一、微量血凝抑制试验操作中常见问题及解决办法（论文文献综述）
杨景[1]（2021）在《老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究》文中指出季节性流感病毒（Seasonal Influenza Viruses）感染引起的患病和死亡,极其容易发生在老年人群和慢性肺部疾病患者。60岁及以上老年流感患者具有较高并发症风险,譬如脑炎、肺炎甚至恶化慢性心肺疾病相关的基础疾病。世界范围流行的季节性人流感是由A/H1N1、A/H3N2和B型流感病毒引起的。流感病毒基因组包含八个RNA片段,其中两个RNA片段编码两个包膜蛋白,分别为血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。国内目前上市的常用抗流感病毒药物如奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦,均属于神经氨酸酶抑制剂。然而,最为安全长效、公共卫生获益最大的抗病毒防御,需要各年龄人群按时接种季节性流感病毒疫苗,特别是具有高感染风险的老年人群。流感病毒疫苗的免疫原性和有效性评价采用血清学检测血凝素抑制实验（Hemagglutinin Inhibition Test,HAI）,特异性抗体的评价标准低估了流感病毒疫苗在老年人群中的获益情况。老年人群接种流感病毒疫苗将流感发病率降低,同时降低了住院率、减少了并发症和死亡率。然而,季节性流感疫苗虽然每年更新和接种,疫苗保护效果不如预期。一方面,流行季循环野毒株和疫苗株的不匹配;同时,老年人群疫苗接种率低;另一方,老年人群因免疫衰老出现免疫系统对流感疫苗的免疫反应下降。目前,国家人口统计局数据显示中国在迅速老龄化,截止2020年1月,有2.5388亿名60岁及以上老年人占国家总人口数的18.1%,预计在2030年老龄人口占比将达到26%。这将使流感病毒感染在老年人中造成极其沉重的疾病负担,但可以通过接种疫苗来减轻或防控。然而,在国内老年人群流感病毒疫苗接种率远低于2010年世界卫生大会提出的75%的疫苗接种覆盖率目标,仅有4%。较多因素造成老年人群疫苗接种率较低,包括政策、个人经济水平、受教育程度和健康意识等。此外,老年人群疫苗免疫后产生的流感病毒特异性抗体水平较18～60岁的成年人低,记忆B细胞和长寿浆细胞也出现显着减少。免疫衰老（Immunosenescent）,成为针对60岁及以上老年人群开发新的或更有效的流感病毒疫苗的主要挑战。免疫衰老表现出免疫功能的下降和各种传染性疾病的风险增加。因此,了解免疫衰老的老年人群免疫灭活四价季节性流感病毒裂解疫苗（QIVs）免疫机制,涉及外周血转录组、T淋巴细胞、主要细胞因子和免疫球蛋白在QIVs免疫前后动态特征,有助于发现老年人群免疫中与年龄、性别相关的变化是如何导致这种风险以及出现针对流感疫苗的弱体液免疫反应。事实上,现在人们普遍认为,疫苗接种后测定HAI滴度并不能全面反映老年人群的疫苗保护效果。此外,抗体反应弱或无的老年受试者每年接种疫苗,对流感的保护效果也出现提高,这表明细胞免疫机制可能对老年人的保护也很重要。最早的,2009年Querec等研究人员将系统生物学的方法应用于黄热病毒疫苗的机制研究中,并由此衍生出系统疫苗学的概念。鉴于传统疫苗研究基于体液免疫反应,缺乏对疫苗细胞免疫的认识。此外,QIVs疫苗免疫机制是网络化、多维度的,本研究采用系统生物学研究的方法,将从多个维度,借助高通量检测手段和计算机生物信息学分析关联传统疫苗学研究的特征指标,鉴定QIVs疫苗接种后在老年人群中建立有效免疫保护的重要生物分子和信号途径,筛选出与疫苗有效性、免疫反应性和持久性相关的枢纽基因,以期寻找疫苗有效性评价的替代生物标志物,加速疫苗临床研究进展。因机体免疫机制的复杂性,将从多个维度剖析老年人群QIVs免疫机制。本研究首先采用高通量测序RNA-Seq手段获取16名人口学和免疫特征具有显着差异老年受试者的转录组数据,随后进行整合关联分析。并采用不同生物信息学分析手段,首先通过基于生物学特征驱动（Biology-Driven）的配对比较聚类分析,老年女性和老年男性在QIVs免疫过程中因性别差异化表达基因和信号通路。随后,通过基于数据驱动（Data-Driven）的权重基因共表达网络分析（WGCNA）,将差异化表达基因按表达模式聚类,并将聚类的基因集关联性状特征（受试者人口学及免疫反应特征）分析,最终鉴定出影响性状特征的关键核心基因（Hub Gene）。此外,通过荧光定量qRT-PCR验证枢纽基因的表达特征与转录组结果一致。鉴于转录组RNA-Seq仅是从RNA分子水平阐明老年人群免疫QIVs的机制,为了解细胞介导QIVs免疫的动力学特征,本研究接着采用高通量多色流式细胞术分析了人口学性状及QIVs免疫反应特征明显的17名60周岁以上老年受试者的外周血PBMC标本详细的T细胞亚群免疫表型,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVsrelated reactogenicity）。最后,我们使用高通量多重细胞因子检测技术分析了以上老年受试者的外周血血浆样本中具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig,同样将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVs-Related Reactogenicity）。确定了不同性状特征老年受试者QIVs免疫前后细胞因子网络及主要免疫球蛋白Ig的动力学特征,以期了解细胞因子在细胞免疫中发挥的作用。第一部分:通过RNA-Seq获得老年人群QIVs免疫前后转录组数据进行生物信息学分析1.性别因素对老年人群QIVs免疫效果的影响临床数据显示,流感疫苗免疫应答存在性别差异,该研究旨在鉴定出差异表达基因（DEGs）造成老年人群接种四价灭活流感疫苗出现免疫相关的性别偏倚。以60～80岁的健康成年人为对象,对接种前后的基因表达情况进行分析。受试者体液免疫水平采用血凝抑制实验检测特异性抗体滴度HAI,并分析两个性别群体差异基因表达谱与体液免疫的相关性。在老年女性中,参与I型干扰素信号通路和经典通路补体激活的DEGs在流感疫苗接种3天内出现上调。在第28天,显示老年男性偏倚模式的免疫反应与调控蛋白质加工处理以及补体活化的经典途径相关。通过生物特征驱动聚类方法确定了与老年女性和男性对QIVs接种不同反应相关的一系列DEGs。老年女性对QIVs具有更强的免疫反应,但抗体半年后出现迅速下降,而老年男性具有维持持久反应的优势。此外,我们还发现了可能导致老年人接种流感疫苗性别变异的基因。我们的研究结果强调了开发个性化季节性流感疫苗的重要性。2.枢纽基因MCEMP1和SPARC分别驱动QIVs免疫不良反应事件发生与维持有效抗体深入了解潜在的候选中心基因可能有助于产生安全有效的季节性流感免疫,以及开发针对流感病毒感染高危老年人群的个性化流感疫苗。本研究旨在通过加权基因共表达网络分析,确定与2018/19季节四价灭活流感病毒疫苗免疫诱导过程相关的潜在中枢基因。从16名老年人的63份全血样本中,共获得13345个基因,分为8个共表达模块,其中两个模块与疫苗诱导的免疫应答显着相关。功能富集分析后,利用GO条件下的疫苗相关免疫基因构建hub基因的子网络,进行hub基因的鉴定和功能验证。MCEMP1和SPARC被证实是影响QIVs诱导免疫的中心基因。在接种后7天内,MCEMP1的表达量与QIVs相关的反应性呈负相关,CXCL8/IL-8可抑制MCEMP1的表达,颗粒酶-B细胞毒介质可加剧MCEMP1的表达量。同时,SPARC的表达增加了对QIVs的免疫应答,并有助于持续的保护性体液抗体滴度。这两个基因可用于预测QIVs诱导的不良反应、免疫反应的强度以及体液抗流感抗体的持续时间。这项工作为进一步研究开发个性化的QIVs提供了线索,这些QIVs具有适当的免疫反应和对即将到来的季节性流感的持久免疫。第二部分:老年人群QIVs免疫前后T淋巴细胞分布及动力学特征衰老产生的细胞免疫损伤,表现为胸腺退化及T淋巴细胞输出减少为主的免疫系统随年龄变化特征。然而,缺乏老年人群接种QIVs前后外周血T淋巴细胞亚群的详细分布特征研究。本研究旨在确认老年人群T淋巴细胞分布特征,并比较不同性状和免疫状态分组（包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应）的T细胞亚群动力学特征差异。本研究随机筛选的60名老年受试者中,分析受试者性状涉及人口学基线特征和免疫前预存流感病毒抗体水平,其中17名受试者具有显着性状差异被选取用于鉴定老年人群外周血T淋巴细胞衰老表型的特征。通过10色高通量流式细胞术检测分析外周血T细胞亚群的详细分布特征。计算各T细胞亚群占亲本比例,并进行不同性状和免疫状态分组比较,包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应。受试者人口学特征和基线特征基本一致,血常规检测淋巴细胞数量在正常范围。按照年龄分组比较T细胞亚群分布差异,CD8+PD1-CD57-T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高,而CD8+PD1+CD57+T细胞亚群显着低于低龄组。CD8+CD27-CD28+T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高但频数在免后两年龄组均出现显着降低,而两年龄组中CD27+CD28+/-T细胞在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着增加。两年龄组中TCMs在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着减少,而TNs则在QIVs免后显着增加。按照性别分组比较T细胞亚群分布差异,总T（CD3+）和CD4+T细胞的比例在老年女性受试者中较老年男性高,其中CD4+在免后Day180具有显着性别差异免后Day180,CD27+CD28+T细胞比例在老年女性受试者中显着高于老年男性。在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中,不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间差异较小。然而,更详细的通过耗竭表型分子（PD-1）、衰老表型分子（CD57）、共刺激分子（CD27和CD28）以及T细胞效应记忆表型分子（CD45RA和CCR7）,发现QIVs免疫前后不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间存在显着差异。第三部分:老年人群QIVs免疫反应主要细胞因子与免疫球蛋白Ig产生及动力学特征细胞因子（Cytokines）和趋化因子（Chemokines）是具有生长、分化和激活功能的冗余分泌型蛋白,调节并决定免疫反应的性质,控制免疫细胞的迁移以及免疫器官中细胞的排列。最初针对免疫损伤产生的细胞因子种类,便决定了免疫反应的发生,甚至随后的免疫反应发展结局特征是细胞毒性的、体液免疫、细胞介导的免疫还是过敏性的。因此,本研究旨在确认老年人群免疫反应相关主要细胞因子、免疫球蛋白Ig的水平特征,并比较不同性状和免疫状态分组（包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应）的主要细胞因子、免疫球蛋白Ig动力学特征差异。在本研究中,我们使用高通量多重细胞因子检测技术,针对人口学特征及QIVs免疫反应特征明显的18名60周岁以上老年受试者的血浆样本,定量检测具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig浓度,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVs-Related Reactogenicity）。受试者人口学特征和基线特征基本一致,常规体检显示身体状况良好。按照年龄分组比较,IL-5在免前高龄组M65yrs Group中显着高于低龄NM65yrs Group,并在免后出现显着减少。Granzyme-B在免后低龄NM65yrs Group中显着高于高龄组M65yrs Group,免后两年龄组均出现显着增加。按照性别分组比较,IL-6在免后Day3,Female Group组中显着高于Male Group,随后Day28显着减少。IL-2在免后Day180,老年女性Female Group中显着高于老年男性组Male Group。按照免疫QIVs有无不良反应分组比较,免前,IL-12分泌在GR Group显着高于NGR Group。IL-18和IFN-alpha在QIVs免疫后Day 28,均在GR Group具有显着更高的表达。此外,Granzyme-B在免后Day 03,GR Group表达显着高于NGR Group。许多细胞因子同时具有促炎和抗炎潜能,观察到哪种活性取决于存在的免疫细胞及其对细胞因子的反应状态。体液免疫相关细胞因子IL-5和细胞毒作用相关Granzyme-B具有明显的年龄差异。同时,在QIVs免疫后,显着高表达的细胞因子IL-6和IL-2,证明了老年女性组具有更高的流感病毒特异性的细胞毒性CD8+T细胞以及CD4+记忆T细胞。
