖；内皮细胞的活性效应随着培养液中Sal B配伍Pae含药血清的浓度的增加而增强，2%含药血清组与模型组相比，数据无统计学意义（P>0.05）；而4%、6%含药血清组数据具有统计学意义（P<0.01）；含药血清浓度为2%时产生增殖效应，增殖率为50.25%；浓度为4%时，增殖率为67.37%；浓度为6%时，增殖率为67.14%，数据具有统计学意义（P<0.01）；Hoechst33342染色、透射电镜结果表明Sal B配伍Pae含药血清组随着给药浓度的增加，细胞凋亡的情况逐渐改善，其中中、高剂量组大部分细胞存活状态良好；细胞中Bcl-2基因mRNA水平上升，而Bax基因、caspase-3的表达降低，与Western blot方法检测蛋白含量的结果较为一致，且数据具有统计学意义（P<0.01）。4结论采用HPLC方法测定双丹口服液中Sal B及Pae的含量及配比，并以此作为分子中药（Sal B配伍Pae）的组方依据，采用体内动物实验模型、体外组织血管模型、人脐静脉内皮细胞模型，证实了Sal B配伍Pae的抗动脉粥样硬化、扩张冠脉血管、保护血管内皮细胞的作用。其机制可能与降低血清TC、TG、LDL、MDA、NOS含量，升高HDL、SOD、NO水平，抗氧化和调节脂质代谢延缓或减轻AS形成有关；通过抑制血管平滑肌细胞外钙内流（抑制PDC及ROC通道）和抑制平滑肌细胞内钙释放来扩张冠脉血管；通过调节Bcl-2、Bax基因及蛋白的表达，抑制下游分子caspase-3的活化而起到保护血管内皮细胞的作用。综上，Sal B配伍Pae治疗动脉粥样硬化有很好的应用前景。
方蕾[7]2009年在《丹酚酸B抑制小鼠脑缺血再灌注炎症反应的机制研究》文中研究指明脑血管病,隶属中医“中风”、“卒中”之范畴,是一种高致残、高死亡率的常见病,已成为当今危害人类,特别是中老年人健康的重症疾病之一。缺血性脑血管病在脑血管病的发病中占60%-80%。临床治疗以溶栓为主,但在恢复缺血的脑组织血供的同时,有时却造成再灌注损伤,其发生机制与细胞内能量代谢障碍、Ca~(2+)超载、活性氧、兴奋性氨基酸的神经毒性作用、一氧化氮的细胞毒作用、炎症反应、细胞凋亡等因素有关,这些因素相互影响或互为因果,最终导致神经细胞死亡。其中脑缺血过程中的炎症反应越来越受到人们的关注。传统中医认为缺血性中风系由于本虚,产生风火痰瘀,导致脑络闭阻而发病。以气虚血瘀、痰瘀互阻、痰热腑实、毒损脑络、气血逆乱为病机特点。临床中医治疗中,活血化瘀法对缺血性卒中的治疗作用已得到广泛的认同。现代中药药理研究表明,活血化瘀中药具有扩张血管、改善循环血量、抑制血小板凝聚、溶栓、保护缺血脑组织等作用。丹参是临床常用的活血化瘀药,国内广泛应用于心脑血管疾病的治疗。丹参的化学成分主要可分为水溶性成分和脂溶性成分两大部分,其中丹酚酸B(SalB)是丹参的主要水溶性成分,为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成。大量研究已证明,SalB具有抗氧化和清除自由基、改善脑血流和脑能量代谢、维持脑血管内皮细胞功能以及减少神经元凋亡等作用,通过这些环节,对脑缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。因此,深入探讨SalB防治缺血性脑血管病的作用机制,将为临床应用提供可靠的实验依据。目的:复制小鼠脑缺血再灌注模型,探讨SalB对脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响及作用机制。方法:采用NIH小鼠随机分假手术组、模型组、尼莫地平组(Nim)和SalB组。模型组:尾静脉注射5mL/kg生理盐水,30 min后腹腔注射水合氯醛麻醉,颈正中切口,分离双侧颈总动脉,在腹腔注射硝普钠(2.25 mg/kg)的同时迅速用动脉夹夹闭双侧颈总动脉30 min,然后松开动脉夹再灌注6h、12h。