赵午莉[1]2003年在《小分子多肽024抗肿瘤活性及其机制的初步研究》文中研究表明目的: 研究“小分子多肽024”的抗肿瘤活性及其机制 方法: 1.应用人肝癌BEL-7402细胞株和其它人肿瘤细胞株及腹水型肝癌H_(22)荷瘤鼠观察小分子多肽024的抗肿瘤作用; 2.应用电镜、流式细胞分析术等方法探讨其抗肿瘤的可能机制; 3.应用细胞生物学的方法观察小分子多肽024对免疫细胞活性的影响。 结果: 1.小分子多肽024对人肝癌BEL-7402细胞株和其它人肿瘤细胞株具有一定的抑制作用; 2.小分子多肽024能显着延长腹水型肝癌H_(22)小鼠的生存时间; 3.小分子多肽024在体内外均能促进T淋巴细胞和NK细胞的活性。 结论: 1.小分子多肽024具有一定的抗肿瘤活性 2.小分子多肽024可能的抑瘤机理之一为小分子多肽024直接作用于肿瘤细胞,通过调节细胞内Ca~(2+)浓度及相关基因的表达,影响信号转导系统,激发细胞内的死亡途径,诱导肿瘤细胞的凋亡和坏死而达到抗肿瘤效果; 3.之二为激活机体的免疫活性间接地实现抗肿瘤作用。
侯新楠[2]2008年在《壁虎抗肿瘤研究》文中提出本课题旨在追踪壁虎抗肿瘤物质基础,对主要抗肿瘤活性大分子进行分离纯化研究,并初步探讨壁虎抗肿瘤蛋白组分的药理作用机制。采用小鼠移植性肿瘤H22进行壁虎鲜品与炮制品水提物体内抗肿瘤活性研究;用MTT法比较壁虎鲜品与炮制品水提物对多种肿瘤细胞体外增殖抑制情况。实验结果可看出,壁虎鲜品与炮制品对体内外肿瘤皆有抑制生长作用,但无显着性差异。干品不同浓度组的脾指数和胸腺指数与阳性药物组相比明显增大(P<0.01或P<0.05);而鲜品只有低剂量组的脾指数较阳性对照组升高(P<0.05),鲜品中、高剂量组的胸腺指数较阳性对照组明显升高(P<0.01)。说明壁虎炮制品对实验动物的免疫力有一定的增强作用。由于鲜品的获得受季节影响,且运输、贮存不便,传统中医也多用炮制品入药,且炮制品有提高免疫力的作用,因此选取壁虎的炮制品进行深入研究。比较水提取物、乙醇提取物及水提物对肿瘤细胞的生长抑制情况,发现不同组分均有抗肿瘤活性。可能是多种成分共同起作用。从大量文献报道看,大多数动物药中的抗肿瘤活性成分为多肽或蛋白质类物质。壁虎中主要成分是蛋白质,所以对壁虎提取物中蛋白类成分的抗肿瘤活性成分进行研究。深入进行壁虎抗肿瘤蛋白的分离纯化研究,首先用硫酸铵分级沉淀对壁虎粗提物进行分离。将粗提液分为四个沉淀级别,并进行了其中叁个沉淀组分的细胞药效比较,选出硫酸铵组分得率高,细胞药效佳的组分进行下一步实验。40%沉淀中蛋白质含量少,含有大量油脂性成分。60%和80%的沉淀组分中蛋白质含量较高,加药后观察细胞形态发现可使细胞伸长。根据各项指标综合考虑,选择60%和80%组分进行下一步分离纯化研究。第二步用两种凝胶过滤层析介质对硫酸铵组分进行分离。从分离结果看,Sephadex G-25将样品分为叁个峰,即叁个组分;Sephadex G-75将样品分为两个峰。Sephadex G-25的分离效果较好,且将硫酸铵集中到第二个峰中,所以用Sephadex G-25进行分离,起到了分离除盐的作用。细胞药效实验中显示峰1(G1)的活性最强,选用G1进行下一步分离。而后分别用阳离子交换剂CM spharose Fast Flow和阴离子交换剂DEAE纤维素DE-52两种离子交换介质进行层析。结果:G1大部分组分不能吸附在CM spharose Fast Flow介质上,而可以被吸附在DE-52介质上,并可分离出较明显的两个峰。所以认为G1组分中绝大部分是酸性蛋白质,等电点小于7,不适合用阳离子交换剂分离。经过叁步分离后纯化效果不理想,所以更换纯化路线。首先将硫酸铵分级沉淀细化,共分为7个沉淀级别,将其中6个级别做细胞药效实验,发现40%、80%、90%组分效果较好。从得率结果分析,40%得率最少,80%、90%组分得率较高,且有细胞伸长作用。因此选取70-90%组分进行深入纯化研究。用sephadex G-25分离70-90%组分,同样G1的细胞药效实验的结果最好。将G1组分用叁种常用的疏水性差异较大的介质进行阶段洗脱分离,结果:叁种介质都可以对G1进行分离,但上样量和各种填料所得组分得率不同。Phenyl FF的上样量最大,得率最高。从细胞药效实验结果看,各分离组分无明显差异。用SDS-PAGE电泳检查分离的效果,比较粗提物、硫酸铵沉淀70-90%、G1的电泳成分差异,发现各步分离都起到了纯化的效果。通过查阅文献发现,大多数抗肿瘤中药都有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,所分离的壁虎蛋白G1组分的抗肿瘤作用机制未见报道,所以首先从诱导凋亡的角度对此成分的作用机制进行研究。用形态学观察和流式细胞计数法来检测是否有诱导细胞凋亡作用。结果发现形态学观察其诱导凋亡作用不明显,流式细胞术检测其有一定的诱导凋亡的作用。由于时间有限,未对其进行其他检测以证明。须在以后的实验中进一步验证。
