刘玲[1]2012年在《新疆哈萨克族食管癌早期相关基因甲基化分析及功能研究》文中提出目的： DNA甲基化是肿瘤发生的早期分子事件，CpG岛局部甲基化异常早于细胞的恶性增生，因此基因启动子区高甲基化或低甲基化是肿瘤发生早期的一个高度灵敏的肿瘤生物标志物，可通过检测肿瘤相关基因的甲基化状态，为肿瘤的早期诊断、疗效观察及预后判断提供极为重要的信息。新疆哈萨克族食管癌是我区的特高发疾病，基于目前尚无系统的，在肿瘤发生前即可操作的早期预警体系，本课题拟从研究消化道肿瘤早期相关的原癌基因survivin，cdc42与抑癌基因p16，FHIT在哈萨克族食管癌组织中的mRNA差异表达入手，探讨其启动子区CpG岛甲基化状态与基因表达的关系，在此基础上进一步研究基因启动子区甲基化状态的改变对基因表达的调控及对细胞生物学功能的影响，为新疆哈萨克族食管癌早期预警指标体系的建立，早期诊断，治疗和预后提供理论依据。方法：1）哈萨克族食管癌组织中survivin、cdc42、p16和FHIT基因mRNA水平的表达检测：采集新疆哈萨克族食管癌组织及远端无癌组织标本48对，Trizol法提取总RNA，应用半定量RT-PCR技术检测4个消化道肿瘤早期相关基因在食管癌组织及远端无癌组织中的表达；2）哈萨克族食管癌中survivin、cdc42、p16和FHIT基因启动子区CpG岛的甲基化检测：应用Methprimer软件查找survivin、cdc42、p16和FHIT基因启动子区第一个CpG岛，并设计甲基化引物及非甲基化引物，用亚硫酸氢钠修饰基因组DNA之后运用甲基化特异性PCR技术(MSP)检测survivin、cdc42甲基化状态；利用高分辨率熔解曲线技术（HRM）检测p16和FHIT基因启动子区CpG岛甲基化程度，进而探究甲基化状态或程度差异与基因表达的关系；3）survivin及cdc42启动子区CpG岛重组载体的构建及甲基化状态对报告基因CAT活性的影响：重组体的构建：PCR扩增包含survivin、cdc42基因启动子区第一个CpG岛的DNA片段，及任意一段不含CpG岛的random序列，酶切后分组，一组体外甲基化酶修饰，另一组不修饰，分别与酶切的pCAT3-Enhancer载体相连，构建CpG island-pCAT3-Enhancer重组载体，将未甲基化修饰的重组体及pCAT3-Enhancer空载体转化至甲基化酶缺陷的大肠杆菌ER1793（Mcr-、Mrr-）中，将甲基化修饰的重组载体及pCAT3-Enhancer空载体转化至可持续甲基化状态的大肠杆菌JM109中。挑选阳性克隆，测序并检测甲基化程度；重组载体转染至食管癌细胞株Eca109中：将8种载体转染至食管癌细胞株Eca109中，37℃孵育48小时；报告基因氯霉素乙酰基转移酶（CAT）活性的检测：收获细胞，提取CAT基因表达产物，加C~(14)标记的氯霉素后，用薄层层析法测定CAT活性，以此分析survivin，cdc42启动子区CpG岛甲基化对下游CAT活性调控能力的影响，确定基因启动子区甲基化差异对基因表达的影响。结果：1）在48对食管癌组织标本中，癌组织中survivin，cdc42，p16，FHIT阳性表达率分别为87.50%，97.92%，75.00，83.33%，远端无癌组织中阳性表达率分别为58.33%，100.00%，77.08%，85.42%。癌组织与远端无癌组织比较，survivin阳性表达率明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。cdc42，p16，FHIT阳性表达率癌组织与远端无癌组织之间差异无统计学意义（P＞0.05）。survivin mRNA表达水平癌组织明显高于远端无癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。cdc42，p16，FHIT mRNA表达水平癌组织与远端无癌组织差异无统计学意义（P＞0.05）；2）在48例食管癌癌组织中，survivin mRNA的表达与淋巴结转移、临床分期、肿瘤侵犯深度具有相关性（r=0.379、0.488、0.393；P=0.017、0.002、0.019），与分化程度无相关性（P＞0.05）。cdc42mRNA表达与临床分期，肿瘤分化程度具有相关性（r=0.452，r=0.325；P=0.003P=0.034），与淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。p16mRNA表达与临床分期、分化程度、淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。FHITmRNA表达与肿瘤临床分期具有相关性（r=0.338，P=0.035），而与分化程度、淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。