胡瑞鸿[2]（2020）在《抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估》文中进行了进一步梳理小鹅瘟（Gosling plague,GP）又称为鹅细小病毒病,是由鹅细小病毒引起的一种高度接触性、败血性传染病,是危害养鹅业的主要传染病。近年来,根据遗传进化分析,小鹅瘟病毒（Gosling plague virus,GPV）的毒力有增强趋势,给该病的防治带来更大的挑战。目前GP的特异性防治主要依赖接种卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）进行被动免疫,对GP强毒感染具有明显的防治效果。由于IgY具有价格低廉、防治效果好等优点,已被广大养鹅户接受和采用。但目前使用的IgY多为粗制抗体,缺乏统一的生产、检验标准,琼扩抗体效价高低不等,故研制一种纯度及效价高,防治效果好,有统一生产标准的GPV IgY势在必行。本研究从黑龙江省某地饲养的雏鹅群中,采集疑似GP病死鹅的病料,进行GPV的分离鉴定,利用分离获得的GPV研制抗GP的IgY,并对其质量进行评价,具体研究内容和方法如下:（1）GPV的分离鉴定用氯仿提取法从疑似GP病死鹅的肝、脾组织中分离病毒,接种3日龄雏鹅和12日龄鹅胚进行病毒分离;分离的病毒经特异性检验（琼脂扩散试验（AGP）和鹅胚中和试验）、超微结构观察、毒力测定、理化特性（热敏感试验、乙醚敏感试验、氯仿敏感试验、胰蛋白酶敏感试验、耐酸性试验）检验、纯净性试验、核酸检测、VP3基因序列鉴定及基因进化树分析,进行综合鉴定。（2）GPV IgY的研制将分离鉴定获得的GPV（命名为H株）,经鹅胚逐级传代至F10,F10代进行1000倍稀释,接种12日龄鹅胚,收获鹅胚液作为GPV灭活疫苗抗原,抗原无菌检验和毒力检测合格后,进行浓缩及灭活,通过接种12日龄鹅胚进行灭活检验;灭活检验合格后进行GPV灭活疫苗的配制及乳化,获得GPV灭活疫苗,对其进行物理性状、无菌检验及安全性检验;将检验合格的GPV灭活疫苗按经典免疫程序免疫产蛋鸡,当高免鸡蛋卵黄液的GPV IgY琼扩抗体效价≥1:64时,对其进行除脂、提取和灭活,制备出抗H株GPV IgY。（3）抗H株GPV IgY的质量评价通过监测GPV IgY的琼扩抗体效价对GPV IgY的理化特性（温度、酸碱度、胃蛋白酶的作用时间、冻融次数）进行评价;通过GPV IgY单次单剂量、重复单剂量和单次大剂量皮下注射3日龄雏鹅及小白鼠的安全性试验,观察雏鹅和小白鼠的健康状况,局部及全身反应情况对GPV IgY的安全性进行评价;通过不同琼扩抗体效价和不同剂量的GPV IgY对GPV强毒攻毒24 h雏鹅的治疗试验、对GPV感染不同时长和不同日龄雏鹅的治疗试验,依据雏鹅治愈率,对GPV IgY治疗效果进行评价;用不同琼扩抗体效价和不同免疫剂量的GPV IgY对雏鹅皮下接种,24 h后用GPV强毒攻毒,依据雏鹅保护率进行预防效果评价;同类产品免疫3日龄雏鹅,依据雏鹅保护率与治愈率,评价GPV IgY与同类产品的差异。通过物理性状、无菌检验、支原体检验、GPV IgY琼扩抗体效价监测及对雏鹅攻毒保护率监测,确定GPV IgY的储存温度和时间。试验结果表明:（1）GPV的分离鉴定结果分离的病毒接种雏鹅,呈现与GP一致的临床症状和病理剖检变化;接种鹅胚,可在鹅胚中增殖,且为非血凝性感染病毒;AGP显示,从雏鹅和鹅胚分离的病毒液与GP阳性血清之间出现沉淀线;鹅胚中和试验证明,病毒液能被GP阳性血清中和,中和后的病毒液接种鹅胚不引起死亡;电镜下观察,H株病毒粒子具有典型的细小病毒特征;H株鹅胚和雏鹅传代培养F6～F10代,毒价最高且稳定,病毒的ELD50和LD50分别大于10-5.0/0.2 m L和10-4.0/0.2m L;以分离到的H毒株分别接种3日龄、10日龄、20日龄雏鹅,其致病性随雏鹅日龄增大而减弱;分离的病毒在56℃3 h保持其感染性,能够抵抗乙醚、氯仿、胰蛋白酶和酸性条件（p H3.0）的作用;分离的病毒液细菌、支原体和外源病毒检查均为阴性,证明H株病毒纯净;PCR核酸检测病毒约在500 bp处出现特异性DNA条带,DNA大小与GPV相符;上述结果表明,分离的病毒符合GP生物学特性,该病毒为GPV（命名为H株）。以PCR扩增出的VP3基因,与参考毒株的VP3基因序列对比,核苷酸的同源性在95.9%～99.1%之间,氨基酸同源性为97.9%～99.6%之间;基因进化树分析表明,H株与在黑龙江省分离的SP、ZZ、ZD、DQ、JX等毒株亲缘关系较与GD（广东）、YG（扬州）等毒株近。（2）GPV IgY的制备结果GPV H株灭活疫苗抗原无菌检验呈阴性、鹅胚液ELD50为10-5.22/0.2 m L、灭活检验鹅胚全部健活。GPV灭活疫苗的物理性状、无菌检验、安全检验均合格。用该GPV灭活疫苗免疫产蛋鸡,收集AGP≥1:64高免鸡蛋的卵黄液。高免卵黄液经酸化水1:8稀释、p H5.2、4℃作用15 h、1900 g离心20 min条件下除脂;酸化水-1.5%辛酸-33%硫酸铵提取;终浓度0.05%甲醛溶液经20～25℃灭活24 h,对GPV IgY的琼扩抗体效价、蛋白浓度及蛋白纯度均无显着影响,确定上述除脂、提取和灭活条件为最佳工艺。（3）GPV IgY的质量评价结果上述制备的抗H株GPV IgY在60℃以下作用2 h,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比不降低,当温度达到70℃以上,琼扩抗体效价显着降低,当温度达到75℃作用30 min时,琼扩抗体效价呈阴性;p H范围在4.0～11.0时,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比差异不显着,p H值为3.0和12.0时,GPV IgY琼扩抗体效价显着低于对照组;当胃蛋白酶作用6 h,琼扩抗体效价无变化,作用8 h以上显着降低;GPV IgY经5次反复冻融,琼扩抗体效价与对照比无显着差异;GPV IgY免疫雏鹅和小白鼠均未出现任何注射局部和全身不良反应,精神状态良好,采食正常;GPV IgY对雏鹅治疗效果表明,琼扩抗体效价越高、注射剂量越大,雏鹅治愈率越高;病毒感染雏鹅的时间越长、雏鹅日龄越大,雏鹅治愈率越低;GPV IgY对雏鹅预防效果表明,同一注射剂量,琼扩抗体效价越高,雏鹅保护率越高,同一琼扩抗体效价,注射剂量增加,雏鹅保护率增高;GPV IgY免疫雏鹅后12 h～10 d,对雏鹅保护率高达88.00%以上,可有效抵抗病毒感染。差异对比试验表明,研制的GPV IgY的雏鹅保护率与治愈率均高于同类产品。（4）GPV IgY的储存条件2～8℃储存24个月,GPV IgY的物理性状、纯净性、琼扩抗体效价稳定,对雏鹅感染GPV的保护率达88.00%以上。（5）GPV IgY推荐使用剂量和方法对已感染GPV的雏鹅,选择GPV IgY琼扩抗体效价为1:16以上,1.0 m L/只;对未感染雏鹅进行紧急预防免疫,0.5 m L/只,皮下注射,对GPV感染的治愈率和保护率均达80.00%。
时锋[3]（2020）在《新疆某规模化鸡场新城疫抗体的动态监测及免疫程序的优化》文中进行了进一步梳理新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的以禽类感染为主、表现有特征性临床症状的急性和高接触性传染病。该病的传播十分的迅速,病死率极高,一旦鸡群内出现病例,短时间内波及全群,引起大规模的死亡,严重危害着世界各国的禽类养殖业。目的:为了了解该规模化鸡场ND免疫效果,制定新的免疫程序,本次试验从新城疫的免疫防制入手,对新疆某规模化鸡场免疫NDV疫苗进行抗体动态监测、各类型疫苗免疫效果对比,并根据以上研究结果优化免疫方案。方法:采用血凝/血凝抑制试验对新疆某规模化鸡场近四年的免疫抗体进行动态监测。使用10种疫苗对相同饲养管理下的鸡群进行疫苗免疫效果评价,以抗体合格率作为评价标准,筛选免疫效果较好的疫苗。综合分析试验结果,对原有免疫方案进行优化,并进行抗体监测。结果:1.A场近四年抗体合格率为65.00%-100.00%、88.00%-100.00%、94.00%-100.00%、96.00%-100.00%;B场近四年免疫抗体合格率分别为83.00%-100.00%、96.00%-100.00%、96.50%-100.00%、96.70%-100.00%;C场近四年抗体合格率分别为58.40%-100.00%、94.00%-100.00%、80.00%-100.00%、87.50%-100.00%。3个麻羽种鸡场的免疫抗体水平均存在一定的波动,但免疫抗体水平逐年提高,其中B场的免疫效果优于A场和C场。2.ND+IB（默沙东）疫苗免疫组阳性率分别为32.18%、93.21%、100%;ND+H9（易邦）免疫组阳性率分别为55.63%、100%、100%;ND+IB+EDS（易邦）免疫组阳性率分别为52.13%、100%、100%;新流腺（信得/易邦）免疫组阳性率分别为10.23%、95.62%、100%;ND+H9+腺（信得）免疫组阳性率分别为60.23%、95.64%、98.56%;ND（基因7型）免疫组阳性率分别为88.75%、100%、100%;ND+H9-K（青岛易邦）免疫组阳性率分别为55.85%、100%、98.99%;新倍灵（默沙东）免疫组阳性率为70.23%、98.26%、100%;新威灵（默沙东）免疫组阳性率分别为60.23%、92.63%、100%;油苗:ND+IBD+H9免疫组阳性率分别为65.28%、98.36%、100%。几种类型的疫苗在首次免疫后,均需要加强免疫,其免疫抗体才能达到国家规定水平,ND+H9（易邦）、ND+IB+EDS（易邦）、ND（基因7型）这三种疫苗的免疫效果最好。3.麻羽种鸡场免疫程序调整为2w:免疫ND+IB（Clone30+Ma5）（默沙东）、6w免疫ND+H9+IB（易邦）、11w:免疫新支灵、15w免疫（ND+H9）-K（青岛易邦）、20w+4免疫ND+IB+IBD（默沙东）、25w免疫（ND+H9+IB）-K（青岛易邦）、34w:免疫新支灵（默沙东）、40w免疫新倍灵（梅里亚）、47w+1免疫ND+H9（青岛易邦）。商品鸡的免疫程序为1日龄锐雏欣（颈部皮下注射）、7日龄免疫新易支（点眼）、14日龄免疫（ND+H9）-K（颈部皮下注射）、28日龄免疫信支妥（饮水）、50日龄免疫新易支（饮水）。结论:根据试验结果,新疆某规模化鸡场的NDV免疫效果呈现逐年升高的趋势,调整后的免疫方案对鸡群具有较好的保护性,免疫抗体阳性率达到了98.00%以上,有效的保护了鸡群免受NDV的侵害。
高如一[4]（2020）在《H5N6禽流感病毒HA基因158位糖基化位点修饰的生物学效应与宿主免疫应答机制》文中提出Clade 2.3.4.4基因型是2008年出现的H5亚型高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV）新型分支,并且这一分支包含 H5N2、H5N3、H5N5、H5N6和H5N8等多个血清亚型。最新的流行病学调查数据表明,clade 2.3.4.4已经成为我国H5亚型HPAIV的主要流行分支,同时H5N6亚型已经取代H5N1亚型成为优势流行血清亚型。H5N6亚型HPAIV宿主范围广,除水禽、野鸟和陆生家禽外,还能从猪和猫体内分离到,并且是目前除H5N1之外唯一能够感染人的H5亚型病毒,截至2020年3月,共报告24例人感染病例,其中8例死亡。AIV能够跨越种间屏障涉及的关键因素之一是病毒受体结合特异性的改变,后者主要取决于病毒血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白。我们发现绝大多数 clade 2.3.4.4 H5NX 亚型 HPAIV 在 HA蛋白中具有T160A氨基酸突变,这一突变导致其158位的糖基化位点缺失。因此,探究这一位点的改变是否为H5N6亚型HPAIV的跨种间传播的关键因素及其对病毒的生物学特性的影响,将深化人们对于HPAIV跨种传播分子机制的理解,并为防控HPAIV引发的公共卫生风险提供理论支持。本研究针对158位糖基化位点存在差异的H5NX野毒株进行了受体结合分析,同时,构建了 160A/T两种模式的重组病毒对其受体结合特性以及生物学特性进行研究。首先评价模式病毒在不同来源细胞中的增殖能力和对小鼠的致病力,然后分析上述病毒在小鼠呼吸道的分布与复制情况,最后利用高通量测序技术解析158位糖基化位点存在差异的模式病毒感染细胞后基因的差异表达情况。1.Clade 2.3.4.4 H5NX HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对受体结合特性的影响我们对实验室从活禽市场分离到的clade 2.3.4.4分支的HPAIV H5N2（QD7）,H5N5（031）,H5N6（HX,Y6）和H5N8（WF1）病毒进行受体结合特性的分析,发现上述5株病毒的受体结合特性并不一致。进一步对其HA基因进行遗传进化分析发现031,Y6和WF1与大多数人源H5N6病毒一致,其HA蛋白呈T160A突变,造成158位糖基化位点缺失,这3株病毒均表现为双受体结合特性,而HX和QD7未缺失158位糖基化位点,表现为完全的α-2,3禽源受体亲和性。但是,这一单位点突变对clade 2.3.4.4 H5NX病毒HA骨架的影响尚不清楚。因此,我们针对母本病毒Y6和HX构建了 4株重组病毒,命名为 Y6-P-160A,RY6-P-160T,HX-P-160T 和 RHX-P-160A,分别保留母本病毒的外部基因HA和NA,内部基因盒由PR8（H1N1）提供。