张丹[3]2014年在《美洲大蠊抗肿瘤活性成分及其结肠定位片的研究》文中研究指明美洲大蠊Periplaneta americana(L.)为昆虫纲(Insecta),蜚蠊目(Blattodea),蜚蠊科(Blattaria)昆虫的干燥全体。具有活血化瘀、解毒消疳、利水消肿等功效,含有蛋白质、氨基酸、肽类、糖类等多种有效成分,现代研究表明,在抗癌、提高免疫力、治疗心血管疾病、修复皮肤等方面具有显着的作用。本论文在文献及前期工作基础上,以美洲大蠊为研究对象,富集纯化其多肽类抗肿瘤活性成分,再根据多肽类成分在胃肠道中易被酸解、酶解而失去药效的性质,采用新技术、新工艺将其研制成pH敏感型口服结肠定位片,主要研究内容如下:1.美洲大蠊抗肿瘤有效部位的制备工艺研究:采用指标成分含量检测结合体外肿瘤细胞抑制试验,确定了美洲大蠊有效部位的制备工艺条件为:取美洲大蠊药材粗粉,石油醚除脂后,用10倍量90%的乙醇浸泡48h,以3ml/min/kg的速度进行渗漉,收集渗漉液,滤过,滤液在50℃-60℃减压浓缩至1:1(ml:g),药液通过HP20大孔树脂,用2BV70%的乙醇进行洗脱,收集70%乙醇洗脱液,并在50℃~60℃下减压浓缩至1:2(ml:g),冷冻干燥即得多肽类冻干粉。2.美洲大蠊冻干粉的初步质量标准研究:采用紫外-可见分光光度法对冻干粉中氨基酸、多肽含量进行测定;HPLC法对尿嘧啶、次黄嘌呤、肌酐含量进行测定;对冻干粉中氨基酸的种类和含量进行检测;Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳测定了冻干粉中多肽的分子量,初步建立了美洲大蠊多肽类冻干粉的质量标准。3.美洲大蠊冻干粉的抗肿瘤作用及其机制的研究:在前期研究的基础上,对其体内抗肿瘤活性、荷瘤小鼠免疫功能及对SMMC-7721细胞凋亡的影响进行了研究。结果表明:美洲大蠊冻干粉各剂量组能抑制荷H22和S180瘤小鼠肿瘤生长,同时能提高荷瘤机体的免疫功能;可明显诱导SMMC-7721细胞凋亡,抑制其增殖,呈现出一定的量效关系,其机制可能与下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,降低Bcl-2/Bax比值有关,初步揭示了美洲大蠊抗肿瘤的作用机制。4.美洲大蠊冻干粉结肠定位片的制备研究:根据美洲大蠊抗肿瘤活性多肽的性质,为避免多肽成分在胃肠道中易被酸解、酶解而失去药效,选择pH敏感型包衣材料Eudragit S100将冻干粉制成结肠定位片剂,有利于药物的吸收,发挥持久的药效。在制备合格素片的基础上,以肌酐的累积释放度为指标,确定具有结肠定位的包衣处方及包衣工艺参数,制备了美洲大蠊结肠定位片。叁批样品药物的释放行为相似,达到结肠定位释放的目的,对样品的释药曲线进行模型拟合,发现美洲大蠊冻干粉结肠定位片的体外释药行为符合威布尔模型。本论文对美洲大蠊抗肿瘤活性多肽进行初步分离,制备了美洲大蠊抗肿瘤活性部位;建立了冻干粉的初步质量标准;对其进行抗肿瘤机制的研究,成功研制了pH依赖型口服结肠定位片,经体外释放度试验证明能准确定位到结肠,并满足药物溶出的要求,以期为临床提供高效、低毒、多样的用药选择。创新点:1.思路创新本论文从美洲大蠊抗肿瘤有效部位的提取与纯化,冻干粉的制备,初步质量标准的建立,抗肿瘤作用及其机制的探讨,结肠定位片的研制,形成“提取工艺—化学成分—药效作用—成型工艺”的系统研究,为深入研究动物类中药新制剂提供新思路,具有创新性。2.方法创新本论文采用化学指标与药效学实验指标相结合,对美洲大蠊抗肿瘤活性成分进行富集和纯化工艺;采用western-blot法、Elisa法、Hoechst33342/PI双染法、Annexin V-FITC/PI双染法等分析方法对美洲大蠊有效部位体内外抗肿瘤作用及机制进行研究。在制备结肠定位片中,采用肌酐溶出度结合f2相似因子法对比不同处方、工艺条件的累积释放曲线,对其体外释药相似性进行评价,为动物类中药美洲大蠊结肠定位释放研究提供新方法,具有创新性。3.应用创新本论文通过体内抗肿瘤活性、荷瘤小鼠免疫功能及对体外肿瘤细胞凋亡的影响初步揭示其抗肿瘤作用的机制,为其抗肿瘤药物的开发奠定基础;美洲大蠊抗肿瘤成分为多肽类活性成分,在胃肠道中易被酸解、酶解,不易被吸收进入血液,失去生物学活性,故本论文将其制备成结肠定位片,扩大美洲大蠊临床应用,具有创新性。
