商洪才[1]2005年在《丹酚酸A神经保护效应评价及机制》文中提出脑血管疾病损伤的脑保护与促进康复,降低致残率,恢复受损的机体功能仍是神经科学的前沿问题。目前临床上已知作用途径的治疗药物未能使脑病致残率获得有效降低。而“九五”、“十五”数项国家攻关课题研究显示了中药方剂及方中有效组分对脑损伤保护具有一定作用。 目的: 客观评价中药丹酚酸A对脑缺血损伤的神经保护效应,初步探讨丹酚酸A保护神经元的作用机制、可能途径和相关靶点,为研制中药神经保护制剂提供科学依据。 方法: 采用在体和离体相结合的综合评价方法,复制/建立大脑中动脉阻塞模型和缺氧/复氧损伤的细胞模型;以神经功能评分、脑梗塞指数、脑含水量、脑组织形态学等为评价指标,在体考察了丹酚酸A对急性脑缺血损伤的保护作用;集成流式细胞术、酶联免疫(ELISA)、RT-PCR等细胞分子生物学先进技术,以细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)、细胞存活率(台盼蓝排斥法)、早期凋亡率(FCM)、电镜超微结构、神经特异性烯醇化酶(NSE)/神经生长因子(NGF)、致炎因子(IL-1 β)作为评价指标,先后评价了丹酚酸A对缺氧/复氧损伤神经元和星形胶质细胞的作用;在此基础上,制备了星形胶质细胞四种条件培养液,对不同条件下中药干预星形胶质细胞产生的保护效应进行了比较和验证;最后以IL-1 β——p38MAPK——Bax为线索,对中药丹酚酸A神经保护作用的可能途径和相关靶点进行了初步探讨。 结果: 1 丹酚酸A能够明显改善急性脑缺血大鼠的神经行为缺损症状,显着减小梗塞指数,减轻脑水肿,且低剂量组(2.5mg/kg)效果较好,效应并不随剂量增加而增强; 2 与丹酚酸B治疗脑缺血相比较,在几个主要药效评价指标上,丹酚酸A的总体效应呈现更显着的趋势;
李星儿[2]2012年在《针刺对宫内窘迫缺氧缺血性脑损伤大鼠新生神经细胞凋亡的影响研究》文中研究表明目的新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)严重危害新生儿的健康,是导致脑性瘫痪(cerebral palsy, CP)、癫痫(epilepsy)等儿童脑病的直接因素。对此类疾病的治疗至今仍为世界性医学难题。如何有效改善HIE所致的病理状况一直是医学界研究的重要内容之一。近十几年来,针灸在治疗新生儿缺氧缺血性脑病后遗症之一的脑瘫方面,取得了很大突破,针灸在脑瘫领域展现出空前的繁荣景象。随着研究的深入,一些学者发现患儿接受针灸治疗的年龄越小,疗效越显着,因此萌生了在新生儿期即对缺氧缺血性脑损伤的患儿进行针灸治疗的想法。但由于HIE的危险性和严重性、现代医学目前在我国医学系统尤其是新生儿急救领域的主导地位、中医针灸对该病作用机制的实验研究尚属空白、中医“科学性”受现代医学质疑、针灸作为有创治疗在新生儿领域的安全性等多种原因,决定了目前中医针灸难以进入该领域一展所长。因此,先在动物实验上验证中医针灸的有效性和安全性,并深入探索和揭示针灸治疗HIE的作用机制,将有助于推动针灸治疗进入新生儿HIE领域的进程。靳叁针疗法是已故广州中医药大学治疗弱智儿童的首席教授靳瑞教授所创立的学术体系,被誉为“岭南针灸新流派”。靳瑞教授及其带领的靳叁针团队,以“靳叁针头穴”为主治疗小儿脑病二十余年,疗效肯定,国家中医药管理局已将“靳叁针治疗儿童精神发育迟滞和儿童自闭症临床规范化研究”两项成果作为临床适宜疗法向全国推广。目前对“靳叁针疗法”治疗小儿脑病的临床观察研究很多,但缺乏对其作用机理的实验基础研究。本论文目的有二：一方面,以“靳叁针头穴”为切入点,旨在探索针刺对HIBD新生大鼠的作用机制是否与减少新生神经细胞凋亡有关,并进一步寻求其起效通路,为针灸治疗HIE寻找可靠的实验依据；另一方面,以针刺介入时间为切入点,比较HIBD发生后不同时间开始针刺对新生神经细胞凋亡相关指标的影响,为临床研究提供必要的理论支持。方法文献研究本部分回顾了现代医学对新生儿HIE的认识和治疗进展、古代中医对新生儿HIE认识和现代中医治疗进展、神经干细胞凋亡基因的研究进展等叁大内容。在此基础上对新生儿HIE的中西医治疗现状进行了归纳总结。实验研究本部分共包括六个实验项目。实验一采用延迟5min剖宫产术模拟宫内窘迫制造HIBD新生大鼠模型,设立正常组(自然分娩的新生大鼠)和假手术组(正常剖宫产术分娩的新生大鼠)作为对照组。根据新生大鼠出生时神经行为学表现、脑组织HE染色鉴定造模成功。将实验一中获得的各组新生大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、针刺1组和针刺2组,每组再根据处死观察的时间分为21d、28d、35d、42d、49d亚组,每组雌雄各半,饲养到第14天时,用苦味酸标记后,进入后续实验。实验二观察各组新生大鼠14～49天的体重变化,研究针刺对HIBD新生大鼠体重的影响。实验叁～六研究针刺对HIBD新生大鼠大脑皮层缺血灶中的新生神经细胞凋亡的影响。其中：实验叁采用Tunel法检测大脑皮质中凋亡的神经细胞数量；实验四采用免疫组织化学法检测大脑皮质中促凋亡基因Caspase-3蛋白的表达；实验五采用免疫组织化学法检测大脑皮质中BrdU.Nestin蛋白的表达,来反映大脑皮质中新生神经干细胞的数量和细胞增殖状况；实验六采用免疫组织化学法检测大脑皮质中抗凋亡基因14-3-3蛋白的表达。结果实验研究1、建立模型1)新生大鼠死亡率：出生21天时各组死亡率为正常组5.13%(4/78),假手术组6.82%(3/44),模型组14.66%(28/191),卡方检验p=0.049。2)新生大鼠出生时表现：正常组甫出生即全身呈现较深的粉红色,在雌鼠的舔舐下可扭动身体、挥舞四肢、发出叫声,并可迅速吃乳。