对4株重组病毒进行受体结合特性分析,发现Y6-P-160A和RHX-P-160A均表现为双受体类型的结合特性,而RY6-P-160T和HX-P-160T仅能与α-2,3禽源受体结合。此外,4株重组病毒在不同来源细胞中增殖能力测定结果表明,在禽源CEF细胞中,RHX-P-160A的复制能力最弱,而RY6-P-160T的复制能力最强,但4株重组病毒的复制滴度峰值差异不显着。在哺乳动物细胞中,以Y6为母本病毒构建的重组病毒的复制能力强于以HX为母本病毒构建的重组病毒,但模式病毒Y6-P-160A与RY6-P-160T之间,HX-P-160T与RHX-P-160A之间复制能力的差异不大。在小鼠致病模型中,母本病毒Y6和HX均为低致病性,而4株重组病毒均表现为中等致病性,但与重组病毒RY6-P-160T和HX-P-160T相比,Y6-P-160A和RHX-P-160A能够以更低接种量、更短时间内致死小鼠,上述结果与受体结合特性测定结果吻合。我们进一步构建了 HPAIVH5N2,H5N5和H5N8毒株的类似重组病毒,证实了 158位糖基化位点的缺失同样是其获得α-2,6人源受体的关键分子标记。因此,我们得出结论,HA基因中T160A突变导致158位糖基化位点的缺失是clade2.3.4.4 H5NX亚型病毒的双受体结合特性的决定因素。这一分子标记可能有助于预测、管控H5NX重组病毒跨种传播的风险。2.H5N6 HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对病毒生物学特性的影响为了进一步探究158位糖基化位点在H5N6亚型原病毒骨架中的作用,我们继续构建了 4株重组病毒,分别命名为RY6、RY6-160T、RHX和RHX-160A;其中,RY6-160T和RHX-160A均在HA蛋白的160位进行了突变;而RY6和RHX则在母本病毒Y6、HX骨架基础上进行了重组病毒的拯救。对小鼠的致病性分析发现,重组病毒RY6-160T和RHX的致病性显着高于RY6和RHX-160A,这与上一章以H1N1内部片段构建的重组病毒的致病性测定结果不同,后者的致病性分析结果提示,4株病毒的MLD50值由高到低分别为RY6-160T（105.17EID50）、RHX（106.5 EID50）、RY6（106.67 EID50）、RHX-160A（>107.0 EID50）。因此,我们进一步分析了 RY6和RY6-160T重组病毒在小鼠脏器中的分布情况,与重组病毒RY6相比,RY6-160T在小鼠体内的分布更加广泛,在多种受检脏器内均可检测到病毒,而RY6只能在肺脏和心脏中检测到,上述结果与小鼠致病力测定结果一致。不同细胞中的生长动力曲线也表明,RY6-160T在受检的不同来源细胞中的复制效率高于RY6。以上结果清楚地表明,HA蛋白160位糖基化位点的修饰显着影响病毒的毒力,该修饰是否影响病毒的抗原性?我们将4株重组病毒与针对clade 2.3.4.4 H5NX病毒的Re-8疫苗株的阳性血清进行反应,发现上述血清与重组病毒反应的滴度接近,提示重组病毒的抗原性并未发生明显改变。进一步对重组病毒的热稳定性进行测定,发现虽然4株重组病毒都属于中等热稳定性毒株,但RY6和RHX-160A在56℃水浴60分钟后仍然能够感染细胞,而RY6-160T和RHX在同样条件下已失去感染性,暗示158位糖基化缺失的野毒株在热稳定性方面占优势。尽管RY6-160T和RHX在宿主体内均表现出更强的毒力,但通过豚鼠红细胞解凝试验和A549细胞吸附试验,我们发现RY6和RHX-160A与上述细胞受体的结合能力更强,能优先结合受试细胞。上述结果表明,H5N6 HPAIVHA蛋白158位糖基化位点缺失并不能显着提高病毒对小鼠的致病力,需要依赖于HA蛋白的其他突变位点和/或病毒的内部基因间的协同作用;但158位糖基化位点的缺失使得病毒更耐受高温环境且与宿主细胞的结合能力更强,这些优势提高了 158位糖基化位点缺失的clade 2.3.4.4 H5NX在自然界的生存能力,最终使得这些毒株的流行面更广。3.H5N6 HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对病毒复制与宿主免疫应答的影响由于哺乳动物呼吸道α-2,3受体的分布不同于家禽,因此AIV通常更适合在哺乳动物的下呼吸道有效复制,而HPAIVHA蛋白158位糖基化位点直接影响病毒的受体结合特性,我们进一步检测了重组病毒RY6和RY6-160T感染小鼠的鼻甲骨、气管和肺脏三种脏器中的病毒含量,发现在鼻甲骨中RY6的含量显着高于RY6-160T,说明RY6在上呼吸道也能够有效复制。同时,我们分析了两株病毒感染后不同时间刺激宿主产生细胞因子的水平,RY6入侵宿主后在更短时间内刺激了炎性细胞因子HMGB1,IL-10和TNF α的产生,且其表达量也高于RY6-160T感染鼠;随着感染时间的延长,细胞因子的表达量逐渐下降,而RY6-160T在感染后期刺激产生的细胞因子水平显着高于RY6,过量的炎性因子最终可能导致了其对小鼠的致病性更强。我们使用高剂量重组病毒RY6、RY6-160T感染A549细胞,发现RY6在感染后3h和6h检测到的病毒滴度更高,但至感染后期9h后不再表现出复制优势。可能的原因:一方面,RY6结合A549细胞的能力更强;另一方面,病毒样颗粒形成试验结果表明,RY6-160T组装病毒粒子以及出芽的效率显着高于RY6,同时RY6-160T诱导细胞凋亡的能力也强于后者。两株病毒感染A549细胞的差异转录组学分析结果显示,RY6刺激宿主细胞表达的差异基因数量远远高于RY6-160T,说明RY6感染后启动了机体更广泛的调控机制。进一步的生物学功能分析发现,RY6感染A549细胞后引起了一系列负调控病毒复制的差异基因表达,干扰了病毒的入侵、复制与转录。KEGG通路分析证实了这一结论,即RY6感染细胞后激活了 NOD-like受体通路、p53信号通路和NFκB通路等相关通路。此外,我们发现两种宿主蛋白EGFR和MYH9可能在病毒结合细胞表面唾液酸受体后进一步协助病毒入侵细胞。因此158位糖基化位点缺失的RY6重组病毒能够在感染后启动宿主的免疫应答机制拮抗病毒,最终使得病毒的致病性趋于温和,从而有利于病毒的传播,而158位糖基化位点未缺失的RY6-160T重组病毒则刺激宿主表达过量的炎性因子,使其对宿主的致病性更强,与我们在小鼠模型中致病性试验中观察到的结果一致。综上所述,通过本文研究,主要得出以下结论:（1）Clade2.3.4.4H5NXHPAIVHA基因中T160A突变导致158位糖基化位点的缺失是该亚型病毒的双受体结合特性的决定因素;（2）Clade2.3.4.4 H5N6 HPAIVHA基因158位糖基化位点缺失不能显着提高病毒对小鼠的致病力,但该位点的缺失使得病毒更耐受高温环境,且与宿主细胞的结合能力更强;（3）H5N6HPAIVHA基因158位糖基化位点缺失的重组病毒能够在感染后启动宿主的免疫应答机制,使得病毒对小鼠的致病性趋于温和;而该位点未缺失的重组病毒则通过刺激宿主表达过量的炎性因子,导致病毒对小鼠的致病性更强。
孟子延[5]（2020）在《无血清规模化培养MDCK细胞的关键控制点研究》文中研究表明我国目前流感病毒疫苗都是利用鸡胚基质生产的。然而,由于鸡胚数量的限制和鸡胚工艺扩大生产的可及性差,一旦大流感来临时,用鸡胚基质生产的流感疫苗将远远不能够满足人们需求。而以细胞基质生产流感疫苗则不受鸡胚数量的限制、质量可控、易于扩大规模,且能适用于对鸡蛋蛋白过敏的人群。MDCK细胞是当前最受关注的流感疫苗生产的细胞基质之一。细胞基质病毒性疫苗的培养常常可分为两个阶段,即细胞生长期和产毒期。为了更加高效和经济的研发可靠的疫苗生产工艺,首先设计在实验室规模利用摇床和摇瓶摸索了基本工艺并优化工艺参数。确定细胞传代的参数,按梯度密度（2×106、1.5×106、1×106、7×105和5×105cells/mL）接种细胞于细胞摇瓶,然后对比不同细胞接种密度的细胞生长曲线,同时,监测各实验组间的细胞活率、细胞代谢和细胞周期情况,结果表明在48h时,各梯度密度接种都处于细胞生长分裂的对数生长期,细胞增长最高达到了8.3×106 cells/mL;各梯度密度的细胞接种几乎都在60h生长达到平台期,多数达到了千万cells/mL的细胞密度,且各组细胞活率和代谢差异不明显。为了保证传代时细胞处于对数生长期,传代时间应为48h。在48h对这5个密度梯度取样测G1期细胞比率,发现1.5×106和7×105 cells/mL的接种G1期细胞所占比例最高,细胞生长曲线上1.5×106 cells/mL接种达到的细胞密度最高,为8.3×106 cells/mL,因此确定细胞传代的最佳条件为细胞密度为1.5×106 cells/mL,传代时间为48h。对摇床转速（160、150、140、130、120、110 rpm/min）和细胞生长期的培养温度（38、37、35、33℃）进行了梯度摸索,最终得到最佳条件是转速为130-150 rpm/min和细胞生长温度为37℃。以确定的细胞生长期为基础,进行种毒的条件（MOI、种毒时的细胞密度以及TPCK-胰酶浓度）的摸索。H7N9禽流感病毒的病毒感染复数（MOI）的梯度范围为5×10-2、2.5×10-2、5×10-3、10-3、5×10-4、2.5×10-4、1.25×10-4、2.5×10-5;TPCK-胰蛋白酶的添加梯度范围为2.5、2、1.5、1、0.5和0μg/mL;接种H7N9禽流感病毒时细胞密度的梯度选择为7×106、6×106、5×106、4×106和3×106cells/mL。逐步摸索这几个关键控制点的最优范围或数值,得到H7N9病毒产毒期最佳的参数:种毒细胞密度4×106 cells/mL,H7N9病毒接种的MOI为10-3,TPCK-胰蛋白酶添加量最适范围为1-1.5μg/mL,这些参数可以使H7N9禽流感病毒的血凝滴度达到1:26.5。确定产毒期各基本条件后,进行病毒增值曲线的绘制,发现最佳收毒时间为48h。然而此时的血凝滴度较低,因此适当的优化是极为必要的。在基本工艺参数的基础之上,本研究从营养物或添加物的使用等角度对工艺进行优化。谷氨酰胺是三羧酸循环的关键中间产物之一,适宜的添加谷氨酰胺常常有利于病毒的增殖。以上述研究确定的参数,使用谷氨酰胺添加物GlutaMax按不同的稀释浓度（1、2、4、8 mM）进行添加,未见添加GlutaMax有提升流感病毒血凝滴度的作用,说明所使用的培养基在该参数上已优化到最佳。TPCK-胰蛋白酶在添加后24h内会完全降解,因此研究定时添加TPCK胰酶（每12h添加、仅在12h添加一次和每24h添加三组）以验证其对流感病毒增殖的促进作用,未见补加TPCK-胰酶对产毒的明显影响。使用不同的商业化培养基（培养基A、B、C）配比使用,培养基A:培养基B以1:1配比使用,可以使细胞密度在48h提升2×106 cells/mL,病毒滴度不低于单独使用培养基A。在产毒期换液,每24 h一次,细胞持续生长且表达病毒,提示细胞达到了携病毒生长状态。48h将细胞用Triton-X100将细胞裂解后,培养液中病毒血凝滴度剧增,达到1:29HA units/50μL。以实验室的规模的工艺参数为基础,在7.5L生物反应器进行悬浮放大培养,对搅拌速度、pH、温度和溶氧进行摸索,确定最佳细胞生长期条件。得到细胞生长期最佳pH条件为7.0,溶氧为50%,温度为37℃,搅拌速度为70110 rpm/min。通过本文的研究,开发了基于悬浮MDCK细胞的A/H7N9禽流感病毒疫苗的高效生产工艺,为A/H7N9禽流感病毒疫苗的工业化生产奠定了基础。
