吴全忠[1]2001年在《猪链球菌2型在模型动物豚鼠体内的动态分布及基因免疫》文中研究说明用豚鼠建立了猪链球菌2型（Streptococcus suis Type 2）引致脑炎和败血症的动物模型，研究了猪链球菌2型在动物模型体内的动态分布。并将该菌毒力相关的溶菌酶释放蛋白基因（mrp）克隆到真核表达载体构建了真核表达质粒，并研究其对豚鼠的免疫效果。 1 选用对猪具有致病性的猪链球菌2型江苏分离株HA9801感染豚鼠，引致脑炎及败血症，建立了动物模型。结果显示16～24日龄的豚鼠较易感，最佳感染途径是皮下注射，鼻腔、腹腔次之。感染豚鼠表现出典型脑炎的临床症状及病理变化。经重复试验检测了该菌株对豚鼠的LD_(50)，从感染死亡豚鼠体内包括脑脊液、大脑、血液及各实质器官均可分离出该病原菌，与仔猪自然感染情况相似。该动物模型的建立，为进一步探究猪链球菌2型感染的体内动态分布、感染机制、毒力因子及免疫应答奠定了基础。 2 用猪链球菌2型江苏分离株HA9801，皮下或鼻腔接种豚鼠，检测体内动态分布。结果显示：皮下接种后，该菌最早可于28小时到达心血，32小时还可在肺、脾及扁桃体中分离到，32～36小时除上述器官外还见于肝、肾、脑、脑脊液，并引发神经症状而致豚鼠死亡，接种后120小时心血和扁桃体阳性率分别可达61.5％和69.2％。鼻腔接种同居感染表明，该菌很快传播给其它豚鼠，第8天鼻腔拭子阳性率100％（10/10）；感染豚鼠心血细菌检查结果表明，第9天50％呈阳性，第12天70％（7/10）呈阳性。脑组织检查结果显示，只有出现神经症状及死亡的豚鼠，才能从脑脊液和脑组织中分离到细菌，说明细菌突破血脑屏障，是引发脑炎的前提。 3 将含有猪链球菌2型mrp基因的质粒pMR11，在大肠杆菌中表达了136KD的该菌溶菌酶释放蛋白（MRP，muramidase-released protein），将表达菌用超声波破碎制成的抗原，免疫豚鼠，通过免疫转印检测到MRP的特异抗体，用PPA-ELISA对检测了血清效价；攻毒表明表达蛋白对猪链球菌2型有一定的保护作用。 南京农业大学 博士学位论文 4用地高辛分别对猪链球菌2型的溶菌酶释放蛋白基因（mrp）和胞外蛋白基因（epf）进行了高效标记，结果探针特异敏感，提取23株猪源涟球菌和1株人源的猪链球菌共24株菌的MA，进行斑点杂交检测，结果mrp／mrp＊和ePf／ePf＊阳性率均为 58．33％（14／24），PCR结果和 ELISA检测 MRP结果一致。表明地高辛标记的核酸探针，可用于猪链球菌2型的分子流行病学涉调查。 5将猪链球菌2 型编码MRP的mrn基因，插入到真核表达载体pcDNA3．1（一MccHisC质粒CMV启动于的下游，构建了真核表达质粒pCMR。应用PCR技术能扩增出885hp的mrp基因的特异条带，通过双酶切鉴定克隆方向正确，将该质粒用脂质体转染方法转染卯／0细胞，应用RT－PCR、免疫转印和免疫细胞组化染色，鉴定其得到了表达，为进一步在体内研究mrp基因的功能和作用机制奠定了基础。 6用脂质体包裹的含有猪链球菌 2型 mrp基因的真核表达质粒（pcMR）及该菌 HA980株全菌灭活抗原，分别免疫模型动物豚鼠，肌肉注射，通过厂PA－ELISA检测抗体的产生。免疫后，豚鼠产生MRP抗体滴度呈上升趋势；免疫 2用后，MTT法检测脾淋巴细胞转化率（SI）、腹腔巨噬细胞吞噬活性（AMA），基因免疫引起的细胞兔疫比全菌兔疫组强烈。兔疫后第 16天，各组豚鼠接种 HA9801攻毒，结果显示，mro基因免疫效果虽不如全菌疫苗组，但对豚鼠有一定的保护力，说明MRP具有一定的保护性功能
范红结[2]2003年在《猪源链球菌类M蛋白基因的克隆、序列分析、表达及动物免疫试验》文中进行了进一步梳理马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)和猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)是重要的人兽共患病的病原，能引起猪和人类的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎以及突发性死亡，对养猪业造成巨大的经济损失。马链球菌兽疫亚种表面的类M蛋白(M-like protein)和猪链球菌2型表面的溶菌酶释放蛋白(Muramidase released protein,MRP)是重要的毒力因子和保护性抗原。本文在分子水平对以上毒力因子进行了较系统的研究，并将二者进行了串连表达及猪体免疫试验，为猪链球菌病的防制进行了有益的探索。 1 马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因克隆，序列分析及猪源链球菌类M蛋白基因检测 根据已发表的马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)的类M蛋白基因序列，设计和合成一对引物，以猪源马链球菌兽疫亚种ATCC35246株的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增出类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET-32a(+)中，测定其序列，在GenBank登录，接收号为AY263781。