假手术组和造模组甫从子宫中取出时,均全身青紫或苍白,四肢伸展,没有呼吸,心跳过速,对触觉刺激无反应。3)新生大鼠出生第2天翻正反射：最短翻正时间假手术组<正常组<模型组,其中模型组与正常组和假手术组的差异均有统计学意义(P<0.01)。10次翻正中的成功次数正常组>假手术组>模型组,其中模型组与正常组和假手术组的差异均有统计学意义(P<0.01)。4)新生大鼠出生第14天悬吊试验：正常组和假手术组完成试验的时间差别无统计学意义(P>0.05),造模组完成试验的时间均短于正常组(P<0.01)和假手术组(P<0.01)。5)新生大鼠出生第14天斜坡试验：正常组和假手术组完成试验的时间差别无统计学意义(P>0.05),造模组完成试验的时间长于正常组(P<0.01),而和假手术组的差别无统计学意义(P>0.05)。其中,正常组参加斜坡试验的新生大鼠27只,成功25只(92.6%),不成功2只(7.4%)；假手术组参加斜坡试验的新生大鼠15只,成功13只(86.7%),不成功2只(13.3%)；造模组参加斜坡试验的新生大鼠84只,成功55只(65.5%),不成功29只(34.5%)。卡方检验P<0.01,可以认为斜坡试验成功与否的结果与组别有关。6)脑组织HE染色：正常组大脑皮质的神经元分布由表及里可见分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、内颗粒层、内锥体细胞层、多形细胞层,神经元的6层结构完整。神经元圆形或锥形,细胞质内见嗜碱性均匀分布的尼氏体,细胞核位于胞体中央,核膜明显。在一片正常细胞中间或出现个别固缩细胞。假手术组大脑皮质神经元的6层结构基本完整,局灶区域可见3层(外锥体细胞层)锥体细胞胞浆红染,胞核浓缩深染,结构消失。模型组大脑皮质的3层和5层(外锥体细胞层和内锥体细胞层)锥体细胞数量减少,细胞体积缩小,变成叁角形,胞浆呈均匀的嗜伊红染色,胞核浓缩深染,结构消失。部分海马椎体细胞层细胞亦见上述变化。2、针刺对体重的影响：新生大鼠14-49天体重：35天龄前,模型组、针刺1组、针刺2组和正常组或假手术组的体重差异有统计学意义,42天龄后,各组的体重差异均无统计学意义。3、针刺对细胞凋亡的影响：针刺1组凋亡细胞个数21-35天龄时和模型组的差异均无统计学意义(P>0.05)。针刺2组凋亡细胞个数35-49天龄时均少于模型组(P<0.01)。35天龄时,针刺2组凋亡细胞个数少于针刺1组(P<0.05)。4、针刺对Caspase-3的影响：针刺1组Caspase-3的表达21天龄时和模型组的差异无统计学意义(P>0.05),28天龄时低于模型组(P<0.01),35天龄时高于模型组(P<0.01)。针刺2组Caspase-3的表达35天龄时高于模型组(P<0.01),42和49天龄时和模型组的差异无统计学意义(P>0.05)。35天龄时,针刺1组和针刺2组Caspase-3的表达差异无统计学意义(P>0.05)。5、针刺对BrdU的影响：针刺1组BrdU的表达21-35天龄时和模型组的差异无统计学意义(P>0.05)。针刺2组BrdU的表达35-42天龄时和模型组的差异无统计学意义,49天龄时低于模型组(P<0.01)。35天龄时,针刺1组和针刺2组BrdU的表达差异无统计学意义(P>0.05)。6、针刺对Nestin的影响：针刺1组Nestin的表达21和35天龄时和模型组的差异无统计学意义(P>0.05),28天龄时高于模型组(P<0.01)。针刺2组Nestin的表达35-42天龄时和模型组的差异无统计学意义(P>0.05),49天龄时高于模型组(P<0.01)。35天龄时,针刺2组Nestin的表达低于针刺1组(P<0.01)。7、针刺对14-3-3的影响：针刺1组14-3-3的表达21天龄时高于模型组(P<0.01),28天和35天龄时,表达急剧降低,和模型组的差异无统计学意义(P>0.05)。针刺2组14-3-3的表达35天龄时低于模型组和正常组(P<0.01),42天和49天龄时,表达略有上升,而模型组和正常组在此阶段的大脑皮质中已经没有表达。35天龄时,针刺2组14-3-3的表达低于针刺1组(P<0.01)。结论文献研究1、新生儿缺氧缺血性脑病的发病机制和病理生理过程复杂,中西医多种方法综合治疗是未来的发展方向。目前国内外对该病的治疗仍以支持疗法和对症处理为主,高压氧、亚低温、神经营养因子、神经干细胞移植等多种方法仍以动物实验研究为主,未大规模应用于临床。2、古代中医对该病的理论认识和临床经验相当丰富,古人已经发展出一套处理新生儿缺氧缺血性脑病类似症状的辨证论治方案。迄今为止,尚未有学者对古代中医治疗该病的方法进行过系统总结,也未与现代中医的临床和实验研究成功对接。这是一个巨大的宝库,值得广大中医研究者去挖掘和应用。3、现代中医在新生儿缺氧缺血性脑病治疗领域以数种单一中药提取物制剂为主,临床应用也未体现中医的辨证论证精神。针灸推拿对该病的治疗集中于其神经后遗症——脑性瘫痪上,真正在新生儿期介入治疗的临床报道非常少。实验研究1、延迟5min剖宫产术在短期内可以制备大量长期存活的HIBD新生大鼠,高度模拟胎儿宫内窘迫的发病机制,且操作简便,是一种值得推广的研究缺氧缺血性脑损伤的造模方法。该方法可造成相对温和的缺氧缺血性脑损伤,新生大鼠出生后21-49天存在神经细胞“延迟凋亡”现象,是研究中枢神经细胞凋亡的理想模型。2、获得正常新生大鼠神经系统发育和细胞凋亡的生理规律：(1)正常新生大鼠21-42天龄时大脑皮质的神经干细胞持续存在,42-49天年龄段突然下降,表明42-49天年龄段,新生大鼠神经系统发育接近成熟。