王凤霞[4]2013年在《中华真地鳖(Eupolyphaga sinensis)抗肿瘤蛋白分离纯化及其体外抗转移活性研究》文中指出中华真地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker),俗称土鳖、土元等,属于蜚蠊目(Blattodea),鳖蠊科(Corydiidae),地鳖亚科(Polyphaginae),真地鳖属(Eupolyphaga)昆虫,目前已实现大规模人工养殖。中华真地鳖作为一种传统中药,在我国具有悠久的药用历史。现代研究表明,中华真地鳖具有溶解血栓、抗凝血、抗肿瘤、促进骨折愈合、调节血脂等十分广泛的药理作用。对于中华真地鳖的研究,国外学者很少涉及,其研究近乎空白。近年来,国内学者研究表明中华真地鳖蛋白提取物能够抑制血管生成和肿瘤生长。可见,蛋白组分被认为是中华真地鳖的抗肿瘤有效组分。但是,到目前为止,尚未见中华真地鳖抗肿瘤蛋白成分的报导。我们利用现代生化分离技术,从中华真地鳖新鲜雌虫体中分离纯化得到一分子质量约为72kDa的抗肿瘤蛋白,命名为EPS72。该蛋白对人肝癌细胞株Bel-7402、肺癌细胞株A549等多种人癌细胞株表现出较强的增殖抑制作用。以A549细胞作为体外肿瘤模型,研究了EPS72对细胞形态、增殖、凋亡、粘附、伸展、迁移以及侵袭的影响,发现EPS72具有体外抗肿瘤转移活性,并初步探讨了EPS72体外抗肿瘤转移可能的分子机制。期望为EPS72进一步开发利用提供一定的线索,同时为抗肿瘤蛋白类药物的研究提供一些新的思路。本课题的主要研究内容及结果有以下几个方面:1中华真地鳖抗肿瘤蛋白的提取、纯化及鉴定首先采用硫酸铵分级沉淀(50%-80%饱和度)、超滤(截留分子质量为10kDa)和冷冻干燥技术获得蛋白粗提物(组分Ⅰ)。由组分Ⅰ得到抗肿瘤活性蛋白的纯化方案由捕获、中度纯化和精制叁个步骤组成:(1)捕获:分别采用CM-Sepharose FF阳离子交换色谱和DEAE-Sepharose FF阴离子交换色谱对抗肿瘤有效活性组分进行捕获;(2)中度纯化:分别采用Q-Sepharose HP阴离子交换色谱和Butyl Sepharose HP疏水色谱进行中度纯化;(3)精制:采用Superdex75凝胶过滤色谱进行精制。整个纯化过程中采用280nm检测蛋白质洗脱情况,分别收集各洗脱峰,采用MTT法追踪抗肿瘤活性组分,最后得到的活性组分进行冷冻干燥即为纯化所得抗肿瘤蛋白(组分Ⅵ)。每1kg新鲜活虫材料大约可得到电泳纯的抗肿瘤蛋白56mg,蛋白得率0.0056%。活性组分Ⅵ在SDS-PAGE上显示为单一条带,表观分子质量约为72kDa,表明其达到了电泳纯;MALDI-TOF质谱结果表明其分子质量为71.737kDa,与SDS-PAGE结果基本吻合,说明纯化得到的抗肿瘤蛋白为单链蛋白,分子量约为72kDa,故命名为EPS72。2EPS72体外抗肿瘤活性研究MTT存活分析表明EPS72对肝癌Bel-7402细胞、肺癌A549细胞等多种人癌细胞株表现出较强的增殖抑制作用。接着以A549细胞作为体外肿瘤模型,研究了EPS72对细胞形态、凋亡、粘附、伸展、迁移以及侵袭的影响。相差显微镜下细胞形态学研究、台盼蓝染色计数、AO/EB染色以及JC-1检测细胞膜电位(△Ψm)结果表明,EPS72作用早期可诱导已贴壁生长的肿瘤细胞脱粘附,但是刚脱粘附细胞为胞膜完整的活细胞,撤药后能正常生长,而脱粘附细胞持续受药物作用后则会进一步诱导细胞凋亡性死亡。可见,EPS72诱导肿瘤细胞脱粘附的作用是直接的,而诱导细胞凋亡的作用是间接的。细胞粘附实验进一步表明,EPS72能够显着抑制肿瘤细胞向细胞外基质(ECM)蛋白成分纤粘连蛋白(fibronectin,FN)和Ⅳ型胶原蛋白(collagen Ⅳ,Col Ⅳ)的粘附,但对细胞向非ECM成分多聚赖氨酸(poly-L-lysine, PL)的粘附却没有影响。癌细胞体外伸展实验结果表明,EPS72能够抑制肿瘤细胞在ECM表面上伸展。创伤愈合实验表明EPS72能够阻止肿瘤细胞向创伤面迁移。Transwell实验进一步证明EPS72能够影响肿瘤细胞向Matrigel的侵袭能力。可见,EPS72通过影响肿瘤细胞的粘附、伸展、转移、侵袭及增殖、存活能力发挥体外抗肿瘤作用,EPS72具有体外抗肿瘤转移活性。3EPS72体外抗肿瘤作用的分子机制为了进一步探讨EPS72体外抗肿瘤转移的分子机制,利用荧光显微镜采用免疫荧光法研究了EPS72对细胞肌动蛋白骨架成分F-actin的影响;采用流式细胞仪和Western blotting技术研究了EPS72作用后肿瘤细胞β1-整合素和整合素关联蛋白激酶(ILK)表达情况。结果表明,EPS72作用后F-actin的聚合受到抑制,肿瘤细胞p1-整合素和ILK的表达受到抑制,推测EPS72可能通过直接靶向肿瘤细胞表面的β1-整合素,进而影响整合素—细胞骨架信号通路发挥体外抗肿瘤转移作用。本研究取得的成果和结论主要有:(1)采用现代生化分离技术,首次从中华真地鳖新鲜雌虫体中分离纯化得到一种分子量约为72kDa的抗肿瘤蛋白,命名为EPS72。该分离纯化工艺条件温和,操作简单,并易于规模化放大生产。(2)体外研究表明,EPS72对人肝癌Bel-7402细胞、肺癌A549细胞等人癌细胞株表现出较强的胞毒活性,而对非癌细胞株MRC5的细胞毒性较低,显示该活性蛋白具有较强的广谱抗肿瘤活性,且对肿瘤细胞显示出良好的选择性。(3)确定了EPS72通过影响肿瘤细胞的粘附、伸展、转移、侵袭及增殖、存活能力发挥体外抗肿瘤作用,EPS72具有体外抗肿瘤转移能力。(4)初步推测EPS72可能通过直接靶向肿瘤细胞表面的β1-整合素,进而影响整合素—细胞骨架信号通路发挥体外抗肿瘤转移作用。