假手术组:模型复制同模型组,但腹腔不注射硝普钠,双侧颈总动脉不夹闭。Nim组和SalB组模型复制前尾静脉分别注射Nim(1 mg/kg)和SalB(22.5 mg/kg),作为阳性对照与中药治疗,余同模型组。以上各组分别于脑缺血再灌注6h、12h取血与脑组织,干湿重法测定脑含水量、脑指数,脑组织HE染色观察脑皮质形态学改变,放射免疫法测定血浆血栓素B_2(TXB_2)、6-酮-前列腺素F1_α(6-keto-PGF1_α)、脑组织白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α),免疫组化法观察脑皮质细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、P-选择素的表达。结果:1.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑含水量和脑指数的影响模型组随着脑缺血再灌注时间的延长,脑含水量和脑指数呈上升趋势,与假手术组相比有显著性差异(P＜0.01);用SalB和Nim治疗,脑含水量和脑指数均降低,尤其在再灌注12h时,与模型组相比有显著性差异(P＜0.01)。2.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑皮质病理形态学的影响假手术组小鼠脑皮质神经细胞形态结构正常,血管壁完整。再灌注6h模型组神经细胞水肿,再灌注12h时加重,可见神经细胞核深染,核周及血管周空隙显著增大,间质亦有水肿;SalB组和Nim组再灌各时间点,神经细胞水肿和血管水肿均明显减轻。3.SalB对小鼠脑缺血再灌注血浆TXB_2和6-keto-PGF1_α的影响与假手术组相比,模型组6h、12h血浆TXB_2含量明显升高(P＜0.01),而6-keto-PGF1_α含量有降低的趋势,TXB_2/6-keto-PGF1_α比值显著升高(P＜0.01);与模型组相比,Nim和SalB均可降低TXB_2含量,其中SalB效果更为明显(P＜0.01);再灌注6h Nim组血浆6-keto-PGF1_α含量升高(P＜0.05),SalB组各时间点血浆6-keto-PGF1_α含量有升高的趋势,两组TXB_2/6-keto-PGF1_α降低均显著(P＜0.01)。4.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑组织TNF-α、IL-1β的影响在脑缺血再灌注不同时点,模型组小鼠脑组织TNF-α、IL-1β的含量均高于假手术组(P＜0.01或P＜0.05);SalB可不同程度的降低再灌注后TNF-α、IL-1β含量,IL-1β含量的降低则更为显著(P＜0.01);再灌注6h Nim组TNF-α含量明显降低(P＜0.01)。5.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑皮质ICAM-1、P-选择素的表达光镜观察,假手术组小鼠脑皮质中ICAM-1、P-选择素表达较少;模型组ICAM-1、P-选择素阳性反应增加,主要表达于脑微血管内皮细胞,表现为血管壁棕黄色线样深染,图像分析显示,平均光密度值显著增加(P＜0.01);SalB组和Nim组再灌各时间点,ICAM-1、P-选择素阳性反应不明显,图像分析亦显示,ICAM-1的表达在再灌各时间点明显减少(P＜0.01),P-选择素的表达在再灌注12h下降尤为明显(P＜0.01)。结论:SalB能够减轻脑水肿,其机制可能与降低TXB_2含量、TXB_2/6-keto-PGF1_α、促炎因子IL-1β、TNF-α含量及黏附分子ICAM-1、P-选择素的表达,从而抑制炎症反应有关。