(2)正常新生大鼠42天龄大脑皮质的神经细胞出现凋亡高峰,随后逐渐下降。42天以前,大脑皮质中可能存在某些抑制Caspase-3促凋亡作用的因素,抑制神经细胞过度凋亡,14-3-3可能是其中一个因素。42天以后,14-3-3表达消失,大量神经细胞进入凋亡程序,但Caspase-3可能与此无关。3、获得模型组新生大鼠细胞凋亡相关的病理规律：(1)该模型42天后大脑皮质的神经细胞开始大量凋亡,新生神经干细胞减少,同时伴随异常的细胞增殖,这些增殖的细胞很可能不是正常成熟的神经元,而是修复损伤的其他神经细胞。(2)42-49天年龄段,大脑皮质神经细胞出现“延迟凋亡”的现象,与Caspase-3的表达存在因果关系。4、获得针刺对观察指标的作用规律：(1)针刺具有抑制HIBD新生大鼠大脑皮质中的细胞凋亡和BrdU的表达、提高大脑皮质中Nestin和14-3-3表达水平的作用。其中,针刺2组的上述作用均优于针刺1组。(2)针刺对神经细胞凋亡的抑制作用,可能与针刺提高14-3-3的表达水平有关,并通过抑制凋亡,间接抑制了BrdU的表达,另一方面,针刺具有促进Nestin在大脑皮质中表达的作用,能提高损伤区的新生神经干细胞水平,从而修复受损组织。(3)针刺对Caspase-3的抑制作用不明显,针刺抑制HIBD新生大鼠神经细胞凋亡的作用很可能不是通过Caspase-3途径来实现的。5、针刺介入时间研究对临床应用的启示：(1)决定针刺介入时间的关键,不一定在于越早越好。最佳的针刺介入时机,应取决于受针刺影响的靶蛋白,以及该蛋白在HIBD模型神经系统发育过程中表达发生转折的年龄段。(2)针刺影响靶蛋白表达的维持时间偏短,提示机体对针刺具有耐受性。因此找准关键时间点介入针刺治疗,才能更大限度地提高疗效。在治疗过程中,定时更换穴位进行刺激,可能有利于减少机体对该穴位的耐受性,提高针刺治疗敏感度。
房明东[3]2016年在《基于“肾—脑”相关理论探讨六味地黄汤对新生大鼠HIBD的作用机制研究》文中提出研究背景新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxiac-ischemic encephalopathy,HIE)是指由于围生期窒息引起的缺氧缺血性脑损伤(hypoxiac-ischemic brain damage,HIBD),临床上表现为一系列中枢神经异常症状[1],如意识障碍、惊厥、肌张力改变等,并且在治疗后常遗留不同程度的神经系统后遗症。目前国内外对HIE的发病机制仍然不完全清楚,能量代谢障碍、氧自由基损伤、钙离子超载、兴奋性氨基酸的毒性作用、炎症反应、细胞凋亡等机制是目前研究较多的方面。治疗方面,在基本的“叁支持”、“叁对症”之上,除了传统的高压氧、亚低温、脑细胞代谢激活剂等疗法和药物治疗之外,神经营养因子、自由基清除剂、促红细胞生成素、干细胞移植疗法等新兴药物和疗法的研究正受到大家的青睐,但并未在临床广泛使用。中医药治疗HIE的报道日渐增多,也取得了一些疗效,比如丹参注射液、川芎嗪等有大量报道,证明其临床疗效。然而却日渐陷入“中药西用”的境地：多数的报道都是运用活血化瘀药治疗HIE或者单纯依据中药药理指导临床,缺少了中医辨证论治的理念；此外,将HIE病位限定于脑,也缺少了中医的整体观念。而中医“肾-脑”相关既有丰富理论支持,又有广泛临床实践,所以,本研究尝试用补肾代表方六味地黄汤以治疗西医学脑病HIE。研究目的跳出以往中医药研究HIE的思路和模式,基于中医学藏象学说中“肾与脑”的密切联系,运用六味地黄汤治疗新生大鼠HIBD,观察其治疗效果并探讨其作用机制,不仅为中医“肾-脑”相关、上病下取等理论提供了科学依据,也为中医学治疗现代脑病提供新的思路和治疗模式。文献研究文献研究列举了与HIE相似的中医儿科病名,如胎弱、梦生,等等,对其病因病机、治疗原则进行阐述。进而认为这些胎病的发生主要有两个原因：胎内因素和外感因素。而内因是本,外因是标,所以补肾固本、填精益髓、调理内因,是治疗胎病的最佳手段。在此基础上,从历史源流、物质基础、经络联属、临床研究、实验研究五个方面充分论证了“肾-脑”相关的合理性。最后对于六味地黄汤的现代药理研究以及其治疗现代脑病的进展也进行了论述。实验研究实验一：健康SPF级7日龄SD大鼠88只,雌雄不限,体重15±2克。实验动物随机分为2组,第一组56只,运用经典Rice-Vannucci模型方法进行常规造模处理；第二组32只,为实验对照组。第一组造模成功后再随机分为两组,即HIBD模型组(A组,n=32)、六味地黄汤组(C组,n=24),实验对照组设为假手术组(B组,n=32)。A组和B组再随机分成4个亚组,每组分别在造模完成2h、Id、3d、7d进行动物处死。C组则随机分为3个亚组,分别在造模完成给药后1d、3d、7d进行动物处死。中药组灌胃量为0.3ml/10g体积,每天1次,连续灌胃7d。模型组和假手术组则予同等剂量生理盐水灌胃。密切观察各组大鼠行为能力变化情况。各组分别在预先设定时间点断头取脑,石蜡切片行HE染色观察脑组织的病理变化。实验二、实验叁在分组、造模灌胃方法、处死时间上均同实验一。实验二在断头取脑之前采用股动脉采血,分离血清。采用酶联免疫吸附法(Elisa)测定不同时间点样品中丙二醛,超氧化物歧化酶,神经元特异性烯醇化酶(MDA, SOD, NSE)的水平。实验叁则采用逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)测定脑组织中HIF-1α的基因表达情况。实验结果1.行为能力改变：造模过程中以及造模后都会出现很多行为能力的改变,尤其是对侧肢体运动障碍,夹尾右旋,后期眼睑下垂、睁眼困难等改变具有特征性。假手术组无类似情况。