胡纯琦[5]2012年在《p53-MDM2结合抑制剂的设计、合成及生物学活性评价》文中研究说明肿瘤被认为是多基因疾病,一旦控制细胞分化的基因有缺陷从而导致生长调控的失序,研究发现,p53基因是与人类肿瘤相关性最高的肿瘤抑制基因,具有维持基因组稳定、抑制或阻止细胞转化的功能;mdm2是1987年发现的癌基因,其表达产物MDM2蛋白可与p53蛋白结合,并抑制p53的正常生物学功能,从而可导致肿瘤的发生和发展。理论上,阻断MDM2对p53的作用可恢复p53正常功能,因此,抑制MDM2蛋白和p53相互作用被认为是抗肿瘤药物研究中的重要靶点之本论文在文献调研和文献工作总结的基础上,建立了基于p53-MDM2结合抑制剂小分子的药效团模型,并利用药效团模型,结合分子骨架迁越、电子等排、分子宏观性质与微观结构的集合等理性药物设计方法,对先导化合物Nutlin-1进行了结构修饰,保留咪唑啉骨架,对2位苯基、1位N上的连接侧链及4,5位芳环上的取代基进行结构改造和优化,共合成25个分子;对所得化合物进行了p53-MDM2结合抑制活性测试,初步构效关系表明,2-苯环及对位氯原子取代的4,5-二苯对保持p53-MDM2结合抑制活性是必须,N-1侧链取代基的不同以及侧链连接方式的改变对活性有较大影响。在此基础上,进行了第二轮的结构修饰,以改变侧链的结构为主要手段,分别在N-1位引入各种烷基酯、氨基酸作为连接链,连接链末端为各种杂环及含氮片断,考察N-1侧链对活性的影响,共合成化合物26个,蛋白荧光偏振测试及抗肿瘤活性测试均显示出该轮设计合成的化合物活性较阳性对照有较大提高。为了进一步深入了解该类化合物的结合模式,本文构建了3D-QSAR模型,该模型具有较好的预测和评价能力。在上述研究的基础上,论文在寻找全新母核结构的p53-MDM2结合抑制剂方面亦进行了一些新的探索。a.鉴于咪唑啉母核易被氧化成咪唑,因而设计、合成了15个2,4,5-叁芳基咪唑衍生物,其p53-MDM2结合抑制活性及肿瘤细胞增殖抑制活性筛选结果表明,该类化合物具有中等强度的p53-MDM2结合抑制活性(~20μM)及中等到较强的肿瘤细胞增殖抑制活性。b.根据骨架跃迁、电子等排等经典设计思想,用3-氨基吡唑、3-甲酰吡唑等母核结构代替咪唑,合成了一系列取代芳基杂环类化合物共38个,p53-MDM2结合抑制活性及肿瘤细胞增殖抑制活性筛选结果表明,3-氨基吡唑类化合物的肿瘤细胞增殖抑制活性并未不理想,但p53-MDM2结合抑制活性较咪唑类化合物有所提高(~10μM);3-甲酰吡唑类化合物的p53-MDM2结合抑制活性较弱。c.以目前体外活性最高的螺环-吲哚林-2-酮类化合物为先导,设计、合成了一系列螺环-吲哚林-2-酮类化合物共26个,其p53-MDM2结合抑制及肿瘤细胞增殖抑制活性结果显示,该类化合物对p53野生型细胞株活性较弱,但对p53突变型细胞株(SW620)表现出中等到较强的抑制活性,推测该类化合物具有不同的作用模式,对治疗p53突变型肿瘤具有进一步深入研究的价值。同时,为测定目标分子p53-MDM2(?)了结合抑制活性,研究过程中成功表达、纯MDM2蛋白,并建立了基于荧光偏振的活性测试方法,为全文活性测试提供了实验基础。
朱智彤[6]2004年在《小分子多肽抗实验性肝癌及其机制的初步研究》文中研究说明【目的】观察小分子多肽CMS024-02抗肝癌的作用,并从细胞、亚细胞及分子水平探讨其可能的作用机制。 【方法】应用人肝细胞癌BEL-7402裸鼠移植瘤模型,动态观察CMS024-02(320,160,80μg/kg/d)对BEL-7402肝细胞癌肿瘤体积、瘤重的作用,对实验动物一般状态的影响,以及通过血涂片,骨髓涂片观察药物的毒副作用。 以BrdU法、MTT法及LDH法,观察药物作用不同时间后CMS024-02对肿瘤细胞分裂增殖、细胞代谢活力的影响及细胞毒作用。以β-半乳糖苷酶染色法,观察CMS024-02诱导肿瘤细胞衰老的作用。以琼脂糖凝胶电泳观察药物对体外培养BEL-7402细胞DNA片段化的影响。 采用免疫组化方法,观察药物作用后裸鼠移植瘤组织中细胞增殖核抗原(PCNA)表达情况:以原位末端标记(TUNEL)法观察CMS024-02对裸鼠移植瘤细胞的促凋亡作用;以病理HE染色、透射电镜的方法观察CMS024-02诱导BEL-7402裸鼠移植瘤细胞发生凋亡和坏死的作用。 采用原子力显微镜观察CMS024-02对体外培养BEL-7402细胞DNA结构的影响;使用美国Affymetrix公司生产的人类基因组寡核苷酸芯片,观察CMS024-02对BEL-7402肝细胞癌基因表达谱的影响。 