吴娅丽[6]（2020）在《基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究》文中研究指明研究背景:血栓性疾病是人类死亡的主要原因之一,临床常用具抗血小板、抗凝和溶栓等作用的药物对其进行治疗,但多数药物伴随出血副作用;中医认为血栓疾病与血瘀证密切相关,通常使用活血化瘀类药物治疗血瘀证,其中动物药（如水蛭、地龙等）为中医活血化瘀的常用药;地龙及含地龙的成方制剂作为抗凝剂和纤溶药物已应用了几个世纪,且被认为无出血副作用;口服蚓激酶制剂在许多国家用于保护心血管,且在我国已作为二类新药上市。中药动物药的研究一直是个难题,威廉环毛蚓作为《中国药典》:收录地龙品种,其抗血栓关键物质基础、作用靶点及机制均尚不明确,故缺乏科学依据指导其临床应用,因此,研究威廉环毛蚓的抗血栓物质基础及作用机制有重大意义。由于地龙的抗血栓成分主要为蛋白质,本研究借助转录组学-蛋白组学相结合的模式,阐释威廉环毛蚓的抗血栓物质基础,并初步探究其作用机制。研究目的:基于多组学模式鉴定威廉环毛蚓中所含蛋白质,通过分离纯化初步定位其抗血栓活性部位并鉴定分析该部位蛋白质成分的序列、结构和性质;利用动物模型评价该部位预防血栓形成的作用、溶栓作用及血管保护作用;通过分子对接和体外模型探讨其抗血栓作用靶点和机制,及血管保护作用机制;借助蛋白组学技术从整体分析其抗血栓及血管保护作用涉及的生物过程及信号通路。研究方法与研究结果:研究一威廉环毛蚓无参考基因转录组的构建及分析采用基于Illumina高通量测序平台的无参考基因RNA测序技术构建威廉环毛蚓的无参考基因转录组,进而构建其蛋白序列库,为后续研究提供支持。通过测序,共得到超过2000万的clean reads,其中高质量reads超过97%;Trinity拼接后,得到超过10万个转录本和unigenes;翻译所拼接的转录组数据,构建威廉环毛蚓蛋白序列库。ESTScan软件共预测11259个编码序列,可作为引物设计数据库使用。通过与公共数据库比对,共注释 38.21%的 unigenes。研究二威廉环毛蚓总提物的鉴定及抗血栓性质研究采用转录组学-蛋白组学-活性研究整合关联分析方法,以“研究一”所构建的蛋白序列库为数据库,鉴定威廉环毛蚓总提物的蛋白质成分;建立纤维蛋白原-凝血酶时间法（Fib-TT）用于抗凝血活性的体外评价,并基于该方法考察总提物在不同孵育体系中的抗凝活性变化,进而评价其抗血栓性质;研究总提物在不同体系中的蛋白质谱图变化,推测其抗血栓活性成分。从威廉环毛蚓总提物中鉴定到31种蛋白质成分;所建立的Fib-TT 法线性范围较宽,仪器精密度、重复性均良好,可用于威廉环毛蚓抗凝活性的体外评价;总提物的抗凝活性在近中性条件下较为稳定,在30-50℃下活性稳定;通过考察总提物经不同体系孵育后蛋白质图谱的变化,推测其抗血栓活性成分为分子量在26kDa附近的蛋白质。研究三威廉环毛蚓抗血栓成分的分离纯化及鉴定通过“研究二”发现威廉环毛蚓总提物具有较强的抗血栓活性,本实验基于Fib-TT法,采用离子交换色谱分离纯化威廉环毛蚓的抗血栓活性成分,命名为DPf3,采用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS确定其分子量;通过转录组学-蛋白组学整合研究方式,鉴定DPf3主要成分DPf3 ID NO.1和DPf3 ID NO.2的蛋白质种类;采用从头测序技术确定DPf3主要成分的蛋白质序列,圆二色谱考察其二级结构,I-TASSER预测其三级结构,SAVES评价预测模型;并通过溶血实验考察DPf3的血液相容性。研究发现DPf3的主要成分DPf3 IDNO.1和NO.2的分子量分别为36121.745 Da和24485.004 Da,分别含有329和241个氨基酸;de novo测序获得二者的蛋白质全序列,通过与所构建的本地蛋白序列库比对,分别为>Ac44553g1i11和>Dc43026gli12,序列覆盖度达100%;DPf3的二级结构包含α-螺旋（19%）,β-折叠（30%）和无规则卷曲（51%）;DPf3的浓度低于4.21 mg·mL-1时具有较好的血液相容性。研究四DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的作用研究采用普纳替尼致血管损伤型斑马鱼血栓模型考察DPf3预防血栓形成的作用、溶栓作用和血管保护作用。发现DPf3（4.2-12.5 ng/尾）具较强的预防血栓形成的作用,其预防能力较阿司匹林（45 μg·mL-1）无显着差异。同时,DPf3（4.2ng/尾）具明显的溶栓作用,其溶栓能力较尿激酶（5ng/尾）无显着性差异。此外,DPf3具较强的血管保护作用。研究五DPf3抗血栓活性的体外评价及机制研究通过分子对接和体外实验相结合的方式考察DPf3的抗血栓作用及作用机制。首先采用分子对接评价DPf ID NO.1和NO.2与纤维蛋白（原）、纤溶酶原、凝血酶间的相互作用;继而通过酶谱法、光散射法、形态学研究、纤维蛋白平板法、体外血栓法及凝血四项评价研究DPf3的抗血栓活性及机制。通过分子对接发现DPf3 ID NO.1和NO.2对纤维蛋白（原）、纤溶酶原均有直接作用,体外实验发现DPf3对纤溶酶原作用很弱,对纤维蛋白（原）及体外血栓均有很强的水解作用;与生成的纤维蛋白栓块相比,纤维蛋白原可能是DPf3的初始作用靶点,且DPf3对纤维蛋白原的作用更强;通过凝血四项评价,发现DPf3能显着延长APTT、降低Fib的含量,且具有延长TT的作用趋势。研究六DPf3血管保护作用机制的细胞模型研究选取HUVECs为研究对象,以（hi）ox-LDL为造模剂,通过研究经DPf3保护前后,损伤性HUVECs的细胞活力、细胞膜完整性、细胞内ROS水平、细胞迁移能力、粘附因子VCAM 1的表达及单核细胞的粘附、血管生成等的变化,来探讨DPf3的血管保护作用机制。研究发现,DPf3对血管具显着保护作用,DPf3能够提高损伤性HUVECs的细胞活力、保护其细胞膜的完整性,降低细胞内ROS的生成;降低粘附因子VCAM I的蛋白表达水平,减少单核细胞的粘附;削弱损伤性细胞的迁移能力,并抑制其新生血管的生成。研究七基于蛋白质组学研究DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的影响采用蛋白组学技术从整体水平研究DPf3抗血栓和血管保护作用所涉及的生物标志物、生物过程和信号通路。通过血栓模型组与正常对照组对比,共鉴定得到1149个差异蛋白标志物,其中表达显着上调和下调的蛋白分别有582个和567个;通过DPf3给药组和模型组对比,共鉴定出66个差异蛋白标志物,其中表达显着上调和下调的蛋白分别有46个和20个,具有显着回调作用的蛋白有23个。通过对差异蛋白标志物所涉及的生物过程和信号通路进行归纳与分析,发现DPf3发挥抗血栓和血管保护活性的机制主要与调节脂质代谢、调节能量代谢、补体与凝血系统、ECM受体相互作用、MAPK信号通路等相关。研究结论:本研究以“转录组学-蛋白组学”多组学结合的模式为基础,初步构建中药地龙威廉环毛蚓的本地蛋白序列库,通过分离纯化得到其抗血栓活性成分（DPf3）,对DPf3进行鉴定及机制研究。研究发现威廉环毛蚓总提物具良好的抗血栓活性,从中鉴定到31个蛋白质成分,其中分离所得DPf3具良好的预防血栓、溶栓及血管保护作用,且具较好的血液相容性,为威廉环毛蚓抗血栓的物质基础。DPf3的抗血栓机制为:（1）具有很强的纤维蛋白和纤维蛋白原水解活性,且能够激活纤溶酶原形成纤溶酶;（2）具有较强的直接溶栓作用;（3）通过影响内源性或/和共同凝血途径及第三种凝血途径产生抗血栓作用。DPf3对血管内皮的保护作用机制为:（1）提高损伤性血管内皮细胞的细胞活力,保护细胞膜的完整性,降低损伤性细胞内ROS的生成;（2）降低粘附因子VCAM 1的蛋白表达水平,减少单核细胞的粘附;（3）削弱损伤性细胞的迁移能力,从而降低炎症细胞的扩散;（4）抑制新生血管的生成,进而抑制血管新生内膜的形成。通过蛋白组学技术从整体水平研究,发现DPf3发挥抗血栓和血管保护作用的机制主要与调节脂质代谢、调节能量代谢、补体与凝血系统、ECM受体相互作用、MAPK信号通路等相关。综上,本研究基本证实了中药地龙威廉环毛蚓的抗血栓关键物质基础,明确其作用靶点并初步确定其作用机制,为威廉环毛蚓的临床使用提供科学依据,为进一步研究其抗血栓活性成分的分子机制提供基础和依据,并为中药动物药的研究提供思路和方法。
黄琪[7]（2020）在《蛋白激酶抑制剂Roscovitine靶向PB2抑制流感病毒复制的作用及其机制》文中研究表明研究背景:甲型流感病毒（InfluenzaA virus,IAV）因其传染性强、变异速度快、发病率和死亡率高的特点,已经成为严重威胁人类健康和社会安定的病毒之一。目前接种疫苗是预防流感病毒感染的主要手段,但疫苗的更新速度以及流感病毒不断突变的特点致使常规的季节性疫苗不能有效防治病毒。因此抗流感病毒药物的使用在防治病毒中起到至关重要的作用。迄今为止,临床上使用的抗流感药物主要分为两大类:M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂。但是临床上已出现多种对这上述两种类药物耐药的流感病毒株,使现有抗流感病毒药物的发展应用受到一定影响。因此人们迫切想要寻找到不同于现有作用机制的新型抗流感药物。流感病毒PB2cap结构域基因序列具有高度保守性,已成为抗病毒药物研究的重要靶标之一。然而一个全新的药物从研发到进入临床是一个耗时耗力的过程,因此,对目前已存在且已知安全性的药物进行抗病毒活性研究则可以明显缩短研究周期,如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂类（cyclin-dependent kinase inhibitors,CDKI）化合物,已发现不同选择性的CDKI对不同病毒,如人类免疫缺陷病毒、疱疹病毒或流感病毒等具有较强的抑制作用。在前期实验中,我们从实体小分子化合物出发,进行基于细胞水平的抗病毒活性筛选,发现Roscovitine是一个极具潜力的抗甲型流感病毒小分子化合物。而Roscovitine作为一种广谱CDKI,已处于Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段,在用于癌症的治疗中表现出较高的安全性,被认为是治疗癌症,神经退行性疾病,以及病毒感染等潜在的药物。研究目的:本文通过研究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂Roscovitine抗甲型流感病毒的活性,探寻其作用机制,期望能够从现有化合物中找到新的抗流感病毒药物,为抗流感病毒药物的研究开发提供新的思路和策略。研究方法:1.使用MTT法测定Roscovitine对细胞活性的影响,MTT结合空斑实验测定Roscovitine对不同亚型的流感病毒的抑制作用以及对子代病毒载量的影响。2.使用蛋白印迹法、免疫荧光和实时荧光定量测定Roscovitine对甲型流感病毒在细胞内复制的影响。3.通过血凝抑制实验、H5N1假病毒抑制实验、神经氨酸酶抑制实验探究Roscovitine对病毒进入或子代病毒粒子释放是否具有抑制作用;time-of-addition实验和mini-replicon实验研究Roscovitine作用于病毒复制的具体阶段。4.通过荧光偏振实验、表面等离子体共振技术和分子对接技术确定Roscovitine的作用靶点。实验结果:1.Roscovitine可抑制多种亚型的甲型流感病毒感染,对A/WSN/1933（H1N1）、A/Aichi/2/68（H3N2）和 A/FM1/47（H1N1）的 IC50分别是 3.35±0.39,7.01±1.84 和5.99±1.89 μM,同时Roscovitine对MDCK和Beas-2B细胞具有较低的细胞毒性,且其抗病毒作用不具有细胞特异性。2.Roscovitine不能抑制病毒引起的血凝现象和H5N1假病毒感染,同时对神经氨酸酶的活性无明显抑制作用。3.Roscovitine在病毒感染细胞后的2-5 h和5-8 h能够明显的抑制流感病毒蛋白和mRNA的表达。4.Roscovitine可显着降低病毒RNA聚合酶的活性,主要通过与PB2cap蛋白特异性结合。5.Roscovitine 能够与 PB2cap 蛋白上的 His-357,Phe-404,Phe-323,Met-431和Lys-376 结合。6.Roscovitine可以下调被病毒激活的JAK/STAT炎症信号通路的表达。实验结论:1.Roscovitine具有抗甲型流感病毒的活性,可抑制不同亚型的甲型流感病毒。2.Roscovitine不作用于病毒的进入和子代病毒的释放过程。3.Roscovitine通过抑制病毒基因组的转录和复制阶段而发挥抗病毒的作用。4.Roscovitine通过与PB2cap蛋白特异性结合抑制病毒的转录和复制。5.Roscovitine下调病毒所激活的JAK/STAT信号通路,抑制炎症过度反应。
刘丹丹[8]（2019）在《人源化单克隆抗体药物临床前研发风险管理研究》文中认为近年来,全球医药市场的发展重心正逐步从小分子化学药转向生物药,生物药在全球医药市场中的比例已接近20%,并有逐步扩大之势。在生物药研发中,单克隆抗体药物研发无疑成为最受关注的焦点,是增长最快的细分领域之一,已成为生物药中最重要的一大品类,人源化单克隆抗体药物在单克隆抗体药物中占有重要地位,尤其是在国内单克隆抗体药物研发中占有更加重要的地位。由于创新药物研发是一项风险高、耗费时间长、投入资金巨大的工程。我国创新药物研究发展比较落后,各个制药企业规模小,自主创新能力弱,对创新药研发风险估计不足,承担新药研究风险的能力弱。所以,对人源化单克隆抗体药物研发风险管理进行系统研究,降低企业研发风险,对我国制药企业意义重大。本文基于人源化单克隆抗体药物研发的特点,结合我国人源化单克隆抗体药物研发的现状,对人源化单克隆抗体药物临床前研发过程中的风险进行研究:①通过文献研究,梳理出人源化单克隆抗体药物研发流程。包括:靶点的选取研究、鼠源性单克隆抗体的获取研究、人源化单克隆抗体细胞株构建研究、细胞培养与工艺研究、制剂处方与工艺设计研究、临床前动物试验研究和临床试验研究。②通过文献研究法和德尔菲法,准确识别出人源化单克隆抗体药物临床前研发风险:细胞株构建研发阶段包括3个目标层指标、19个因素层指标、83个指标层指标;细胞培养和工艺研发阶段包括1个目标层指标、6个因素层指标、58个指标层指标;制剂研发阶段包括1个目标层指标、5个因素层指标、21个指标层指标;动物试验研发阶段包括1个目标层指标、3个因素层指标、16个指标层指标。③通过问卷调查的方式对相关风险指标进行量化和赋值,运用风险矩阵法对人源化单克隆抗体药物临床前研发风险进行评价:靶点的选取研究风险RR值为2.74,是较高风险;鼠源性单克隆抗体的获取研究风险RR值为2.08,是一般风险,人源化单克隆抗体细胞株构建研究风险RR值为2.56,是较高风险;人源化单克隆抗体药物细胞培养与工艺研究风险RR值为2.32,是一般风险;人源化单克隆抗体药物制剂研究风险RR值为2.63,是较高风险;人源化单克隆抗体药物动物试验研究风险RR值为2.93,是较高风险。④根据风险评价结果,提出风险控制的措施。通过人源化单克隆抗体药物临床前研发风险管理研究,为降低企业人源化单克隆抗体药物研发风险,提升我国单克隆抗体药物研发风险管理研究水平提供多角度的参考依据。