药物组初期也有行为能力的改变,而后期逐渐消失2.HE染色：模型组病侧海马锥体细胞数量减少,排列紊乱,细胞核溶解、消失,细胞体变小,海马区域部分细胞可见水肿、空泡样变；假手术组也存在很轻微的病理改变,后期逐渐修复。药物组在初期的病理改变同模型组,后期逐渐恢复,与假手术组接近。3.NSE：模型组血清NSE水平2h即明显升高,且随时间逐渐升高,假手术组变化不明显,中药组则逐渐下降,与模型组相比,第3d、7d差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01)4.MDA：模型组与假手术组MDA水平在2h无明显变化,1d时中药组与模型组相比有显着差异(p<0.01),而与假手术组接近,但在此后各时间点中药组与模型组差异不明显。5. SOD:SOD水平在2h无明显变化,而在1d、3d、7d时,模型组与中药组相比,具有显着差异(p<0.01),中药组SOD水平与假手术组接近。6. HIF-1 α:模型组HIF-1α的基因表达在2h即增强,1d时下降,随后又逐渐上升。与中药组相比,在3d、7d时具有显着差异(p<0.05)。中药组HIF-1α基因表达水平与假手术组接近。研究结论1. “肾-脑”相关,补肾治脑,具有丰富的理论支持和广泛的临床实践,这为六味地黄汤治疗治疗HIBD提供了理论支持。2.六味地黄汤能促进病变脑组织的修复,降低血清NSE浓度,提高脑组织SOD活性,并能下调HIF-1α的基因表达,对MDA含量也有一定的下调作用。3.六味地黄汤对新生大鼠HIBD损伤确有治疗作用。其作用机制与HIF-1α有关：通过提高SOD活性,降低MDA水平,然后通过二者对HIF-1α的调节机制从而下调HIF-1α的表达,保护缺氧缺血脑组织,促进受损神经元修复,降低血清NSE浓度。
郑晓娟[4]2006年在《野黄芩苷抗缺血性脑损伤作用及机制研究》文中认为野黄芩苷是从菊科飞蓬属植物灯盏细辛中提取的一种单体成分，纯度可达96％以上。本论文研究了野黄芩苷在动物实验中对缺血性脑损伤的治疗和预防作用，并对其产生作用的机制进行了初步探讨。 通过研究野黄芩苷在大鼠线栓法致局灶性脑缺血再灌注，大鼠大脑中动脉电凝法致局灶性脑缺血及大鼠四动脉结扎致全脑缺血再灌注叁种动物模型中的作用，发现野黄芩苷对脑组织的缺血损伤及缺血再灌注损伤均有明显的预防和治疗作用，可以显着减少局灶性脑缺血或局灶性脑缺血再灌注模型中脑组织的坏死面积，改善动物脑缺血或缺血再灌注后的神经行为学缺陷；明显延长全脑缺血再灌注模型中缺血后脑电图的消失时间，缩短缺血再灌注后脑电图的恢复时间和翻正反射的恢复时间，同时显着降低缺血再灌注后的脑组织含水率。 在对其作用机制的研究中发现，野黄芩苷可以明显减轻缺氧复氧和谷氨酸对体外培养海马及皮层神经元的损伤，提高神经元的存活率；显着改善大鼠大脑微循环障碍；并能抑制KCl诱导的离体基底动脉环收缩和Glu引起的离体回肠纵行肌的收缩。 综合以上实验结果可知，野黄芩苷在动物实验中具有确定的抗缺血性脑损伤的作用，其抗脑缺血的作用机制可能与以下几点有关：改善大脑微循环障碍；提高神经元对缺氧复氧的耐受性，直接保护神经元；拮抗谷氨酸的神经兴奋性毒性；抑制细胞内钙超载等。但其确切的作用机制仍需进一步的研究探讨。
毛艳华[5]2007年在《天麻素对大脑皮层神经细胞的保护作用》文中研究表明背景与目的缺血缺氧性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是一种高致残、高致死性的常见疾病。HIBD是一个复杂的病理过程，能量代谢障碍、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸(excitatory amino acids，EAAs)产生过多和一氧化氮(nitric oxide，NO)蓄积等在级联的细胞毒作用中具有重要作用。这些机制相互关联，相互促进，导致了神经细胞损伤的恶性循环。目前认为，实施神经保护治疗是提高缺血缺氧性脑损伤治疗有效性的根本措施，其作用机制在于通过阻断缺血缺氧(hypoxic-ischemic，HI)所致各类有害变化的病理过程的发生，减轻脑组织的进一步损伤，促进神经功能的恢复。目前，虽然一些西药相继应用于实践，但由于副作用而限制了其临床进一步应用。天然药物由于具有作用机制的多靶点和低毒性的特点，已被广泛用于神经保护药物的研究。因此，缺血缺氧性脑损伤防治药物的开发，对防治脑缺血缺氧性细胞损伤的发生，改善疾病预后具有重要意义。神经保护剂的研制和应用已成为缺血缺氧性脑损伤防治研究的焦点，具有广阔的发展应用前景。天麻素(Gastrodin，Gas)是我国传统中药天麻的主要药用成分，化学名为4-羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷。药理试验表明：天麻素是一种安全的镇静药，具有镇静、镇痛、改善心脑血管功能及抗炎、抗自由基等作用。其特点是安全低毒，不易产生药物蓄积；无药物依赖性、成瘾性等优点。近年来的研究表明天麻素能够增强血管的顺应性，改善脏器缺氧状态，对一些由脑供血不足造成的中枢神经系统疾病有较好的治疗作用，但其在神经细胞保护方面的作用机理尚缺乏更为深入的研究。本课题拟在已有研究的基础上，以体外培养的大鼠大脑皮层神经细胞为研究对象，造成体外缺血缺氧损伤模型，利用生化及分子生物学技术，旨在探讨天麻素对神经细胞损伤的保护作用及其可能的分子机制，期望为缺血缺氧性脑血管病的防治提供理论基础，具有实用意义。材料与方法1．Wistar大鼠(孕16-19天)大脑皮层神经细胞的原代培养。2．用缺糖和充氮气的方法制备缺血缺氧细胞损伤模型。制备模型时无糖Earle’s液和氮气作用5小时。