应用RT-PCR、Western Blot、免疫组化、ELISA等方法,观察CMS024-02对人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤PTEN、Akt、MDM2、NF-κB,COX-2、p21、p27、p53基因、蛋白表达水平及相应的酶活性的影响。 【结果】与生理盐水对照组相比,CMS024-02的给药剂量为320、160μg/kg/d时,均能显着抑制裸鼠移植瘤的生长,表现为肿瘤重量、体积减小(p<0.05),对肿瘤的抑制率可分别达57.60%及58.24%。同20mg/kg/d环磷酰胺阳性处理组相比,各CMS024-02处理组均能使裸鼠体重显着性增加,且毛色、皮屑、
吴建章[7]2013年在《单羰基姜黄素类FGFR1激酶抑制剂及抗炎药物的设计、合成、筛选及药理活性研究》文中研究说明姜黄素是一种具有抗炎、抗肿瘤等广泛药理学活性的天然药物,但由于其具有不稳定的β-二酮结构,导致其生物利用度差,限制了其进一步应用。把β-二酮结构改构为单羰基的单羰基姜黄素类似物(MCACs),在有效提高其生物利用度的同时,也具有广泛的生物学活性,因此MCACs是姜黄素类似物新药研究的热点。为了研发基于新机制的MCACs类抗肿瘤药物及具有优秀抗炎活性的抗炎药物,本文设计、合成、筛选到多个单羰基姜黄素类FGFR1激酶抑制剂及抗炎药物,对它们的药理活性及分子机制进行了研究。1.类似物的合成本文进行了两个方面(见以下两段)的MCACs药物设计,合成了4个结构类型,共136个的MCACs,其中新化合物97个。MA类为新结构类型,该类化合物的合成具有环境友好、很好的区域选择性和立体选择性。用ESI-MS、1H-NMR表征了化合物结构。为了研究其结构与活性的关系,得到11个化合物单晶,用X衍射表征了单晶结构。2.成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)激酶抑制剂的设计、药理药效及机制研究FGFRl高表达与多种肿瘤的发生密切相关,FGFR1抑制剂能有效治疗相关肿瘤,非ATP竞争性抑制剂是近年来激酶抑制剂研究的新热点,但尚未发现非ATP竞争性的FGFR抑制剂体内抗肿瘤活性的研究报道。本文以非ATP竞争性抑制齐NDGA为先导物,用比较分子力场分析法进行药物设计,得到了活性优于NDGA的多个MCACs类新型非ATP竞争性FGFRl抑制剂。其中Af23、Ad23、Aea4和Aea25均能有效抑制FGFR1高表达的非小细胞肺癌H460的增殖,诱导其凋亡,也均能有效抑制H460异种移植瘤的生长,且均未表现出明显的毒性。3.MCACs类抗炎药物设计、药理药效及机制研究新型非甾体类抗炎药物的研究是抗炎药物研究的热点,MCACs属于一类具有很好研发前景的非甾体类抗炎药物。本文用基于配体的药物设计,用LPS诱导巨噬细胞炎症因子IL-6释放的细胞模型筛选到多个单烯酮、螺杂环单烯酮及哌啶酮类抗炎化合物,其中后两类为新型抗炎药物。分析了化合物抗炎活性的构效关系,建立了单烯酮类化合物抗炎活性的定量构效关系模型。活性化合物L0604、L0609、Aea37和Aea46能完全或部分地靶向MAPK/NF-κB通路,有效抑制LPS诱导的各种炎症因子mRNA的表达,也均能对LPS诱导的小鼠脓毒感染性休克起到良好的预保护作用。本文为新型非ATP竞争性FGFR1抑制剂的研究提供了新型的先导物,为MCACs类靶向抗肿瘤药物的研究提供了新的思路、策略;为MCACs类抗炎药物的研究提供了新的理论和实验支持,为治疗脓毒血症提供了多个优秀的候选化合物。
童师亮[8]2007年在《四肽Epithalon对HepG2细胞和L-02细胞端粒及端粒酶活性的影响》文中研究表明目的:动物的一种内分泌腺——松果体,能分泌一种名为“Epithalamin”的缩氨酸,这种成分可被人工合成名叫“Epithalon”的四肽(Ala-Glu-Asp-Gly)。有报道Epithalon在动物体内具有一定的肿瘤抑制作用,本文的目的就是研究Epithalon作用于人肝癌细胞HepG2后,对HepG2细胞的生长情况、细胞端粒长度以及细胞端粒酶活性所产生的影响。同时,通过和Epithalon作用于人胎肝细胞L-02后细胞生长情况、端粒长度以及端粒酶活性的变化进行对比,研究Epithalon对细胞端粒和端粒酶的影响,探寻其可能的作用机制。方法:(1)采用Fmoc固相多肽合成法制备Epithalon四肽,高效液相层析(HPLC)纯化处理,运用NMR和质谱进行分析鉴定。(2)通过MTT法检测Epithalon四肽对人肝癌细胞株HepG2以及人胎肝细胞L-02增殖与活力的影响;用细胞形态学观察用药后细胞的生长情况,流式细胞仪检测细胞周期。(3)根据MTT检测结果,特定浓度用药一段时间后,运用端粒酶重复序列扩增-焦磷酸根酶联发光技术(TRAP-ELIDA)检测人肝癌细胞株HepG2和人胎肝细胞L-02端粒酶活性,流式荧光原位杂交法(FLOW-FISH)检测端粒长度。