李认书, 李永强[8]2003年在《丹酚酸的研究进展》文中进行了进一步梳理丹酚酸 (salvianolicacid)又称丹参酸 ,系丹参的水溶性有效成分 ,属酚酸类化合物。目前研究较多的有总丹酚酸 (totalsalviano licacid)、丹酚酸A(salvianolicacidA ,SalA)和丹酚酸B(salvian
张颖[9]2007年在《丹酚酸B对脑缺血小鼠脑组织线粒体作用及其机制的研究》文中认为脑血管病中医称为中风,也叫卒中,因其发病急,变化快,类似风善行数变的特点而命名。中风的主要症状为突然昏仆,半身不遂,口舌歪斜,语言謇涩或不语,偏身或全身麻木等。中风病发病率高,起病急,后果严重,常迅速进入昏迷,并伴有抽搐、高热,高热程度越严重,时间越长,越容易引起继发性脑组织再损伤而加重症状,同时也容易引起其它重要脏器严重的并发症,形成恶性循环。脑血管病分为出血性脑血管病和缺血性脑血管病两种,出血性脑血管病约占所有脑血管病的10%～15%,脑出血病人的预后不好,病死率高。缺血性脑血管病是导致人类死亡的三大主要疾病之一,是病残的最主要原因,其主要包括脑血管痉挛、脑血栓形成和脑栓塞,缺血性脑血管病的病理基础是脑动脉粥样硬化,而脂质代谢障碍又是形成动脉粥样硬化的重要因素。随着科学技术的发展,脑血管病通过CT和MRI等技术在早期即可以进行诊断并进行相应治疗。在脑血管病的治疗上,国际上有可能在基因治疗及细胞治疗上取得突破性进展并成为脑血管病治疗最有效的方法。缺血性脑中风的病因病机是以虚为本:清代医家王清任认为,气虚是缺血性脑中风的根本,血瘀是缺血性脑中风的核心。基本病因为风、火、痰、瘀、气、虚六种,主要病机为瘀血痰浊互阻,蒙蔽清窍,而致神机失统,发展成中风。西医学中的毒性氧自由基、兴奋性氨基酸、代谢性酸中毒、钙离子超载、炎性介质、血管活性物质过度释放等,均可看作是中医的毒邪。丹参为唇形科植物的干燥根及根茎,是我国传统中药常用的理血类中药材,性微寒、味苦,归心、肝经,具有祛淤止痛、活血通经、清心除烦之功效。丹参主要含有两类有效成分:一类为脂溶性的菲醌类成份,另一类为水溶性的多聚酚酸类成份,近年来,随着对丹参的深入研究,发现水溶性丹酚酸类是丹参的主要有效成份,具有多方面的药理活性,在药理作用方面甚至超过脂溶性成份。丹酚酸B(又称丹酚酸乙,Salvianolic acid B,SalB)是丹参中重要的水溶性有效成份之一,在临床上治疗缺血性的心脑血管疾病发挥了极好的疗效,受到了医学界的首肯。有资料显示,SalB能抑制脂质过氧化、清除氧自由基的活性、保护相关内皮细胞及降低细胞内钙浓度及增强学习记忆等功能,是丹参发挥药效的主要物质基础之一。目前SalB对缺血性脑血管疾病的防治已有大量的研究报道,本实验复制小鼠脑缺血模型,探讨SalB对急性脑缺血脑组织损伤的保护作用。本论文分为文献综述和实验研究两部分。1综述综述一主要介绍现代医学对缺血性脑血管病的发病机制及治疗概况。综述二主要介绍了传统医学对缺血性脑中风的研究概况,包括对病因病机及发病部位的论述和中医治疗脑中风的常用方法和方药。2实验研究2.1实验内容实验一目的:观察SalB对脑缺血小鼠脑组织能量代谢的影响。方法:复制急性脑缺血模型,将NIH小鼠随机分为4组:假手术组、模型组、SalB治疗组和尼莫地平对照组。检测脑缺血6min、12min、18min、24min和30min的ATP、ADP、AMP、磷酸肌酸及乳酸的含量。实验二目的:观察SalB对脑缺血小鼠线粒体的影响。动物分组及模型复制同实验一,检测线粒体膜电位(MMP)、细胞内钙浓度及细胞凋亡率的变化。实验三目的:观察SalB对脑缺血小鼠脑组织Na+-K+-ATP酶和脑含水量的影响。动物分组及模型制作同实验一,检测Na+-K+-ATP酶活性,计算脑含水量和脑指数。2.2实验结果2.2.1 SalB对脑缺血小鼠脑组织能量代谢的影响急性脑缺血6min,ATP、ADP、AMP和磷酸肌酸含量开始下降,缺血12min-30min与假手术组比较差异显著(P<0.05-0.01);用SalB和Nim治疗,缺血24min-30min与模型组比较有显著差异(P<0.05-0.01)。