张振江[9]（2019）在《猫细小病毒分离鉴定及其马源特异性抗体F（ab’）2的制备与预防效果评价》文中认为猫细小病毒（Feline parvovirus、FPV）是细小病毒的一种,在全世界范围内广泛流行。FPV能引起胎儿死亡或者新生幼猫小脑发育不全及共济失调,在成年猫中表现为一种非常致命的急性肠炎,伴有严重的白细胞减少症。到目前为止,还没有有效的药物来预防和治疗感染FPV,迫切需要开发一种安全特效的生物制剂。免疫球蛋白γ（IgG）抗体是免疫系统的关键效应蛋白,它有很高的特异性,对病原体暴露或接种疫苗后的免疫记忆是必不可少的。为此,本研究选择效价高的分离毒株,制备了FPV灭活疫苗免疫马匹,提取马血清IgG并经酶消化F（ab’）2片段,评价该蛋白对FPV的预防保护效果。试验分为三部分内容,具体研究如下:1、猫细小病毒分离鉴定及VP2基因遗传进化和氨基酸位点的分析2016-2018年本研究对来自广西南宁市宠物医院和花鸟市场采集的86份疑似FPV病料进行检测,发现阳性率为28%（24/86）。将阳性病料同步接种F81细胞,共分离到6株病毒,依次命名为GX01、GX02、GX03、GX04、GX05和GX06,并对分离到的6株病毒进行血凝试验、TCID50测定、病毒理化性质测定、电镜观察、VP2基因遗传进化和氨基酸位点的分析。结果显示:6株FPV血凝效价在27-210之间。经细胞传代至F5代时毒价稳定,TCID50在10-4.69/mL-10-6.20/mL之间。该分离毒株对热、酸碱和脂溶较稳定。电镜观察病毒的形态与细小病毒的外观相同呈圆形。GX01的VP2基因与中国毒株XJ-1亲缘关系比近同源性达到99.7%,而GX02、GX03、GX04、GX05和GX06与日本毒株V211在一个大分支上;氨基酸位点分析发现6株FPVVP2氨基酸均发生了突变,但决定血凝活性和毒力的关键位点没有发生改变。通过实验发现GX01效价高且稳定与国内流行株同源性高,因此选择GX01作为后续研究。2、GX01株全基因测定及FPV动物发病模型的建立本研究设计6对引物通过常规PCR扩增,获得GX01株全基因序列。将GX01株以不同剂量经口腔和鼻腔感染猫,通过测定LD50,观察临床症状、白细胞含量变化和组织病理变化等指标,构建FPV动物发病模型。结果显示:GX01毒株全基因序列全长为4901bp,国与国外FPV亲缘关系较远与国内流行株FPV-XJ1、FPV-HN-ZZ1和FPV-HRB等亲缘关系较近。以GX01株不同剂量感染猫后均表现出高热、腹泻、呕吐和体重下降等典型临床症状,感染第3d粪便PCR检测FPV为阳性,发病6 d后白细胞严重减少。攻毒14 d后测定LD50为10-2.2表现为胃空虚、肠鼓气、部分脏器肿大有出血点;组织病理切片观察到十二指肠和肺脏上皮细胞出现胞浆、胞核侵染、坏死等明显的组织病变,肾脏出现脂肪变性等表现出典型的FPV临床及病理变化从而证实成功构建了FPV动物发病模型。3、免疫球蛋白F（ab’）2的提取与纯化及其预防效果初步评价通过大量培养GX01株病毒,分别制备油乳苗和蜂胶灭活苗免疫马匹,以血凝抑制效价评估两种疫苗的优劣,待效价达到最高时采集马血清,选择不同工艺提取IgG,经酶切消化获得F（ab’）2片段,通过体外的血清中和试验和体内的紧急预防试验来评价效果。结果显示:以GX01株制备油乳苗和蜂胶苗,抗体效价监测结果表明油乳苗比蜂胶苗更合适作为制备马抗FPV抗体的免疫原;经过对不同工艺提取IgG的含量、纯度和血凝抑制效价的比对,证实优化的正辛酸-硫酸铵沉淀法为提取IgG的最佳工艺,酶切消化IgG制备F（ab’）2的最佳条件为30℃ 3.5h。经亲和层析法重复多次,得到F（ab’）2的含量、纯度和回收率分别为8.64mg/mL、90.36%和93.24%。免疫球蛋白F（ab’）2在体外细胞中和试验中中和效价为1:586,血凝抑制效价为1:2048;在体内动物预防保护试验中证实该蛋白在72h内能有效保护50%以上动物避免FPV的感染。
刘静[10]（2019）在《A型流感病毒通用VLPs疫苗的研究与通用抗体的评价》文中进行了进一步梳理A型流感病毒（IAV）是囊膜型的,分节段的,负链RNA病毒,属于正黏病毒科,流感病毒属。A型流感病毒由8个基因片段组成,每个基因片段编码至少一种蛋白质。迄今为止,IAV可编码13种病毒蛋白。基于病毒表面蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原差异,可将IAV分为18个HA和11个NA亚型。近年来,跨越动物—人类宿主物种屏障的A型流感病毒的病毒数量愈来愈多,给人类健康带来严重威胁。目前,流感病毒疫苗是预防流感病毒的有效方法,特别是应对季节性流感的重要手段。然而,流感病毒的主要抗原血凝素（HA）易发生基因突变,当疫苗毒株与流行毒株不匹配时,增加了流感病毒在人间传播流行的风险。因此,A型流感病毒通用VLPs疫苗与通用抗体的研究,对于应对抗原漂移变异后的流感病毒在人、动物间的流行具有重要意义。一、通用型流感病毒疫苗的研究方向主要有以下几个:血凝素HA茎部蛋白;膜蛋白M2离子通道的胞外域蛋白（M2e）;内部核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）。本研究选择高致病性禽流感病毒H5N1 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012（SH-lclade 2.3.2.1;group 1）的 HA 茎部蛋白（HA Stem Protein,HLHA）、核蛋白（Nuclear protein,NP）、基质蛋白（Matrix Protein,M1）和A型流感病毒的融合蛋白5M2e（2个人源、1个猪源和2个禽源）,及融合蛋白HL5M2e（5M2e嵌合入HLHA以替补HA头部的位置）为靶抗原,通过昆虫—杆状病毒表达系统来构建和制备AIV VLPs,并对其进行免疫原性研究。通过滴鼻途径免疫小鼠,3种AIV VLPs对BALB/c小鼠呈现出80%-90%不等的保护率。所有数据显示,HL5M2e VLPs的免疫原性最好。因此,以HL5M2e VLPs为基础开发通用型AIV疫苗具有潜在的发展空间。二、考虑到免疫接种的疫苗应以能够诱导小鼠的黏膜免疫为主,使小鼠能够获得足够的黏膜免疫抗体sIgA,做好第一道防线。基于此,在HL5M2e VLPs的基础上,又拯救了表达黏膜佐剂融合蛋白 glycosylphosphatidylinositol-anchored CCL28（GPI-CCL28）和 glycosylphosphatidylinositol-anchored GM-CSF（GPI-GM-CSF）基因的重组杆状病毒,制备出嵌合型AIV cVLPs（CCL28 cVLPs、GM-CSF cVLPs和CCL28/GM-CSF cVLPs）。与 AIV 病毒样颗粒 HL5M2e VLPs（含 HL5M2e、NP 和Ml）相比,可保护BALB/c小鼠对不同亚型的A型流感病毒的攻击呈现不同的存活率:同源 H5N1 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012（SH-1;clade 2.3.2.1;group 1）可达100%;异源鼠适应株H1N1 A/Changchun/01/2009（group 1）可达50%-60%;异源鼠适应株 H3N2 A/baikal teal/Shanghai/SH-89/2013（group 2）可达 40-50%和异源鼠适应株 H7N7 A/Lesser White-fronted goose/HuNan/412/2010（group 2）可达 10-20%。通过滴鼻免疫结果显示,嵌合了 CCL28和GM-CSF的嵌合型AIV cVLPs可作为一种具有交叉保护活性的A型流感病毒疫苗候选株,为研发能够针对不同亚型A型流感病毒的通用型流感疫苗奠定实验室基础。三、对3株A型流感病毒通用型人源化抗体F10、H98和H40进行了构建和表达,以及体外血凝抑制活性和中和活性的鉴定。结果显示,人源化mAb Fl0比其它两种人源化mAb具有更高的中和滴度和更宽的中和范围,可作为用于构建随机突变抗体库的基础抗体,为接下来的抗体筛选工作奠定了实验室基础。
二、微量血凝抑制试验操作中常见问题及解决办法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、微量血凝抑制试验操作中常见问题及解决办法（论文提纲范文）
（1）老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究（论文提纲范文）
| 武汉生物制品研究所博士学位论文创新点概述 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1. 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 研究进展 |
| 1.3 研究内容和目标 |
| 2. 第一章60周岁及以上老年人群免疫QIVs前后外周全血Total mRNA表达谱研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3. 第二章60周岁及以上老年人群QIVs免疫前后T淋巴细胞分布及动力学特征 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4. 第三章 老年人群QIVs免疫反应主要细胞因子与免疫球蛋白Ig产生及动力学特征 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5. 全文创新性总结 |
| 6. 文献综述--老年人群流感病毒疫苗有效性评价所面临的挑战 |
| 6.1 影响流感病毒疫苗有效性评价的混杂因素 |
| 6.2 流感病毒免疫史对流感病毒疫苗有效性评价的影响 |
| 6.3 流行病学研究提升针对老年人群开发下一代流感病毒疫苗 |
| 6.4 结论 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录a. 受试者入选、排除标准及提前终止实验标准 |
| 附录b. 实验组和对照组QIVs疫苗株 |
| 附录c. 63 份老年人外周全血转录组测序原始数据Raw-Data存储于GEO公共数据库 |
| 附录d. Supplementary Materials (Figure S and Table S) |
| Figure S |
| Table S |
| References |
（2）抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 小鹅瘟病毒研究现状 |
| 1.1.1 小鹅瘟病毒及小鹅瘟病简介 |
| 1.1.2 小鹅瘟病毒的鉴定方法 |
| 1.2 小鹅瘟生物制剂研究进展 |
| 1.2.1 小鹅瘟病毒活疫苗 |
| 1.2.2 小鹅瘟病毒灭活疫苗 |
| 1.2.3 小鹅瘟病毒基因疫苗 |
| 1.2.4 小鹅瘟病毒重组活载体疫苗 |
| 1.2.5 小鹅瘟抗血清 |
| 1.2.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体 |
| 1.3 卵黄抗体的研究进展 |
| 1.3.1 卵黄抗体的结构特点 |
| 1.3.2 卵黄抗体的提取方法 |
| 1.3.3 卵黄抗体的灭活方法 |
| 1.3.4 卵黄抗体应用 |
| 1.3.5 卵黄抗体的优势与展望 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 主要材料和试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 研究技术路线图 |
| 2.3.2 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 2.3.3 小鹅瘟病毒的鉴定 |
| 2.3.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备及检验 |
| 2.3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 2.3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体质量评价 |
| 2.3.7 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 2.4 试验数据分析及统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 3.1.1 小鹅瘟病毒在雏鹅分离培养结果 |
| 3.1.2 小鹅瘟病毒在鹅胚分离培养结果 |
| 3.2 小鹅瘟病毒鉴定 |
| 3.2.1 小鹅瘟病毒特异性试验结果 |
| 3.2.2 小鹅瘟病毒粒子超微结构观察结果 |
| 3.2.3 小鹅瘟病毒毒力测定 |
| 3.2.4 小鹅瘟病毒理化特性 |
| 3.2.5 小鹅瘟病毒的纯净性试验结果 |
| 3.2.6 小鹅瘟病毒核酸检测结果 |
| 3.2.7 小鹅瘟病毒VP3基因序列鉴定 |
| 3.3 小鹅瘟病毒灭活疫苗抗原的制备及成品检验 |