类M蛋白基因含一个完整的开放阅读框，全长为1137bp，编码379个氨基酸残基。经DNA Star软件分析，ATCC35246株类M蛋白基因与马源兽疫亚种W60株、马亚种的类M蛋白基因及A群化脓链球菌的M蛋白基因的同源性分别为86.9％、30.8％、29.4％；推导的氨基酸序列的同源性分别为84.3％、21.9％、23.4％。但ATCC35246株类M蛋白的C末端细胞膜锚定区与M蛋白、马亚种类M蛋白高度同源。用上述设计的引物进行PCR试验，检测34株猪源链球菌类M蛋白基因，发现所有C群猪源链球菌均能检测出类M蛋白基因，而所有猪链球菌(Streptococcus suis)1型和2型菌株及B群、D群链球菌均不能检出类M蛋白基因。 本研究首次克隆了猪源马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因，并对该基因进行了序列分析，证实马链球菌兽疫亚种猪源株与马源株有较大差异。 2 猪源马链球菌兽疫亚种9株中国株类M蛋白基因的克隆与序列分析 利用PCR技术，分别扩增国内9省市从1974～2003年分离的马链球菌兽疫亚种类的M蛋白基因，对其进行克隆、测序及序列分析，进而推导其相应的氨基酸序列。结果发现，9分离株中的7株类M蛋白基因片段长度为1 137bp，含一个阅读框，编猪源链球菌类M基因的克隆、序列分析、表达及动物免疫试验码379个氨基酸残基，另外两株eG一74一63和Cp一。一04的长度分别为1 143bp及1125bp。除CP一0104分离株外，8株菌的类M基因的核普酸同源性高达%.9%一99.9%，推导的相应氨基酸序歹，】同源性高达95.30，0一x00o，o。上述测定的ATCC35246、CC、CxyolZ、SH0016、CY分离株类M基因序歹.J已被GenBank收录，登录号分别为AY263781、AY263782、 AY263783、AY263784、AY265990.上述9株猪源株与国外发表的马源马链球菌兽疫亚种W60株类M基因的核普酸同源性达81.6%一87.0%，推导的相应氛基酸序列同源性为78.1%一84.3%;猪源株与人源马链球菌兽疫亚种类M基因的核普酸同源性为81 .7%~91.8%，推导的相应氨基酸序列同源性为76.0%一90.5%. 9株分离株除CP一0104株外，信号肤的序列完全一致，与马源马链球菌兽疚亚种W60株类M蛋白的信号肤相比，其27、28、30、32位的氨基酸残基分别由S、S、V、A突变为G、v、A、5.在类M蛋白的C末端，9株分离株的细胞锚定区的序列亦完全一致，均含有LPSTGE共同的基序.在类M蛋白的高变区，通过比较9株兽疫亚种分离株推导的类M蛋白的氨基酸序歹，l发现，Al，CC35246、CC、CY、SH0016、CT、CG一74一63等6株分离株类M蛋白高变区的氨基酸完全一致，其余3株分离株有较小的差异.其中，CXY012株109位氨基酸残基由L突变为F，143位氨基酸残基由A突变为E，157位由K突变为E。CW03株第113、116位氨基酸残基由I、K突变为F、E，第121、127、137、139、140等处由E、Q、R、D、A突变为K、P、H、T、T.CP一0104与其它猪源链球菌高变区的变异更大，在106、107、111、116、118、121、122、123等 28处的氨基酸发生T突变，且在126-128、140一146位分别缺失了3个和6个氛基酸残基。酶切位点分析显示，9株分离株均在524ni处出现Hindln酶切位点，而人源和马源分离株均没有该酶切位点. 本结果研究表明马链球菌兽疫亚种类M蛋白具有宿主特异性，与马源、人源兽疫亚种分离株类M蛋白的差异主要在106一1“位氛基酸的高变区及27一32位氨基酸残基的信号肤。3马链球菌兽疫亚种10株国内分离株对小鼠免疫效力的评价 取国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种，分别制备灭活杭原，免疫清洁级ICR小鼠。小鼠分20组，每组10只，分别用以上10株菌免疫，然后用同源菌株和ATCC35246株攻击。结果表明，同源菌株攻击，免疫保护率均在90%以上;而以ATCC35246攻击异源菌免疫的小鼠，免疫保护率为80%一100%.本研究结果表明，我国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的杭原性差异不大，单一菌株疫苗可用于不同地区的猪群。中文摘要4猪链球菌2型mrP基因免疫功能片段的克隆、表达及动物试验 根据猪链球菌2型(StrePcococcus suis
参考文献：
[1]. 猪链球菌2型在模型动物豚鼠体内的动态分布及基因免疫[D]. 吴全忠. 南京农业大学. 2001
[2]. 猪源链球菌类M蛋白基因的克隆、序列分析、表达及动物免疫试验[D]. 范红结. 南京农业大学. 2003
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