脑缺血后,乳酸含量增加,缺血12min-30min,模型组与假手术组比差异显著(P<0.05-0.01),SalB和Nim治疗后乳酸含量降低,24min-30min,与模型组比较差异极显著(P<0.05-0.01)。2.2.2 SalB对脑缺血小鼠脑组织线粒体的影响脑缺血6min时,线粒体膜电位下降,缺血24min、30min与假手术组比较有显著差异(P<0.05-0.01),SalB和Nim治疗后,24min-30ming与模型组相比差异显著(P <0.05 -0.01)。缺血6min时,细胞内钙离子浓度和细胞凋亡率高于假手术组,钙离子缺血12min-30min模型组与假手术组比较差异显著(P<0.05-0.01),凋亡率在缺血18min-30min与假手术组比较有统计学意义(P<0.05-0.01),用SalB和Nim治疗后,细胞内钙离子浓度和凋亡率下降,钙离子浓度于缺血18min-30min与模型组比较差异极显著(P<0.05-0.01),凋亡率于缺血24min-30min与模型组比较差异明显(P<0.05-0.01)。2.2.3 SalB对脑缺血小鼠脑组织Na+-K+-ATP酶和脑含水量的影响脑缺血6min,Na+-K+-ATP酶活性开始下降,18min-30min与假手术比较差异显著(P<0.05-0.01),用SalB和Nim治疗,在缺血30min与模型组比较有显著差异(P<0.05)。脑指数和脑含水量在脑缺血6min时上升,脑指数于脑缺血24min-30min与假手术组比较差异显著(P<0.05-0.01),用SalB和Nim治疗后于脑缺血30min时与模型组比较差异显著(P<0.01)。脑含水量于脑缺血18min-30min与假手术组比较差异显著(P<0.05-0.01),而脑缺血30min时与模型组比较有差异(P<0.05)。2.3结论2.3.1 SalB通过升高ATP、ADP和PCr含量、EC值,降低乳酸含量起到改善脑缺血后脑组织能量代谢障碍的作用。2.3.2 SalB通过升高线粒体膜电位、降低细胞内钙离子浓度,从而达到保护线粒体,减少细胞凋亡的作用。2.3.3 SalB通过增强Na+-K+-ATP酶的活性,降低脑指数和脑含水量,达到减轻脑水肿的作用。
汪芸[10]2009年在《缺糖缺氧/复糖复氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究》文中进行了进一步梳理缺血性脑血管病具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点,造成了严重的社会问题和经济负担。因此,深入认识其发病机制,寻找新的治疗靶点是目前亟待解决的问题。缺血性脑血管病的直接原因是脑血流减少,导致氧和能量供应中断,细胞死亡。治疗后脑血流恢复,但往往出现神经系统损伤加重的情况,即缺血再灌注损伤。中医理论认为中风病(这里主要指缺血性脑血管病)的病因与风、火、痰、瘀等毒邪损伤脑络有关。传统中药丹参具有活血化瘀的功效,已广泛应用于缺血性脑血管病的临床治疗。丹酚酸B(Salvianolic acid B)是从传统中药丹参中提取的水溶性有效成分,由3分子丹参素和1分子咖啡酸缩合而成的酚酸类化合物,具有很强的抗氧化、清除自由基作用,但其在脑缺血再灌注损伤过程中的作用机制还不完全清楚。本论文以中医中风病理论为指导,在我们实验室已证明丹酚酸B对小鼠脑缺血性损伤具有治疗作用的基础上,采用原代培养大鼠皮层神经细胞,建立缺糖缺氧/复糖复氧的细胞模型,从兴奋性毒性、钙超载、氧化应激、细胞凋亡的角度研究神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用的机制。论文的实验研究包括四个部分:一、缺糖缺氧模型的建立及丹酚酸B有效剂量的确定目的:建立稳定可靠的缺糖缺氧模型,并确定丹酚酸B的有效剂量。