| 3.3.1 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗制备抗原用病毒的检验 |
| 3.3.2 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗检验 |
| 3.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 3.4.1 产蛋鸡选择结果 |
| 3.4.2 高免鸡蛋的琼扩抗体效价监测结果 |
| 3.4.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定 |
| 3.4.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的确定 |
| 3.4.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体外源性病毒灭活方法确定 |
| 3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 3.5.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体的理化特性 |
| 3.5.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体的安全性评价 |
| 3.5.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体对人工感染雏鹅的治疗效果评价 |
| 3.5.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体对雏鹅注射后攻毒的预防效果评价 |
| 3.5.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体与试验选用的同类产品差异试验 |
| 3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 3.6.1 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体物理性状的影响 |
| 3.6.2 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体纯净性的影响 |
| 3.6.3 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体琼扩抗体效价的影响 |
| 3.6.4 储存温度及时间对雏鹅攻毒预防效果的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小鹅瘟病毒的分离鉴定及生物学特性分析 |
| 4.2 小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析 |
| 4.3 影响HA与HI效果的因素分析 |
| 4.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备 |
| 4.5 鸡群的选择管理与高免蛋黄收集 |
| 4.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定及主要影响因素分析 |
| 4.7 最优小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法确定及分析 |
| 4.7.1 辛酸终浓度对小鹅瘟病毒卵黄抗体的影响 |
| 4.7.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的对比分析及验证 |
| 4.7.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的琼扩抗体效价与蛋白浓度的相关性分析 |
| 4.8 小鹅瘟病毒卵黄抗体灭活条件的确定 |
| 4.9 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 4.9.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体安全性评价 |
| 4.9.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体治疗效果评价 |
| 4.9.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的预防效果评价 |
| 4.9.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体试验选用的同类产品差异 |
| 4.10 储存条件的确定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
（3）新疆某规模化鸡场新城疫抗体的动态监测及免疫程序的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 新城疫的研究现状 |
| 1.1 新城疫的病原学 |
| 1.2 新城疫的流行病学 |
| 1.3 新城疫的临床症状及病理变化 |
| 1.4 新城疫的诊断 |
| 1.5 新城疫防控 |
| 2 本研究的目的与意义 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 近四年新城疫免疫抗体的动态监测 |
| 1 材料 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 试验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 3个麻羽种鸡场近四年的免疫程序 |
| 2.2 样品采集 |
| 2.3 NDV抗体检测方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 三个种鸡场近四年NDV抗体检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验二 不同疫苗免疫抗体的检测及免疫效果对比 |
| 1 材料 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 试验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗体检测 |
| 2.2 免疫效果对比 |
| 3 结果 |
| 3.1 各型疫苗免疫后抗体检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验三 新城疫免疫程序的优化方案 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验疫苗 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试验试剂及仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫程序的优化 |
| 2.2 NDV抗体检测 |
| 2.3 免疫后鸡群健康状况监测 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫程序的优化 |
| 3.2 NDV抗体检测 |
| 3.3 免疫后鸡群的健康情况 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（4）H5N6禽流感病毒HA基因158位糖基化位点修饰的生物学效应与宿主免疫应答机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 流感病毒跨种间传播的潜在机制及其HA蛋白糖基化位点的相关生物学作用 |
| 1 H5亚型禽流感病毒谱系及流行现状 |
| 1.1 H5亚型流感病毒的病原特点及分子流行病学 |
| 1.2 Clade 2.3.4.4新型重组禽流感病毒流行现状 |
| 2 禽流感病毒跨种间传播的潜在机制 |
| 2.1 流感病毒HA蛋白对跨种间传播的影响 |
| 2.2 影响流感病毒跨种间传播的宿主因素 |
| 2.2.1 唾液酸受体 |
| 2.2.2 宿主调控免疫应答影响流感病毒的适应性 |
| 2.3 影响流感病毒跨宿主传播的其他蛋白 |
| 2.4 环境和生理因素 |
| 3 流感病毒HA蛋白糖基化的功能 |
| 3.1 病毒蛋白糖基化 |
| 3.2 糖基化修饰影响蛋白稳定性 |
| 3.3 糖基化修饰影响流感病毒HA蛋白受体结合特性 |
| 3.4 糖基化修饰影响流感病毒的复制以及致病力 |
| 3.5 糖基化修饰影响流感病毒识别免疫细胞相关受体 |
| 3.6 糖基化修饰介导病毒的免疫逃避 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 Clade 2.3.4.4 H5NX HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对受体结合特性的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒与细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要的试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的纯化与鉴定 |
| 2.1.1 病毒的空斑纯化 |
| 2.1.2 纯化毒株鉴定 |
| 2.2 病毒遗传进化分析 |
| 2.3 重组病毒的构建 |
| 2.3.1 H5NX病毒HA及NA反向遗传质粒的构建 |
| 2.3.2 重组病毒的拯救及鉴定 |
| 2.4 HA蛋白迁移率分析 |
| 2.5 流感病毒的受体结合特性分析 |
| 2.5.1 鹅红细胞血凝试验 |
| 2.5.2 固相ELISA试验 |
| 2.6 重组病毒的生物学特性测定 |
| 2.6.1 SPF鸡胚半数感染量(EIDso)的测定 |
| 2.6.2 细胞半数感染量(TCIDso)的测定 |
| 2.6.3 小鼠的致病性实验 |
| 2.7 病毒体外增殖能力的测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 新型重组病毒H5NX的遗传进化 |
| 3.2 新型重组病毒H5NX的受体结合特性 |
| 3.3 新型流感重组病毒的生物学特性 |
| 3.4 新型重组流感病毒HA蛋白的迁移率 |
| 3.5 Y6和HX及其重组病毒的体外增殖能力 |
| 3.6 Y6和HX及其重组病毒对小鼠的致病力 |
| 3.7 H5NX重组病毒的受体结合特性 |
| 3.7.1 鹅红细胞血凝试验 |
| 3.7.2 固相结合ELISA试验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H5N6HPAIVHA蛋白158位糖基化位点修饰对病毒生物学特性的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒与细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要的试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 片段构建 |
| 2.2 病毒拯救及传代 |
| 2.3 病毒生物学特性鉴定 |
| 2.4 病毒体外增殖能力的测定 |
| 2.5 小鼠的致病性实验 |
| 2.6 病毒热稳定性测定 |
| 2.7 抗原性差异分析 |
| 2.8 豚鼠红细胞解凝实验 |
| 2.9 细胞吸附实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组病毒的拯救、鉴定结果 |
| 3.2 重组病毒的生物学特性 |
| 3.3 RY6和RY6-160T在不同细胞中的增殖能力 |
| 3.4 重组病毒对小鼠的致病性 |
| 3.5 重组病毒抗原性差异 |
| 3.6 重组病毒豚鼠红细胞解凝实验 |
| 3.7 病毒的热稳定性分析 |
| 3.8 重组病毒吸附A549细胞的能力 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H5N6 HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对病毒复制与宿主免疫应答的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒与细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要的试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 RY6与RY6-160T HA蛋白三维结构图的生成 |
| 2.2 不同接种剂量下病毒体外增殖能力的测定 |
| 2.3 病毒在小鼠呼吸道复制能力的测定 |
| 2.3.1 小鼠脏器样品的采集与处理 |
| 2.3.2 应用Taqman探针荧光定量PCR方法测定病毒核酸拷贝数 |
