关键词：蛋白质；高级结构；光谱；色谱；质谱
[中图分类号]Q518 [文献标识码]A [文章编号]1439-3768-（2019）-04-YS
蛋白质在人体的不同生理过程中担当着重要的角色，具有着“执行者”的功能，这与其结构有着重要的关系[1, 2]。只有在明确了蛋白质的高级结构下的前提下才能去了解它的功能以及所发挥的作用。从目前生命科学的发展趋势来说，蛋白质结构的研究在这个范围内至关重要，其重要性可见非同一般[3, 4]。
目前蛋白质结构研究的一大热点是对蛋白质高级结构的研究。目前用于蛋白质的高级结构的研究方法包括DSC法、CD法、荧光光谱法、HDX MS法、XRD法、低温冷冻电镜法、NMR法等。
1. 差示扫描量热法（DSC）
DSC法属于热分析方法，在程序控温下测量输入到样品和参照品的功率差与温度的关系，可提供与蛋白热变性相关的信息。该方法具有温度范围宽、分辨率高、试样用品量少的优点。
蛋白质受热变性的过程中可能会导致空间构象发生变化[5]，比如肽链的伸展或折叠、某些基团发生重组等，可能会造成蛋白功能与活性的变化。DSC可以对蛋白质进行定性，对蛋白结构进行鉴定，提供蛋白质的稳定性数据和相关结构信息，该方法常与其它手段联合使用来研究二级结构的变化。
2. 圆二色谱法（CD）
CD以提供含手性中心的生物大分子的三维结构信息[6]。通常在240 nm至190 nm或180 nm的远UV区内含有蛋白质大分子蛋白质主链信息，CD可以对蛋白质二级结构的总体含量进行定性和定量，吸收基团主要是肽键。典型的α-螺旋在208 nm和222 nm左右有2个负峰，192 nm有1个正峰。β-折叠在190nm附近有正峰，在215 nm附近有负峰，无规则卷曲构象在199 nm处有负峰。此外，CD也可估计α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲的含量，从而获得蛋白质的二级结构，在蛋白质折叠、构象与酶动力学等领域有所应用。
CD的主要优点源于该技术的速度快和便利性。与X射线晶体学和NMR相比，CD测量可以快速进行；如在30 min内获得远近UV区的高质量光谱。在远UV，仅需少量材料，且该技术是非破坏性的，通常可以回收大部分或全部溶液，因此可以对同一样品进行多次实验。CD的主要限制是它只提供分辨率相对比较低的结构信息，本身无法提供对蛋白质三级结构的解析[7]。
3. 荧光光谱法
荧光光谱法是指对自身产生荧光的蛋白质，或当蛋白质本身不能产生荧光时，借助非共价吸附或共价相互作用将荧光探针引入到蛋白质分子中的特定部位中以产生荧光，进行测定，以研究蛋白质分子的构象变化，或者是研究色氨酸残基和酪氨酸残基的微环境的变化，或者是蛋白质变性等。
荧光光谱提供了表征蛋白质及其构象的较为灵敏的方法。荧光的使用仅限于能够吸收紫外线或可见光的发色团并且以更长的波长重新发射荧光作为探测蛋白质构象的技术，荧光的主要价值之一是它对材料非常敏感且非常经济。然而，这意味着容易受到样品或溶剂或细胞上的微量荧光杂质的干扰，可能会导致对光谱进行错误解析。因此，使用这种技术的基本要求是获得蛋白质的荧光发射光谱时不要受到伪影的影响[8]。
4. 氢氘交换质谱法（HDX MS）
氢氘交换质谱法是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术[9]。其原理是将蛋白质浸入重水中，蛋白质的氢原子与重水中的氘原子发生交换，而蛋白质表面和重水密切接触的氢原子比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构的信息[9]。实验过程除样品制备外，包括交换反应、终止反应、样品酶切、液相分离、质谱检测、数据解析。其中交换步骤需要在多个反应时长下进行以绘制交换率曲线，得到准确全面的信息。