培养的神经细胞随机分为3组：正常对照组、缺血缺氧损伤组和天麻素组，天麻素组中分别加入13mg／L、26mg／L、52mg／L终浓度的天麻素。3．倒置显微镜下观察细胞形态的改变。4．台盼兰染色法观察细胞的存活率。5．试剂盒测定法检测细胞NO和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)的释放。6．RT-PCR法检测神经细胞NR1 mRNA的表达以及天麻素对其表达的影响。7．使用SPSS10.0软件进行分析。所有数据用(?)±S表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD t检验，P＜0.05表明有统计学意义。结果1．天麻素对神经细胞形态学的改变倒置显微镜下活细胞观察：正常对照组细胞胞体丰满，突起较长，连成网状；缺血缺氧损伤组，大部分细胞肿胀，坏死；加入天麻素各组，细胞形态有所改善，较多细胞保留突起结构，肿胀细胞及细胞碎片均明显减少，以26mg／L浓度组细胞形态改善最为明显。2．天麻素对神经细胞存活率的影响台盼兰染色结果显示：神经细胞缺血缺氧损伤后，细胞存活率明显降低，与正常对照组相比有显着性差异(P＜0.01)，表明细胞活力明显下降，细胞呈现损伤状态；加入不同浓度(13mg／L、26mg／L、52mg／L)天麻素各组，均可使细胞的存活率显着提高(P均＜0.01)，以26mg／L浓度组效果最佳。提示天麻素对损伤的神经细胞有保护作用。3．天麻素对神经细胞培养液中NO含量和LDH活性的影响缺血缺氧损伤组细胞培养液NO水平与正常对照组相比显着升高(P＜0.01)；不同浓度(13mg／L、26mg／L、52mg／L)天麻素各组与损伤组相比，培养液中NO水平显着降低(P＜0.05)。损伤组细胞释放至培养液中的LDH(1788.5±129.2U／L)与正常对照组(874.56±98.18U／L)相比显着性升高(P＜0.01)；加入浓度为13mg／L，26mg／L和52mg／L天麻素可显着降低LDH的漏出，与损伤组相比P＜0.05。4．天麻素对大鼠大脑皮层神经细胞NR1 mRNA表达的影响：采用RT-PCR法对缺血缺氧损伤神经细胞的NR1 mRNA进行检测，结果显示：损伤组细胞NR1 mRaNA的相对表达量(0.901±0.106)与正常对照组(0.146±0.046)相比明显升高，统计学处理有显着性意义(P＜0.01)；不同浓度(13mg／L、26mg／L、52mg／L)天麻素各组均能显着抑制NR1 mRNA的表达(P均＜0.01)，各组相对表达量分别为0.659±0.134、0.297±0.046和0.334±0.056，以26mg／L浓度天麻素组抑制作用最强。结论天麻素可明显改善缺血缺氧神经细胞的形态、提高细胞的存活率、减少细胞NO和LDH的释放以及抑制神经细胞NR1 mRNA的表达。其作用机制可能通过抑制神经细胞NR1 mRNA的表达，从而使NR1 mRNA指导合成的N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartate，NMDA)受体减少，减轻NMDA受体所介导的兴奋性毒性作用，保护细胞膜的完整性，使受损细胞培养液中LDH漏出减少；切断了Glu-NO-cGMP通路，使NO含量降低。上述诸因素共同作用的结果使细胞形态得到改善，细胞存活率提高。
方蕾[6]2009年在《丹酚酸B抑制小鼠脑缺血再灌注炎症反应的机制研究》文中认为脑血管病,隶属中医“中风”、“卒中”之范畴,是一种高致残、高死亡率的常见病,已成为当今危害人类,特别是中老年人健康的重症疾病之一。缺血性脑血管病在脑血管病的发病中占60%-80%。临床治疗以溶栓为主,但在恢复缺血的脑组织血供的同时,有时却造成再灌注损伤,其发生机制与细胞内能量代谢障碍、Ca~(2+)超载、活性氧、兴奋性氨基酸的神经毒性作用、一氧化氮的细胞毒作用、炎症反应、细胞凋亡等因素有关,这些因素相互影响或互为因果,最终导致神经细胞死亡。其中脑缺血过程中的炎症反应越来越受到人们的关注。传统中医认为缺血性中风系由于本虚,产生风火痰瘀,导致脑络闭阻而发病。以气虚血瘀、痰瘀互阻、痰热腑实、毒损脑络、气血逆乱为病机特点。临床中医治疗中,活血化瘀法对缺血性卒中的治疗作用已得到广泛的认同。现代中药药理研究表明,活血化瘀中药具有扩张血管、改善循环血量、抑制血小板凝聚、溶栓、保护缺血脑组织等作用。丹参是临床常用的活血化瘀药,国内广泛应用于心脑血管疾病的治疗。丹参的化学成分主要可分为水溶性成分和脂溶性成分两大部分,其中丹酚酸B(SalB)是丹参的主要水溶性成分,为叁分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成。大量研究已证明,SalB具有抗氧化和清除自由基、改善脑血流和脑能量代谢、维持脑血管内皮细胞功能以及减少神经元凋亡等作用,通过这些环节,对脑缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。因此,深入探讨SalB防治缺血性脑血管病的作用机制,将为临床应用提供可靠的实验依据。目的:复制小鼠脑缺血再灌注模型,探讨SalB对脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响及作用机制。方法:采用NIH小鼠随机分假手术组、模型组、尼莫地平组(Nim)和SalB组。模型组:尾静脉注射5mL/kg生理盐水,30 min后腹腔注射水合氯醛麻醉,颈正中切口,分离双侧颈总动脉,在腹腔注射硝普钠(2.25 mg/kg)的同时迅速用动脉夹夹闭双侧颈总动脉30 min,然后松开动脉夹再灌注6h、12h。假手术组:模型复制同模型组,但腹腔不注射硝普钠,双侧颈总动脉不夹闭。