结果:(1)核磁与质谱结合分析鉴定表明,合成产物确为Epithalon四肽。(2)MTT法检测Epithalon四肽对人肝癌细胞株HepG2增殖与活力的影响显示:低浓度(0.00256~0.0256μmol/L)和高浓度(25.6μmol/L)的Epithalon对细胞生长影响不大,而0.256~2.56μmol/L的Epithalon对HepG2细胞有一定抑制作用。流式细胞仪检测细胞周期表明,Epithalon有一定的S期阻滞作用。Epithalon对人胎肝细胞株L-02增殖与活力的影响显示:2.56μmol/L~25.6μmol/L的Epithalon对L-02细胞增殖有促进作用。(3)运用TRAP-ELIDA检测人肝癌细胞株HepG2端粒酶活性,流式荧光原位杂交法(FLOW-FISH)检测端粒长度的变化,发现加入Epithalon后对HepG2细胞的端粒酶活性和端粒长度有一定的促进或延长作用,但这种作用并不明显。对L-02细胞而言,Epithalon能有效的提高细胞端粒酶活性,并使细胞端粒的长度得到延长。结论:研究显示特定浓度的Epithalon在体外对肿瘤细胞HepG2有一定的抑制作用,这种抑制作用可能主要表现为S期阻滞,其对HepG2细胞端粒酶和端粒长度也有一定的正向影响。与此同时,Epithalon和人胎肝细胞L-02的作用显示,Epithalon具有激活端粒酶,延长端粒、促进L-02细胞生长的作用。这提示我们,Epithalon能通过提高端粒酶活性来延长端粒,进而起到延长正常细胞乃至生物体寿命的作用。Epithalon还可能起到稳定染色体的作用,减少染色体因不稳定而引起的畸变等,进而减少这种畸变导致的癌症。衰老、癌症是多因素积累的结果,而Epithalon可能会是一种较安全的预防治疗性药物,就其抗肿瘤机制而言,Epithalon在体内可能主要是通过免疫调节途径发挥抗肿瘤作用,如果与其它抗肿瘤药物联用,有望提高抗肿瘤活性,降低毒副作用。
万兰兰[9]2016年在《TT-1多肽对TT细胞以及联合IFN-α对HepG2细胞的抗肿瘤作用及机制研究》文中研究表明癌症仍是世界上致死率最高的疾病,尽管近年来在癌症的治疗方法上多有研究,但仍无法明显降低癌症患者的死亡率。随着甲状腺癌发病率的不断提高,该类型的癌症成为最为常见的内分泌恶性疾病。据统计,在发达国家和地区每100000个女性中有9.1个人会发生甲状腺癌,每100 000个男性中有2.9个会发生甲状腺癌。传统的甲状腺癌治疗方法为手术切除全部甲状腺组织后再进行放射性碘治疗,化疗以及生化疗法也被应用于治疗晚期甲状腺肿瘤。但对于分化类型较差的甲状腺癌,上述两种治疗方案治疗效果并不理想,在临床应用中受到了极大的限制。因此,亟需为分化较差的甲状腺癌患者开发研究高效低毒的治疗药物和治疗方案。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,是导致肝硬化患者死亡的主要原因。目前临床常用的肝癌治疗方法包括手术切除,肝移植手术以及热消融法和化疗方案,但效果均欠佳。近几年来出现的一种新型治疗方案——生物免疫治疗,具体方案包括:靶向治疗、肿瘤生物疫苗、单克隆抗体或免疫基因治疗等方法,目前这些方案已经在临床试验或者临床前试验中取得了一定的疗效,但是存在许多负面问题和弊端,治疗效果并不是十分理想。在该研究背景下,我们需为甲状腺癌和肝细胞癌的治疗寻找一种更加有效的治疗措施。近期的研究表明,抗菌肽不仅具有很好地抗菌活性,还可以选择性地杀伤肿瘤细胞,杀伤机制是肿瘤细胞表面的膜蛋白由于糖基化反应带有大量的负电荷,可以与阳离子型的两亲性抗菌肽发生特异性结合从而发挥杀伤作用。但抗菌肽对肝细胞癌和甲状腺癌的抗肿瘤效果如何,未见具体的相关报道。在本研究中,我们选取抗菌肽中已证明具有明显抗肿瘤作用的蜂毒肽(Melittin)作为原型,在其基础上利用生物信息学的方法进行改造得到新型多肽TT-1,相较其母肽极大的节约了成本。改造体TT-1不仅保留了Melittin氨基末端区域的活性位点,也增加了疏水性,并降低了净电荷,提高了TT-1的稳定性,降低了毒性。对改造后的多肽TT-1进行体内外试验,试验结果证明该多肽对甲状腺癌中分化类型较差的髓样癌以及肝细胞癌具有良好的抗肿瘤效果,具体实验结果如下:1.TT-1多肽对TT细胞具有显着的体内外抗肿瘤活性(1)细胞水平的实验表明,TT-1多肽能够在细胞水平显着抑制TT细胞的生长,而对于人正常甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-ori3-1细胞的生长抑制作用较低,即TT-1多肽对甲状腺癌细胞具有选择性抑制作用,并且这种生长抑制作用呈现出一定的剂量依赖和时间依赖关系。应用Annexin V-FITC/PI双染对TT细胞系进行凋亡考察,结果表明多肽TT-1能够有效地诱导TT细胞的凋亡,并且呈现一定的浓度依赖性。