与经典的研究方法相比，如X-射线衍射法，无法给出精确的蛋白质精细的空间结构，而是直接提供蛋白质空间结构的表位（含动态变化中）的氨基酸序列信息、蛋白质发挥活性作用的位点以及蛋白-蛋白之间相互作用的位点信息。但是，氢氘交换质谱法有其局限性，主要有：置换后氘代肽段可能会发生回交；实验结果的精确性与重现性是否能够保证；实验控制的高精度和可重复性；如何准确分辨交换后叠加的质谱峰信号；需要简易高效的分析软件；在氨基酸水平上进行的交换位点的辨析[9]。
5. X射线衍射法（XRD）
XRD是利用晶体形成的X射线衍射，对物质进行内部原子在空间分布状况的结构进行分析的方法。X射线衍射法是根据晶体中原子重复出现的周期性结构来对晶体结构进行测定的。XRD是最早也是目前最主要的用于测定蛋白质结构的方法。目前在PDB数据库中收录的蛋白质结构有85%以上是由X射线衍射分析方法所获得的。
X射线晶体学具有分辨率高、对样品无损伤、相对快速、以及能获得大量晶体完整性的信息的特点。但是X射线晶体结构测定还存在一些问题：X射线晶体学只能测定晶体结构，但是许多蛋白质难以对其结晶，或难以获得足够大的用来进行结构分析的单晶，这是目前制约X射线晶体衍射分析蛋白质的主要难题；此外，测定的晶体构象静止状态下的，不稳定的过渡态的构象也无法进行测定；X射线晶体衍射的工作流程比较长。
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6. 冷冻电镜法（cryo-EM）
冷冻电子显微学技术简称为冷冻电镜技术或者低温冷冻电镜技术。这是一项在低温条件下使用透射性电子显微镜去观测样品的技术，这项技术与X射线衍射技术、NMR技术为高分辨结构生物学研究奠定了基础[10]。2017年，Jacques Dubochet等三人因此获得了诺贝尔化学奖[11]。近几年来，结构生物学领域的迅速发展与取得的一些突破离不开低温冷冻电子显微镜和三维重构技术的结合，众多过去其他结构生物学手段无法解析的重要的生物大分子复合体的结构被解析出来，如能够解析到近原子分辨率的最小生物分子的64kD的血红蛋白。
与X射线衍射技术和核磁共振技术等传统的研究蛋白质分子三维结构的方法比较，冷冻电镜技术有以下优点：保持生物样品的活性和功能状态；不需要制备蛋白质晶体，对于难以结晶的大分子蛋白质等的三维结构的判定比较适用；解析蛋白质大分子的三维结构具有高通量、快速高效的特点。目前该技术的难点[12]在于样品制备技术、高分辨率结构的分析与建模；构象不均一性的分析等问题。
7. 核磁共振波谱法（NMR）
核磁共振波谱技术作为结构生物学中的主要分析手段，是少数几种能够在原子尺度上对蛋白质的精细三维结构进行表征的技术之一。随着高场NMR技术的发展，结合蛋白质同位素标记技术，目前已经能够对分子量高达几十万的超大蛋白质及蛋白质复合体进行结构表征。相比于X射线晶体技术，NMR技术具有可以在更接近生理环境（pH、盐浓度、温度等等）的状态下，对蛋白质的三维结构进行研究的优势。蛋白质的功能与蛋白质分子的“动态结构”的研究非常重要[13]。NMR技术可以在原子水平上通过原子核弛豫过程对蛋白质动力学特性进行研究，拥有其它技术不可比拟的作用[14]。
采用NMR技术测定的蛋白质的结构是对X-晶体技术的补充，尤其是在蛋白质复合物研究方面以及蛋白质动态方面的研究发挥着重要的作用。但是，对于分子量大的蛋白质，NMR的灵敏度不能满足要求，NMR信号的重叠和峰宽个数增加，即使是全同位素标记的样品也不能满足表征蛋白质结构的要求。有的蛋白质很难获得全同位素标记的样品，且其全同位素标记昂贵，限制了NMR技术下解析大分子量蛋白质的应用。
综上，研究蛋白质高级结构的方法众多，目前针对蛋白质结构研究的不同目的选择不同的方法，对于精细的三维结构的研究目前还是以XRD和NMR为主，低温冷冻电镜技术近几年来也备受关注但还是有技术限制。
参考文献
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论文作者:王瑞英
论文发表刊物:《药物与人》2019年4月
论文发表时间:2019/7/19
标签：蛋白质论文; 结构论文; 技术论文; 射线论文; 晶体论文; 荧光论文; 方法论文; 《药物与人》2019年4月论文;