Nim组和SalB组模型复制前尾静脉分别注射Nim(1 mg/kg)和SalB(22.5 mg/kg),作为阳性对照与中药治疗,余同模型组。以上各组分别于脑缺血再灌注6h、12h取血与脑组织,干湿重法测定脑含水量、脑指数,脑组织HE染色观察脑皮质形态学改变,放射免疫法测定血浆血栓素B_2(TXB_2)、6-酮-前列腺素F1_α(6-keto-PGF1_α)、脑组织白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α),免疫组化法观察脑皮质细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、P-选择素的表达。结果:1.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑含水量和脑指数的影响模型组随着脑缺血再灌注时间的延长,脑含水量和脑指数呈上升趋势,与假手术组相比有显着性差异(P＜0.01);用SalB和Nim治疗,脑含水量和脑指数均降低,尤其在再灌注12h时,与模型组相比有显着性差异(P＜0.01)。2.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑皮质病理形态学的影响假手术组小鼠脑皮质神经细胞形态结构正常,血管壁完整。再灌注6h模型组神经细胞水肿,再灌注12h时加重,可见神经细胞核深染,核周及血管周空隙显着增大,间质亦有水肿;SalB组和Nim组再灌各时间点,神经细胞水肿和血管水肿均明显减轻。3.SalB对小鼠脑缺血再灌注血浆TXB_2和6-keto-PGF1_α的影响与假手术组相比,模型组6h、12h血浆TXB_2含量明显升高(P＜0.01),而6-keto-PGF1_α含量有降低的趋势,TXB_2/6-keto-PGF1_α比值显著升高(P＜0.01);与模型组相比,Nim和SalB均可降低TXB_2含量,其中SalB效果更为明显(P＜0.01);再灌注6h Nim组血浆6-keto-PGF1_α含量升高(P＜0.05),SalB组各时间点血浆6-keto-PGF1_α含量有升高的趋势,两组TXB_2/6-keto-PGF1_α降低均显著(P＜0.01)。4.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑组织TNF-α、IL-1β的影响在脑缺血再灌注不同时点,模型组小鼠脑组织TNF-α、IL-1β的含量均高于假手术组(P＜0.01或P＜0.05);SalB可不同程度的降低再灌注后TNF-α、IL-1β含量,IL-1β含量的降低则更为显著(P＜0.01);再灌注6h Nim组TNF-α含量明显降低(P＜0.01)。5.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑皮质ICAM-1、P-选择素的表达光镜观察,假手术组小鼠脑皮质中ICAM-1、P-选择素表达较少;模型组ICAM-1、P-选择素阳性反应增加,主要表达于脑微血管内皮细胞,表现为血管壁棕黄色线样深染,图像分析显示,平均光密度值显着增加(P＜0.01);SalB组和Nim组再灌各时间点,ICAM-1、P-选择素阳性反应不明显,图像分析亦显示,ICAM-1的表达在再灌各时间点明显减少(P＜0.01),P-选择素的表达在再灌注12h下降尤为明显(P＜0.01)。结论:SalB能够减轻脑水肿,其机制可能与降低TXB_2含量、TXB_2/6-keto-PGF1_α、促炎因子IL-1β、TNF-α含量及黏附分子ICAM-1、P-选择素的表达,从而抑制炎症反应有关。
李伟[7]2004年在《丹参对持续癫痫幼鼠脑损伤保护作用的实验研究》文中进行了进一步梳理目的 探讨丹参对持续癫痫发作诱发幼鼠脑神经元损伤是否具有保护作用。方法 用美解眠经腹腔及背部皮下注射诱发健康幼龄（出生21d）大鼠癫痫持续状态发作。发育期幼鼠随机分为正常对照、持续癫痫及丹参治疗叁组，每组16只。各组分别于造模后72h和7d随机分批处死，HE染色动态观察各组大鼠海马神经元形态学改变；甲苯胺蓝染色观察脑神经元尼氏小体丢失情况；光镜下进行海马CA3、CA1区、齿状回及颞叶皮层病变神经元计数；电镜观察海马神经元超微结构的改变；同时应用ELISA法测定血清NSE（神经元特异性烯醇化酶）浓度的变化。结果 正常对照组幼鼠无癫痫发作，持续癫痫组和丹参治疗组均呈癫痫持续状态发作，其中两组各有两只幼鼠发作致死。癫痫持续状态发作后72h，持续癫痫组幼鼠脑组织HE染色可见海马CA3、CA1区神经元细胞排列紊乱，极向不清，染色不均匀，细胞有空泡变，细胞核大小不一致，呈圆形或椭圆形；甲苯胺蓝染色可见明显的海马神经元尼氏小体丢失；电镜下可见海马CA3区神经元线粒体体积缩小，部分出现空泡，基质浓缩，嵴模糊不清或消失，高尔基复合体轻-中度扩张，而其他脑区神经元超微结构病变较轻微；持续癫痫发作后7d上述神经元超微结构病变有缓解迹象。丹参治疗组发作后72h、7d光镜下神经元病变及海马CA3区超微结构病变均轻于持续癫痫组；而正常对照组未见类似病变。持续癫痫组发作后72h血清NSE浓度明显高于正常对照组；而丹参治疗组血清NSE浓度在发作后相同时点均低于持续癫痫组。结论 1、癫痫持续状态发作可以导致发育期幼鼠选择性脑神经元损伤，其中病变以海马CA3区最为明显，其次为CA1区、齿状回及颞叶皮层。2、血清神经元特异性烯醇化酶与持续癫痫幼鼠脑神经元损伤变化趋势基本相一致，能作为判断脑神经元损伤及其恢复的有效指标，但受到持续癫痫发作后时间的影响，仅在早期具有这一意义。3、丹参对持续癫痫幼鼠脑神经元损伤具有一定的保护作用不仅体现在组织、细胞和亚细胞水平，同时生化水平-血清神经元烯醇化酶浓度的变化进一步证实了其保护作用，为临床有效防治小儿惊厥性脑损伤提供了可靠的实验依据。