在TT-1多肽浓度为2、4、8μg/ml时,TT细胞的凋亡率分别为12.31%、18.62%和31.07%。机制研究显示TT-1多肽能够上调TT细胞内Bax的蛋白表达和mRNA水平,下调Bcl-2的蛋白表达和mRNA水平。此外,我们检测了TT-1多肽作用后TT细胞内Caspase-3和Caspase-9在蛋白和RNA水平的表达量,结果显示TT-1多肽的处理增强了Caspase-3和Caspase-9在蛋白质转录和翻译水平的表达。(2)动物水平实验结果表明,在TT细胞裸鼠皮下移植瘤模型中,对照组的肿瘤体积随时间的延长而增大,而TT-1多肽高中低剂量处理组(0.04 mg/kg体重、0.20 mg/kg体重、1 mg/kg体重)的肿瘤体积与其相比明显较小。并且与对照组相比,TT-1多肽给药组的肿瘤体积和重量呈现出剂量依赖性降低趋势,TT-1多肽(0.04-1 mg/kg体重)叁个剂量组的抑瘤率分别为5.8%,48.6%和56.8%。不同治疗组的荷瘤鼠体重在TT-1多肽治疗过程中无明显变化。HE染色结果显示,与对照组相比,TT-1多肽治疗组裸鼠的肿瘤组织表现出明显的肿瘤细胞数目的减少,同时不论对照组与治疗组裸鼠的肝脏和脾脏均无明显疾病特征。以上结果表明,TT-1多肽能够显着抑制TT细胞裸鼠皮下移植瘤的生长,体内抗肿瘤活性明显,且毒副作用较低。2.TT-1多肽对HepG2细胞体内外生长抑制作用明显,进一步联合IFN-α时发挥出极大的协同治疗作用(1)TT-1多肽与HepG2细胞共孵育72 h后呈现出对肿瘤细胞的剂量依赖性的生长抑制作用,TT-1多肽对HepG2细胞的半数抑制浓度(IC50)为3.762±0.285μg/ml。当TT-1多肽的孵育浓度达到32μg/ml时,肿瘤细胞HepG2的细胞存活率仅为14.8%。(2)构建HepG2裸鼠异位移植瘤模型,体内实验结果表明:TT-1多肽联合IFN-α抗肿瘤效果较单纯TT-1多肽治疗组显着增强。与对照组相比,TT-1多肽联合IFN-α治疗HepG2裸鼠的效果增强了近80%。机制研究证明TT-1多肽和IFN-α联合治疗的抗肿瘤作用是由NK细胞介导的,并且通过MICA-NKG2D通路特异性介导。综上所述,本论文首创性地研究了新型多肽TT-1对TT细胞以及联合IFN-α对HepG2细胞的抗肿瘤免疫治疗活性。通过体内外实验研究,证实了TT-1多肽对TT细胞具有特异性的杀伤作用,并通过诱导细胞凋亡实现。TT-1多肽对HepG2细胞具有明显的生长抑制作用,并且联合IFN-α对HepG2裸鼠移植瘤模型具有良好的体内抗肿瘤作用,阐述了联合治疗的抗肿瘤免疫治疗机制,表明该作用由NK细胞引起,并由MICA-NKG2D介导,为甲状腺髓样癌和肝癌的治疗策略提供了新的发展方向和发展思路。
冀会方[10]2017年在《鸦胆子生物肽的分离纯化及其对人乳腺癌细胞MCF-7作用机制研究》文中指出恶性肿瘤严重威胁人类健康,然而,大部分抗肿瘤药物存在着选择性差、毒副作用大等缺点。因此,寻找高效低毒、天然来源的抗肿瘤成分迫在眉睫。鸦胆子为苦木科植物鸦胆子[Brucea javanica(Linnaeus)Merrill]的干燥成熟果实,主产于我国广东、广西、海南和福建等地。该药为清热解毒类中药,味苦、性寒,临床上常用来治疗肺癌、前列腺癌和胃肠道癌等。近年来,已从鸦胆子中分离获得多种抗肿瘤有效成分,然而关于鸦胆子蛋白质及多肽抗肿瘤的研究却鲜少报道。乳腺癌是造成女性肿瘤患者死亡的首要因素,而中医药对于乳腺癌的治疗有着明显的特色与优势,清热解毒便是重要治则之一。本论文以鸦胆子蛋白质为研究对象,通过酶解法获得生物肽,然后采用超滤、色谱等方法进行离纯化,最终获得显着抑制人乳腺癌MCF-7细胞株增殖的多肽组分F9-9。本文的主要研究成果如下:鸦胆子主要成分及蛋白质组成研究。采用旋光法、索氏提取法、凯氏定氮法、烘干法、马弗炉法分别进行鸦胆子淀粉、粗脂肪、蛋白质、水分和灰分含量的测定,含量依次为 49.26 ±0.02%,16.16 ±0.13%,17.47 ±0.12%,6.74 ±0.05%和5.61 ±0.10%;采用顺序抽提法提取鸦胆子清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白四类蛋白组分,并用凯氏定氮法进行定量,各蛋白组分占总蛋白含量的百分比依次为 15.01%、8.11%、2.47%和 44.92%。鸦胆子抗肿瘤肽的制备工艺研究。以含量相对较高的谷蛋白、清蛋白和球蛋白为材料,采用胃蛋白酶进行酶解,将酶解产物超滤(MWCO = 3kDa)后获得滤过液,MTT结果显示这叁类蛋白的小分子产物(≤3 kDa)在浓度为50 μg·mL-1时,对MCF-7细胞的增殖抑制率分别是71.12%、75.26%和17.04%,由于球蛋白组分中蛋白质含量高达79.28%,因此确定球蛋白为获得抗肿瘤肽的最优蛋白质来源。