| 2.3.3 小鼠肺脏和鼻甲骨中细胞因子的测定 |
| 2.4 病毒噬斑表型观察 |
| 2.5 病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP)形成和出芽分析 |
| 2.5.1 质粒构建与转染 |
| 2.5.2 使用蔗糖梯度离心纯化细胞上清 |
| 2.5.3 病毒HA蛋白免疫印迹分析 |
| 2.6 差异转录组学分析 |
| 2.6.1 采集样品送测 |
| 2.6.2 测序数据验证分析 |
| 2.7 间接免疫荧光和激光共聚焦观察目的蛋白 |
| 2.8 细胞凋亡的检测 |
| 2.9 MYH9蛋白检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 RY6和RY6-160T HA蛋白的三维结构 |
| 3.2 RY6与RY6-160T在不同细胞中的增殖能力 |
| 3.3 重组病毒在小鼠鼻甲骨、气管和肺脏中的复制能力 |
| 3.3.1 感染小鼠鼻甲骨、气管和肺脏中病毒载量的测定 |
| 3.3.2 感染小鼠鼻甲骨、气管和肺脏中相关细胞因子应答的测定 |
| 3.4 RY6和RY6-160T在MDCK细胞中噬斑表型 |
| 3.5 158位糖基化位点的修饰影响VLP的装配和出芽效率 |
| 3.6 A549感染细胞的转录组分析结果 |
| 3.6.1 RY6和RY6-160T重组病毒感染A549细胞的差异表达基因 |
| 3.6.2 差异蛋白GO功能分析及富集结果 |
| 3.6.3 表达差异基因的KEGG分析 |
| 3.7 重组病毒感染A549细胞后病毒复制相关基因的表达 |
| 3.8 重组病毒感染A549后宿主蛋白EGFR的表达模式及其细胞凋亡水平 |
| 3.8.1 重组病毒感染A549细胞后EGFR蛋白表达量分析 |
| 3.8.2 重组病毒感染A549细胞后EGFR蛋白表达对细胞凋亡的影响 |
| 3.9 重组病毒感染A549细胞后宿主蛋白MYH9的表达差异分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 A 549细胞中显着差异表达的基因(RY6 vs RY6-160T) |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）无血清规模化培养MDCK细胞的关键控制点研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 基于MDCK细胞培养的基本工艺参数摸索 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 第二章 悬浮MDCK细胞培养工艺的优化研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 悬浮MDCK细胞培养的规模化放大研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 总结和展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（6）基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 血栓的研究进展概述 |
| 1 概述 |
| 2 血栓的形成过程 |
| 3 血栓性疾病的临床治疗用药 |
| 4 血栓性疾病研究模型的构建 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药地龙抗血栓活性成分研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 地龙抗血栓活性物质 |
| 3 地龙抗血栓活性蛋白的研究 |
| 4 作用机制与毒副作用 |
| 5 临床应用 |
| 6 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 威廉环毛蚓无参考基因转录组的构建及分析 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 RNA提取、测序及转录本拼接 |
| 3 基因序列分析 |
| 4 基因功能注释和表达水平分析 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 威廉环毛蚓总提物的鉴定及抗血栓性质研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 威廉环毛蚓总提物的鉴定 |
| 3 威廉环毛蚓总提物的蛋白含量测定及抗血栓活性体外评价 |
| 4 威廉环毛蚓总提物的抗血栓性质研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 威廉环毛蚓抗血栓成分的分离纯化及鉴定 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 威廉环毛蚓抗血栓活性成分的分离纯化 |
| 3 抗血栓活性成分(DPf3)的鉴定 |
| 4 DPf3 ID NO.1和N0.2的结构预测及模型评价 |
| 5 DPf3的血液相容性评价 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的作用研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 普纳替尼诱导斑马鱼血栓模型的建立及DPf3最大检测剂量的确定 |
| 3 DPf3对斑马鱼血管损伤型血栓形成的预防作用评价 |
| 4 DPf3对斑马鱼血管损伤型血栓的治疗作用评价 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 DPf3抗血栓活性的体外评价及机制研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 DPf3 ID NO.1和N0.2的分子对接研究 |
| 3 DPf3的纤维蛋白(原)水解活性评价 |
| 4 DPf3的纤溶酶原激活作用研究 |
| 5 DPf3血栓溶解活性的体外研究 |
| 6 DPf3对凝血四项影响的体外研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 DPf3血管保护作用机制的细胞模型研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 HUVECs细胞培养方法的建立及DPf3对细胞活力/毒性的影响 |
| 3 DPf3对ox-LDL损伤性HUVECs的保护作用研究 |
| 4 DPf3对ox-LDL损伤性HUVECs活性氧产生的影响 |
| 5 DPf3对(hi) ox-LDL损伤性HUVECs粘附作用的影响 |
| 6 DPf3对(hi) ox-LDL损伤性HUVECs迁移能力和血管生成的影响 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 基于蛋白质组学研究DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的影响 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 斑马鱼样本的质量控制及评估 |
| 3 普纳替尼所致血管损伤型血栓形成的蛋白标志物分析 |
| 4 DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型影响的蛋白质组学研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）蛋白激酶抑制剂Roscovitine靶向PB2抑制流感病毒复制的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 Roscovitine具有抗甲型流感病毒的活性 |
| 一、实验仪器及材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结与讨论 |
| 第二章 Roscovitine作用于甲型流感病毒复制周期的研究 |
| 一、实验仪器及材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结与讨论 |
| 第三章 Roscovitine抗流感病毒作用靶点的研究 |
| 一、实验仪器及材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结与讨论 |
| 全文结论 |
| 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩写词中英文对照表 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（8）人源化单克隆抗体药物临床前研发风险管理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究思路 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 研究方法 |
| 1.6 技术路线 |
| 1.7 创新点 |
| 1.8 有关概念的界定与说明 |
| 1.9 本章小结 |
| 第二章 相关理论回顾及研究综述 |
| 2.1 风险管理相关理论回顾 |
| 2.1.1 风险管理理论研究回顾 |
| 2.1.2 风险管理标准研究回顾 |
| 2.1.3 风险管理模型及方法研究回顾 |
| 2.2 研发风险管理研究综述 |
| 2.2.1 国外研发风险管理研究综述 |
| 2.2.2 国内研发风险管理研究综述 |
| 2.3 药物研发风险管理研究综述 |
| 2.3.1 国外药物研发风险管理研究综述 |
| 2.3.2 国内药物研发风险管理研究综述 |
| 2.4 生物制品药物研发风险管理研究综述 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 风险管理方法设计 |
| 3.1 风险评估方法确定 |
| 3.2 风险评估方法介绍 |
| 3.3 数据处理和统计分析方法 |
| 3.3.1 数据筛查和整理 |
| 3.3.2 统计分析方法 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 人源化单克隆抗体药物研发流程 |
| 4.1 人源化单克隆抗体药物研发概述 |
| 4.2 人源化单克隆抗体药物研发流程 |
| 4.2.1 第一阶段:细胞株构建研发阶段 |
| 4.2.2 第二阶段:细胞培养与工艺研发阶段 |
| 4.2.3 第三阶段:制剂研发阶段 |
| 4.2.4 第四阶段:动物试验研发阶段 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 人源化单克隆抗体药物细胞株构建研发阶段风险管理 |
| 5.1 风险识别 |
| 5.2 风险分析 |
| 5.3 风险评价 |
| 5.4 风险控制 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 人源化单克隆抗体药物细胞培养与工艺研发阶段风险管理 |
| 6.1 风险识别 |
| 6.2 风险分析 |
| 6.3 风险评价 |
| 6.4 风险控制 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 人源化单克隆抗体药物制剂研发阶段风险管理 |
| 7.1 风险识别 |
| 7.2 风险分析 |
| 7.3 风险评价 |
| 7.4 风险控制 |
| 7.5 本章小结 |
| 第八章 人源化单克隆抗体药物动物试验研发阶段风险管理 |
| 8.1 风险识别 |
| 8.2 风险分析 |
| 8.3 风险评价 |
| 8.4 风险控制 |
| 8.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文（专着）目录 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 附录6 |
| 附录7 |
| 附录8 |
| 附录9 |
| 附录10 |
| 附录11 |
| 附录12 |
| 附录13 |
| 附录14 |
| 附件 |
（9）猫细小病毒分离鉴定及其马源特异性抗体F（ab’）2的制备与预防效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用缩写词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猫细小病毒的研究进展 |
| 1.1 病原学研究 |
| 1.2 FPV分子生物学 |
| 1.3 FPV流行病调查研究 |
| 1.4 展望 |
| 2 免疫球蛋白G(IgG)研究进展 |
| 2.1 IgG分子学研究 |
| 2.2 IgG提取方式及应用 |
| 2.3 展望 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 猫细小病毒分离鉴定及VP2基因遗传进化和氨基酸位点分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料 |