李永秋, 冉兵, 张春来, 盘强文, 赵春玲[8]1997年在《丹参抗急性缺氧性脑损伤的作用机理》文中研究表明本文用新生大鼠制备的窒息模型,研究中药丹参注射液抗急性缺氧性脑损伤的机理。实验结果表明,窒息组脑组织中的 LPO 和 Ca~(2+)含量为39.27±5.37和42.14±18.68.同丹参组33.67±5.57和22.00±14.83间差异具显着性(P<0.05～0.01),脑组织学病理改变程度重于丹参组;而丹参组和对照组,上述指标的差异不具显着性。提示丹参通过抗脂质过氧化和减少 Ca~(2+)内流等机制,发挥对缺氧脑细胞的保护作用。
齐悦如[9]2011年在《清开灵注射液对大鼠缺血性脑损伤时离子稳态失衡的调控机制研究》文中认为缺血性脑血管疾病是临床常见病、多发病,其致死率和致残率高,严重威胁人类的健康。因此,对缺血性脑血管疾病的研究是医学领域的重要研究课题之一。近年来许多研究者将目光集中在各种离子在缺血性脑病中的作用上面。本实验在中医“毒损脑络”病机理论的指导下,以各种离子为切入点,研究脑缺血后各离子稳态失衡,以及清开灵注射液(Qingkailing Injection, QKL)对其的影响,以期对络脉瘀阻导致营卫失和提供生物学依据。探讨中医药通过解毒通络、调和营卫,从而在脑缺血发生后维持各离子的稳态,发挥神经元保护作用的机制,为研究中药治疗中枢神经系统疾病的作用途径与靶点提供有意义的思路。目的1、确认缺血性脑损伤时大鼠脑内离子稳态失衡的特征及QKL对其的调控作用。以锌离子为代表进一步验证其在缺血性脑损伤后的变化特征以及QKL对其的影响。2、初步阐明在缺血性脑损伤时由于星形胶质细胞(astrocytes, Ast)状态、钙超载等原因致使金属硫蛋白表达变化引发锌离子稳态失衡的发生机制,同时探讨QKL维持脑内离子稳态平衡的作用机制。方法1、利用永久性大脑中动脉栓塞(MCAO)(?)(?)造成局灶性脑缺血损伤模型,并采用神经功能评分对其进行评价和筛选,利用光镜、透射电镜对N组、M组和T组大鼠顶叶皮层区细胞进行形态学观察。2、利用全自动生化分析仪和电感耦合等离子体质谱仪(Inductively coupled plasma mass spectrometer, ICP-MS)对正常组(N组)、脑缺血损伤模型组(M组)和QKL治疗组(T组)大鼠脑组织、血清、脑脊液中常规离子K+、Na+、Cl-、Ca2+和微量元素Zn2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+的含量进行检测。利用透射电镜对N组、M组和T组大鼠顶叶皮层区神经元、Ast中线粒体状态进行形态学观察。利用ICP-MS对QKL中K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+七种离子的含量进行检测。3、利用硫化钠灌流金属自显影法对N组、M组和T组大鼠脑组织中Zn2+进行染色,采用光镜对Zn2+在脑组织中的表达情况进行观察。4、利用免疫组织化学方法对N组、M组和T组大鼠脑组织中胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillay Acidic Protein, GFAP)进行染色,采用光镜对GFAP在脑组织中的表达情况进行观察。利用免疫组织化学方法对N组、M组和T组和MK组(钙离子拮抗剂治疗组)大鼠脑组织中金属硫蛋白(methallothionein, MT)进行染色,采用光镜对MT在大鼠脑组织中的表达情况进行观察。利用电感耦合等离子体发射光谱仪(Inductively coupled plasma atomic emission spectrometer, ICP-AES)对N组、M组、MK组、T组大鼠脑组织中Ca2+和Zn2+的含量进行检测。结果1、光镜观察发现：M组大鼠皮层顶叶区组织结构紊乱神经元丢失明显,胞体缩小胞核皱缩为叁角形。Ast胞体肿胀,胞核肿大。T组大鼠脑组织损伤显着减轻,顶叶皮层区各层神经元丢失减少,Ast肿胀程度显着减轻。电镜观察发现：M组大鼠皮层顶叶区神经元固缩,胞浆电子密度增高,胞核结构及核仁皆消失。T组大鼠顶叶皮层区神经元基本胞核呈卵圆形,胞浆内细胞器丰富,基本恢复到正常状态。该结果与神经功能评分结果相一致。2、QKL中各离子含量Na+>K+>Ca2+>Zn2+>Fe2+>Mg2+>Cu2+。电镜观察发现：M组大鼠皮层顶叶区神经元和Ast中线粒体肿胀,内脊断裂,T组大鼠神经元和Ast的线粒体呈棒形或圆形,内脊排列整齐,基本恢复到正常状态。QKL可纠正因缺血性脑损伤引发的血清中K+、Na+、Cl-、Ca2+、Mg2+、Fe2+(?)急态的失衡,脑脊液中K+、Na+、Ca2+稳态的失衡,脑组织中K+、Ca2+、Zn2+稳态的失衡。3、缺血性脑损伤24h,脑组织中Zn2+表达强度极显着降低(P<0.01),而QKL治疗后脑组织中Zn2+表达强度极显着升高(P<0.01)4、脑缺血24h时大鼠脑组织中MT表达量极显着性升高(P<0.01),给与QKL后MT表达量极显着性降低(P<0.01),给与钙拮抗剂后MT表达量极显着性降低(P<0.01)；脑缺血24h时大鼠脑组织中GFAP表达量极显着性升高(P<0.01),给与QKL后GFAP表达量极显着降低(P<0.01)；脑缺血24h时大鼠脑组织中Ca2+含量极显着升高(P<0.01),Zn2+含量降低,二者呈负相关关系。给与钙拮抗剂后脑缺血24h大鼠脑组织中Ca2+含量极显着降低(P<0.01),Zn2+含量极显着升高(P<0.01),二者呈负相关关系。结论1、大鼠缺血性脑损伤24h时,神经元受损明显,QKL发挥确切的神经保护作用。2、缺血性脑损伤24h时,血清、脑脊液和脑组织中多种离子稳态发生失衡,QKL作用于缺血级联反应过程中离子稳态失衡环节,可维持离子稳态,QKL可通过调控神经元、Ast线粒体的状态为细胞提供能量继而恢复离子稳态。QKL中离子有可能是发挥作用的药效物质之一3、缺血性脑损伤可引起Zn2+稳态失衡而QKL有维持Zn2+稳态的作用。4、缺血性脑损伤后MT应激性的过量表达致使Zn2+含量降低,而MT的过量表达有可能是通过Ast的反应性增加和钙超载来实现的。QKL一方面可通过发挥与钙拮抗剂类似的作用以缓解钙超载进而抑制MT的过表达,另一方面可抑制Ast的反应性增生进而抑制MT的过表达,从而恢复Zn2+的稳态。