方法:体外培养大鼠大脑皮层神经细胞,复制神经细胞缺糖缺氧2h、3h、4h、5h的细胞模型,测氧仪测量培养液中溶解氧浓度,采用MTT法检测细胞活性和存活率。结果:体外培养的神经细胞状态稳定,经免疫组化神经元特异性烯醇化酶(NSE)鉴定阳性细胞比例达70～80%,神经细胞Nissl's染色显示Nissl's小体丰富。随缺糖缺氧时间延长,培养液中溶解氧浓度逐渐降低,神经细胞活性、存活率也随之下降,各时间点与正常组比较均有显著性差异(P＜0.01)。选择对细胞损伤较重的缺糖缺氧4 h作为模型时间。神经细胞缺氧缺糖4 h后活性明显下降,与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组包括10μg/L,100μg/L,1mg/L,5 mg/L,7.5 mg/L,10 mg/L,25 mg/L和50 mg/L共8个不同剂量,其中10、25、50 mg/L 3个剂量的丹酚酸B明显增强神经细胞活性,且存在量效关系,与缺糖缺氧4 h组相比差异明显(P＜0.01)。将10、25、50 mg/L3个剂量的丹酚酸B加入正常神经细胞,其活性与正常组之间没有显著性差异。选择终浓度10 mg/L作为以下实验丹酚酸B的用药剂量。二、缺糖缺氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究目的:探讨缺糖缺氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用的机制。方法:将培养的神经细胞随机分为正常组、缺糖缺氧4 h组和丹酚酸B治疗组。复制缺糖缺氧4 h的病理模型,MTT法观察神经细胞活性和存活率,比色法检测LDH漏出率和培养液中谷氨酸含量,流式细胞术测定神经细胞线粒体膜电位(MMP)、胞浆内Ca~(2+),倒置相差显微镜、HE染色及透射电镜观察神经细胞形态和超微结构的变化。结果:神经细胞缺糖缺氧4 h后活性、存活率、MMP荧光值明显降低,LDH漏出率、培养液中谷氨酸含量及胞浆内Ca~(2+)荧光强度显著升高,与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组神经细胞活性、存活率、MMP荧光值均增高,LDH漏出率、培养液中谷氨酸含量、胞浆内Ca~(2+)荧光强度下降,与缺糖缺氧4 h组比较有显著性差异(P＜0.05～0.01)。正常组神经细胞胞体呈锥体形,细胞器丰富:缺糖缺氧4 h组大部分神经细胞肿胀,细胞器数目有所减少,可见线粒体肿胀明显;丹酚酸B治疗组神经细胞轻度肿胀,细胞器结构尚完整。三、复糖复氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究目的:研究复糖复氧对神经细胞的氧化损伤,并在体外模型中证实丹酚酸B的干预作用与其抗氧化能力有关。方法:神经细胞随机分为正常组、复糖复氧组和丹酚酸B治疗组。MTT法检测缺糖缺氧3h/复糖复氧1h、3h、6h、12h、18h、24h共6个时间点神经细胞活性、存活率。缺糖缺氧3h/复糖复氧3h、24h分别代表再灌注早期、晚期,并采用比色法观察神经细胞LDH漏出率,荧光标记和自旋捕集技术检测细胞内ROS水平,比色法测定神经细胞内Mn-SOD、CAT和GSH-PX的活性。倒置相差显微镜观察神经细胞形态变化。结果:缺糖缺氧3h后复糖复氧1h、3h、6h、12h、18h、24h,神经细胞活性、存活率均较正常组降低(P＜0.05～0.01);除复糖复氧1h、12h外,其他时间点丹酚酸B治疗组神经细胞活性、存活率均高于复糖复氧组(P＜0.05)。神经细胞复糖复氧3h、24h后,LDH漏出率、细胞内ROS均明显高于正常组(P＜0.05～0.01);而丹酚酸B治疗组神经细胞LDH漏出率、细胞内ROS则低于复糖复氧组(P＜0.05～0.01)。