然后,采用正交实验法确定球蛋白的最佳提取工艺参数为:NaCl浓度5%,提取时间1.5 h,固液比1:12。最后,在底物浓度[S]为1%,酶与底物浓度比[E]/[S]为1:10,水解时间为48h的条件下,采用多种蛋白酶水解球蛋白,最终确定胃蛋白酶为水解球蛋白的最优酶。抗肿瘤肽的分离纯化。依次采用超滤截留、SephadexG-10凝胶色谱和C18反相高效液相色谱对鸦胆子球蛋白的胃蛋白酶酶解产物进行分离纯化。酶解产物经G4漏斗过滤后,进行超滤(MWCO = 3kDa),获得小分子产物,并命名为鸦胆子球蛋白酶解产物(BJGH)。研究发现BJGH对MCF-7细胞株具有较强的增殖抑制活性,经BCA定量后,作用于MCF-7细胞72h,IC50值为2.0050.04μg·mL-1。BJGH 经 SeperdexG10 分离后,获得 9 个组分(F1~F9),作用 MCF-7细胞72 h后,IC50值分别为33.68 ± 0.03μg·mL-1,69.87 ± 0.04μg.mL-1,32.60 ± 0.04μg·mL-1,2.03 ± 0.04 μg·mL-1,2.44 ± 0.02μg·mL-1,0.47 ± 0.02μg·mL-1,0.42 ± 0.03μg·mL-1,0.30±0.02μg·mL-1和0.25±0.02μg·mL-1,其中,组分F6、F7、F8、F9与BJGH相比,对MCF-7细胞株的增殖抑制活性显着增强(P<0.05)。进而,采用半制备反相高效液相色谱对活性最高的组分F9进行分离,共获得9个亚组分(F9-1~F9-9),其中,F9-7,F9-8和F9-9显示出较强的细胞增殖抑制活性,在样品浓度为0.25μg·mL-1,作用MCF-7细胞72h后,它们对MCF-7细胞的增殖抑制率分别为50.20%、46.91%和62.74%;进一步测得叁组分的IC50值分别为 0.25 ± 0.01μg·mL-1,0.32 ± 0.01μg·ml-1 和 0.124 ± 0.004μg·mL-1。组分F9-9抗肿瘤作用机制研究。采用流式细胞术考察组分F9-9对MCF-7细胞株细胞凋亡及细胞周期的影响,设置F9-9浓度为0.03125μg·mL-1、0.0625μg·mL-1和0.125μg·mL-1。Annexin V-FITC/PI双染法结果表明,组分F9-9中浓度及高浓度作用于MCF-7细胞48h后,细胞凋亡数显着高于阴性对照组(P<0.05),细胞早期凋亡总数由对照组的4.47%分别上升为13.30%和25.25%,晚期凋亡总数由对照组的13.40%上升为21.90%和25.40%;而低浓度组未造成明显的凋亡现象(P<0.05)。PI单染法的结果表明,F9-9低浓度作用于MCF-7细胞48 h后,与阴性对照组(67.34%)相比,加药组可引起83.79%细胞发生明显的G0/G1期阻滞(P<0.05)。因此,F9-9低浓度时可能通过阻断细胞周期(G0/G1期)而抑制细胞增殖,在中、高浓度时,则通过诱导细胞凋亡而抑制细胞增殖。应用qRT-PCR技术检测F9-9对抑癌基因P53和PTEN,以及肿瘤转移抑制基因NM23H-1 mRNA表达的影响。设置F9-9浓度为0.125μg·mL-1,0.25 μg·mL-1和0.5 μg·L-1,与MCF-7细胞作用24 h后,结果表明,与阴性对照组相比,加药组细胞P53,PTEN和NM23H-1mRNA的表达量均明显增加(P<0.05)。其中,F9-9低、中、高叁个剂量组细胞P53mRNA表达量分别为对照组的1.80、2.02和1.84倍;PTEN mRNA表达量分别为对照组的5.14、3.72和4.76倍;NM23H-1 mRNA表达量分别为对照组的3.54、2.78和2.00倍。因此,F9-9可能通过上调P53,PTEN和NM23H-1 mRNA表达而抑制MCF-7细胞的增殖。本研究从鸦胆子球蛋白中获得了可显着抑制乳腺癌细胞增殖的多肽组分F9-9,为该药的临床引用提供了一定的理论指导。
参考文献:
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[4]. 中华真地鳖(Eupolyphaga sinensis)抗肿瘤蛋白分离纯化及其体外抗转移活性研究[D]. 王凤霞. 山东大学. 2013
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[8]. 四肽Epithalon对HepG2细胞和L-02细胞端粒及端粒酶活性的影响[D]. 童师亮. 重庆大学. 2007
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[10]. 鸦胆子生物肽的分离纯化及其对人乳腺癌细胞MCF-7作用机制研究[D]. 冀会方. 北京中医药大学. 2017
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