钟鸣[10]2012年在《JNK/MAPK信号通路介导川芎嗪对海马神经元损伤的保护机制研究》文中提出脑血管疾病是临床常见病、多发病,并且脑血管病患者的存活病人中有50-70%遗留不同程度的残疾,这些后遗症严重影响了患者的生命健康与生存质量。此外,随着医学科学技术的迅猛发展,围术期患者发生缺血／再灌注性脑损伤的风险也随之增大,因此围术期脑缺血再灌注损伤也是临床麻醉与复苏近年来所关注的热点。脑缺血再灌注损伤后中枢神经系统功能的恢复较差,脑缺血／再灌注损伤均会造成不同程度神经功能障碍。近年来国内外研究证实,脑缺血再灌注损伤不仅仅是由于脑氧供中断细胞能量供应不足导致的脑细胞凋亡,而是一个多环节、多因素、多途径的酶促级联反应。但其分子机制至今尚未完全明确。中药川芎嗪(TMP)常用于缺血性脑血管疾病及其后遗症的治疗,但其作用机制尚不明确,特别是从JNK信号转导通路探讨TMP预处理对缺氧／复氧大鼠海马神经元保护机制国内尚无文献报道。本研究拟在体外原代培养大鼠海马神经元细胞的基础上,以海马神经元细胞为研究对象建立细胞缺氧／复氧模型,模拟神经细胞的能量代谢障碍。观察不同浓度TMP预处理与JNK通路阻断剂SP600125对缺氧／复氧后海马神经元细胞凋亡细胞比例的影响,检测JNK信号转导通路相关蛋白的表达。试图通过本研究,从分子水平上阐明TMP预处理对缺氧／复氧大鼠海马神经元JNK转导通路的干预机制,为脑缺血损伤的治疗提供新的理论依据。目的通过TMP预处理对缺氧／复氧大鼠海马神经元影响的研究：1.阐明JNK信号转导通路在缺血再灌注诱导体外培养的神经细胞凋亡中作用机制。2.阐明TMP对缺氧／复氧大鼠海马神经元JNK信号转导通路的干预机制。方法1.体外原代培养胎鼠海马神经元细胞,培养7天后造模。2.实验分组及缺氧／复氧模型的建立：以培养7天的胎鼠海马神经元为研究对象,随机分为6组：N组(正常组即未缺氧组),C组(空白对照组Oug/ml),S组(JNK抑制剂SP600125组10μmol/L), L组(TMP低浓度60ug/ml),M组(TMP中浓度组200ug/ml),H组(TMP高浓度组800ug/ml),实验组分别加入相应浓度的药物,药物作用1小时后持续通入90%N2+10%CO2(流速0.2L/min),诱导缺氧2小时,然后放入5％CO2培养箱中复氧。3.培养7天的胎鼠海马神经元缺氧／复氧损伤后,采用Annexin V-FITC测定不同处理组海马神经元的凋亡率。免疫荧光法检测c-jun、c-fos、P-JNK蛋白的表达,及叁者之间的关系。采用实时定量RT-PCR法(探针法)检测缺氧／复氧后MKK4mRNA、 MKK7mRNA的含量及与P-JNK的相关性。结果1.与正常组N组比较,模型组均不同程度增加了海马神经元细胞的凋亡率(P<0.05)。与单纯缺氧／复氧组比较,S组(SP600125抑制剂组)、川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药均可不同程度降低海马神经细胞的凋亡率(P<0.01)。M组(200μg/ml)组较60μg/ml、800μg/ml组差异亦有显着性(P<0.01),与S组无显着性差异。2.与单纯缺氧／复氧组比较,S组(SP600125抑制剂组)、川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药均可不同程度降低C-fos、c-jun、P-JNK蛋白的表达(P<0.01)。川芎嗪200μg/ml组较60μg/ml、800μg/ml组差异较为显着(P<0.01),抑制剂组与川芎嗪组比较无显着性差异。3.与正常组比较,模型组均不同程度的增加了MKK4mRNA、MKK7mRNA的表达含量。与单纯缺氧／复氧组比较,S组(SP600125抑制剂组)、川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药均可不同程度降低MKK4mRNA、MKK7mRNA的含量。川芎嗪200μg/ml组较60μg/ml、800μg/ml组差异亦有显着性(P<0.01),抑制剂组与川芎嗪组比较无显着性差异。结论SP600125抑制剂、川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药均可不同程度降低缺氧／复氧诱导海马神经细胞的凋亡和坏死,同时抑制JNK通路相关蛋白C-fos、 c-jun、P-JNK的表达。降低JNK激酶MKK4mRNA、MKK7mRNA的含量。SP600125抑制剂与高、中、低叁种浓度的川芎嗪均有保护作用,200μg/ml浓度的川芎嗪保护作用最显着。川芎嗪的保护作用可能是通过JNK信号转导通路的相关蛋白与激酶协同作用实现的。
参考文献：
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