复糖复氧3h、24h神经细胞内Mn-SOD、CAT、GSH-PX的活性均降低,与正常组比较差异明显(P＜0.05～0.01),丹酚酸B治疗组神经细胞内抗氧化酶的活性明显高于复糖复氧3h、24h组(P＜0.05～0.01)。正常组神经细胞胞体饱满,突起粗大伸展;复糖复氧3h后神经细胞形态发生改变,至24h神经细胞皱缩,部分细胞死亡;丹酚酸B治疗组神经细胞形态变化有所减轻。四、复糖复氧诱导神经细胞凋亡及丹酚酸B抗凋亡作用机制的研究目的:探讨复糖复氧诱导神经细胞凋亡及丹酚酸B抗凋亡作用的机制。方法:神经细胞随机分为正常组、复糖复氧24h组和丹酚酸B治疗组。复制缺糖缺氧3h/复糖复氧24h的细胞模型。激光扫描共聚焦显微镜测定胞浆内Ca~(2+)荧光强度,流式细胞仪检测MMP、细胞凋亡率,免疫组化法观察细胞内Bcl-2、Bax的表达水平,Western blot测定细胞色素C释放率,Hoechst 33342染色观察细胞核形态变化,透射电镜观察神经细胞超微结构。结果:缺糖缺氧3h/复糖复氧24h引起胞浆内Ca~(2+)荧光强度明显增高,MMP荧光值降低,神经细胞凋亡率明显增高,与正常组相比有显著性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组胞浆内Ca~(2+)荧光强度降低,MMP荧光值增强,凋亡率下降,与复糖复氧24h组相比亦有显著性差异(P＜0.01)。神经细胞复糖复氧24h,Bcl-2表达减弱,Bax表达升高,与正常组相比有显著性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组Bcl-2表达增加,Bax表达降低,与复糖复氧24h组比较差异明显(P＜0.05)。正常组胞浆内细胞色素C含量很低,主要集中于线粒体,复糖复氧24 h后胞浆内细胞色素C含量明显升高,其灰度值与正常组相比有显著性差异(P＜0.01),丹酚酸B治疗组胞浆内细胞色素C含量低于复糖复氧24 h组(P＜0.05)。复糖复氧24 h组细胞色素C释放率明显高于正常组(P＜0.01),丹酚酸B治疗组细胞色素C释放率明显降低,两组相比差异明显(P＜0.05)。正常神经细胞经Hoechst33342荧光染色,核呈均匀的蓝色荧光;复糖复氧24 h组则有较多细胞核呈凝聚固缩,荧光明显增强,并有核碎裂;丹酚酸B治疗组细胞核大部分呈淡蓝色或蓝色荧光,接近正常组,仅见个别细胞核浓染呈明亮蓝色荧光。透射电镜观察复糖复氧24 h组神经细胞核染色质凝聚,细胞膜完整,符合凋亡的形态改变;丹酚酸B治疗组神经细胞超微结构变化较复糖复氧24 h组有所减轻。结论:本研究建立了稳定可靠的神经细胞原代培养体系,复制的细胞模型可以实现体外神经细胞缺糖缺氧损伤。缺糖缺氧4 h引起神经细胞培养液中谷氨酸含量增加、细胞内Ca~(2+)超载、MMP下降。丹酚酸B通过减少培养液中的谷氨酸含量,抑制神经细胞内Ca~(2+)超载,稳定MMP,从而对缺糖缺氧神经细胞起到保护作用。缺糖缺氧3 h/复糖复氧3 h、24 h对神经细胞的损伤与氧化应激有关,丹酚酸B可以清除细胞内ROS,提高抗氧化酶Mn-SOD、CAT、GSH-PX的活性,从而对复糖复氧神经细胞起到保护作用。缺糖缺氧3h/复糖复氧24 h可诱导神经细胞发生凋亡,丹酚酸B通过保护线粒体功能,提高Bcl-2的表达,降低Bax的表达,减少促凋亡物质的释放,起到抗凋亡作用。综上所述,神经细胞缺糖缺氧损伤的机制与兴奋性毒性、细胞内Ca~(2+)超载有关,而复糖复氧损伤的机制则涉及到氧化应激、线粒体途径的细胞凋亡。丹酚酸B通过减轻兴奋性毒作用,抑制神经细胞内Ca~(2+)超载保护缺糖缺氧的神经细胞,通过改善细胞的氧化-还原状态,保护线粒体功能,拮抗凋亡,对复糖复氧神经细胞起到保护作用。
参考文献：
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