| 1.2 主要试剂及细胞株 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 病料处理 |
| 2.3 病毒DNA提取 |
| 2.4 F81细胞复苏、传代和冻存 |
| 2.5 病毒分离 |
| 2.6 病毒基因组DNA提取 |
| 2.7 病毒鉴定及VP2基因扩增 |
| 2.8 血凝(HA)试验 |
| 2.9 电镜观察 |
| 2.10 TCID_(50)测定 |
| 2.11 理化性质测定 |
| 2.12 分离株VP2序列分析 |
| 2.13 分离株VP2差异位点分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 肛试子PCR检测结果 |
| 3.2 病毒分离结果 |
| 3.3 分离株血凝试验结果 |
| 3.4 电镜形态观察结果 |
| 3.5 分离毒株TCID_(50)测定结果 |
| 3.6 分离株理化性质测定结果 |
| 3.7 分离株VP2基因克隆与分析 |
| 3.8 分离株VP2基因遗传进化分析 |
| 3.9 分离株VP2氨基酸位点差异性分析结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 猫细小病毒GX01毒株全基因测定及动物模型的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株及病毒 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试验试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 GX01株全基因测序及分析 |
| 2.2 FPV发病动物模型的建立 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 GX01全基因扩增及遗传进化分析 |
| 3.2 FPV发病模型构建 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 FPV F(ab')_2提取与纯化及其预防效果初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株及毒株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒大量增殖培养 |
| 2.2 灭活病毒 |
| 2.3 FPV蜂胶灭活苗制备 |
| 2.4 FPV油乳灭活苗制备 |
| 2.5 马匹的免疫 |
| 2.6 马血清HI效价的测定 |
| 2.7 IgG提纯方法 |
| 2.8 IgG浓度和HI效价的测定 |
| 2.9 IgG纯度检测 |
| 2.10 IgG酶切时间的确定 |
| 2.11 F(ab')_2分离纯化 |
| 2.12 F(ab')2纯度测定和回收率计算 |
| 2.13 F(ab')_2无菌、物理性状和安全性检测 |
| 2.14 F(ab')_2HI效价和细胞中和抗体效价的测定 |
| 2.15 动物预防保护试验 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 病毒大量培养 |
| 3.2 FPV灭活苗制备与检验 |
| 3.3 两种不同佐剂灭活苗免疫效果比较 |
| 3.4 IgG提纯方法比较结果 |
| 3.5 IgGHI效价测定结果 |
| 3.6 IgG纯度测定结果 |
| 3.7 IgG酶切时间的确定结果 |
| 3.8 F(ab')_2纯化结果 |
| 3.9 F(ab')_2含量测定和回收率的结果 |
| 3.10 F(ab')_2无菌检验结果 |
| 3.11 F(ab')_2物理性状及安全性检测结果 |
| 3.12 免疫球蛋白F(ab')_2HI和中和试验结果 |
| 3.13 免疫球蛋白F(ab')_2体内试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（10）A型流感病毒通用VLPs疫苗的研究与通用抗体的评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 流感病毒 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感的病原学和发病机制 |
| 1.3 流感的流行病学 |
| 1.4 流感的风险因素和临床特征 |
| 1.5 流感病毒的血凝素蛋白、核蛋白和膜蛋白 |
| 1.6 流感病毒疫苗的研究现状 |
| 1.7 通用型流感病毒疫苗 |
| 2. 病毒样颗粒疫苗 |
| 2.1 病毒样颗粒疫苗概述 |
| 2.2 病毒样颗粒疫苗的类型 |
| 2.3 流感病毒样颗粒疫苗 |
| 2.4 流感病毒样颗粒疫苗的未来发展方向 |
| 3. 嵌合佐剂分子型病毒样颗粒疫苗的设计 |
| 第二章 3种通用型A型流感病毒样颗粒的构建与制备 |
| 1. 材料 |
| 1.1 细菌与菌种 |
| 1.2 载体、质粒与抗体 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 试剂与培养基 |
| 1.5 昆虫细胞培养基TNM |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 HLHA、5M2e和HL5M2e三种融合基因的设计 |
| 2.2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.3 重组杆粒的制备与鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.5 重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.6 重组杆状病毒滴度的测定 |
| 2.7 流感病毒样颗粒的装配 |
| 2.8 流感病毒样颗粒的纯化与鉴定 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 HLHA、5M2e、HL5M2e、NP和M1基因重组质粒的鉴定 |
| 3.2 重组杆状病毒DNA的鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.4 流感病毒样颗粒的鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三章 3种通用型A型流感病毒样颗粒的小鼠实验免疫研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 实验小鼠和鸡胚 |
| 1.3 常用试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 细胞培养基 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 H5N1流感病毒的灭活 |
| 2.2 免疫和攻毒 |
| 2.3 IgG特异性抗体和黏膜IgA抗体的检测 |
| 2.4 小鼠肺脏病毒滴度检测 |
| 2.5 小鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 2.6 ELISpot检测细胞因子 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 黏膜IgA、IgG特异性抗体的检测 |
| 3.2 小鼠攻毒试验结果 |
| 3.3 脾淋巴细胞ELISpot细胞因子检测结果 |
| 3.4 小鼠肺脏病毒滴度检测 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第四章 嵌合CCL28及GM-CSF的嵌合型HL5M2e cVLPs (chimeric virus-like particles)的制备与鉴定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 常用试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 昆虫细胞培养基TNM |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 GPI-CCL28和GPI-GM-CSF融合基因的设计 |
| 2.2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.3 重组杆粒的制备与鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.5 重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.6 重组杆状病毒滴度的测定 |
| 2.7 流感病毒嵌合病毒样颗粒的装配与纯化 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第五章 嵌合CCL28及GM-CSF的嵌合型HL5M2e cVLPs的小鼠免疫实验研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 实验小鼠和鸡胚 |
| 1.3 常用试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 细胞培养基 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 H1N1、H3N2和H7N7灭活病毒的制备 |
| 2.2 免疫和攻毒 |
| 2.3 IgG特异性抗体和黏膜IgA抗体的检测 |
| 2.4 小鼠肺病毒EID_(50)的滴定 |
| 2.5 小鼠脾淋巴细胞的分离 |
| 2.6 ELISpot检测细胞因子 |
| 2.7 胞内因子FACS分析 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 IgG、黏膜IgA特异性抗体的检测 |
| 3.2 小鼠攻毒保护实验结果 |
| 3.3 脾淋巴细胞ELISpot细胞因子检测结果 |
| 3.4 脾淋巴细胞胞内因子FACS分析结果 |
| 3.5 小鼠肺脏病毒滴度检测 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第六章 A型流感病毒通用型人源化抗体F10、H98和H40的构建及体外抗病毒活性鉴定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 流感病毒和细胞 |
| 1.2 常用试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 基因的优化合成和PAC-k-L-H-CH3表达载体的构建 |
| 2.2 血凝抑制(HI)抗体效价检测 |
| 2.3 抗流感病毒中和活性检测 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 抗体的血凝抑制结果 |
| 3.2 抗体抗流感病毒的中和活性 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 结论 |
| 缩略词 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、微量血凝抑制试验操作中常见问题及解决办法（论文参考文献）
- [1]老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究[D]. 杨景. 武汉生物制品研究所, 2021(01)
- [2]抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估[D]. 胡瑞鸿. 东北农业大学, 2020(07)
- [3]新疆某规模化鸡场新城疫抗体的动态监测及免疫程序的优化[D]. 时锋. 石河子大学, 2020(05)
- [4]H5N6禽流感病毒HA基因158位糖基化位点修饰的生物学效应与宿主免疫应答机制[D]. 高如一. 扬州大学, 2020(01)
- [5]无血清规模化培养MDCK细胞的关键控制点研究[D]. 孟子延. 武汉生物制品研究所, 2020(01)
- [6]基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究[D]. 吴娅丽. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]蛋白激酶抑制剂Roscovitine靶向PB2抑制流感病毒复制的作用及其机制[D]. 黄琪. 南方医科大学, 2020(01)
- [8]人源化单克隆抗体药物临床前研发风险管理研究[D]. 刘丹丹. 沈阳药科大学, 2019(02)
- [9]猫细小病毒分离鉴定及其马源特异性抗体F（ab’）2的制备与预防效果评价[D]. 张振江. 广西大学, 2019(01)
- [10]A型流感病毒通用VLPs疫苗的研究与通用抗体的评价[D]. 刘静. 北京协和医学院, 2019(02)