3）在20对食管癌标本中，癌组织中70%的survivin基因启动子区CpG岛为杂合型甲基化，远端无癌组织中75%的survivin基因启动子区CpG岛为杂合型甲基化，组织间杂合型甲基化状态无明显差异（P＞0.05）。癌组织中有4例甲基化，其对应的mRNA表达水平均大于远端无癌组织；远端无癌组织中有4例甲基化，其对应的mRNA均未表达；4）在20对食管癌标本中，癌组织中有90%c的dc42启动子区CpG岛呈现出甲基化状态，远端无癌组织中有80%呈现为甲基化状态，组织间甲基化状态无明显差异（P＞0.05）。且cdc42启动子区CpG岛甲基化状态与mRNA水平的表达无相关性；5）在20对食管癌标本中，癌组织及远端无癌组织中p16启动子区CpG岛甲基化例数均为20例，甲基化比例100%。p16启动子区CpG岛甲基化水平在癌组织及远端无癌组织无明显差异（P＞0.05）。p16启动子区CpG岛甲基化水平与食管癌组织TNM分期具相关性（r=0.511，P=0.030），与组织分化，侵润程度，淋巴结转移均无相关性（P＞0.05）。与其mRNA高阳性表达相比，甲基化与mRNA水平的表达无相关性；6）在20对标本中，FHIT启动子区CpG岛呈现低甲基化比例及水平。癌组织及远端无癌组织甲基化比例分别为35.00%和30%。甲基化水平均小于10%，且在癌组织及远端无癌组织无明显差异（P＞0.05），甲基化水平与食管癌组织TNM分期，组织分化，侵润程度，淋巴结转移均无相关性（P＞0.05）。与其mRNA高表达比较，提示低甲基化水平可能未影响基因的表达；7）甲基化及非甲基化的pCAT3-Enhancer载体，转染至食管癌细胞株中，甲基化的载体下游报告基因CAT酶的活性显著低于非甲基化的载体；8）甲基化及非甲基化的Random-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，CAT酶的活性均接近阴性水平；9）甲基化及非甲基化的survivin启动子区CpG岛-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，CAT酶的活性均接近阴性水平；10）甲基化及非甲基化的cdc42启动子区CpG岛-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，甲基化的重组载体CAT酶的活性显著低于非甲基化的重组载体CAT酶的活性。结论：1）哈萨克族食管癌癌组织中survivin mRNA水平表达的增高在哈萨克族食管癌的发生、发展过程中起到了一定的作用。4例远端无癌组织中survivin启动子区CpG岛甲基化对应了mRNA的沉默表达，提示在正常组织中启动子区CpG岛甲基化具备调控基因表达的能力。在食管癌细胞株中，survivin启动子区CpG岛的甲基化及非甲基化均导致了CAT的失活。提示在癌组织或癌细胞中，启动子区CpG岛的甲基化可能与基因表达无直接关系，在癌变过程中可能有更多的机制调控了该基因的表达。2）哈萨克族食管癌中cdc42基因mRNA在癌组织和远端无癌组织中阳性表达率及表达水平无差异，提示该基因可能不是参与食管癌发生发展的主要机制。其启动子区CpG岛甲基化状态的阳性率在癌组织和远端无癌组织中也无差异，且甲基化状态与该基因mRNA水平的表达无关。在食管癌细胞株中，cdc42启动子区CpG岛的甲基化降低了下游报告基因CAT酶的活性，而非甲基化使酶保持较高活性。提示cdc42启动子区CpG岛甲基化本身具有调控基因表达的能力，而在哈萨克族食管癌中其启动子区CpG岛甲基化与基因表达无直接关系，说明在癌变过程中可能存在更多的调控机制参与了该基因的表达；3）哈萨克族食管癌中p16mRNA在癌组织和远端无癌组织中均为高表达，p16启动子区CpG岛甲基化比例高达100%，提示p16可能未参与哈萨克族食管癌的发生发展，且甲基化可能不是调控该基因表达的主要分子机制。4）哈萨克族食管癌中，FHIT mRNA在癌组织及远端无癌组织中表达无差异，其启动子区CpG岛甲基化比例及程度均较低，提示FHIT可能未参与哈萨克族食管癌的发生发展，同时低甲基化水平可能未影响FHIT基因的表达。
杜嘉慧[2]2005年在《食管鳞状细胞癌中FHIT基因的表达异常及与吸烟关系的研究》文中指出目的 FHIT基因是Ohta等于1996年利用外显子捕获方法首次发现的一个新的人类基因,该基因跨越人类染色体脆弱位点FRA3B,并含有编码组氨酸三联体的功能区,是一个与食管癌等大多数肿瘤相关的候选抑癌基因。在食管癌、胃癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和宫颈癌等多种原发性肿瘤和肿瘤细胞系中频繁发现FHIT基因异常,包括FHIT转录本异常、FHIT位点等位基因缺失和FHIT基因蛋白表达下调或缺乏等。本研究通过检测食管鳞状细胞癌组织中FHIT蛋白的表达水平,确定食管癌组织中是否有FHIT基因的表达下降,来探讨FHIT基因在食管鳞状细胞癌及正常食管组织中的表达及意义,吸烟与FHIT基因异常的关系,了解食管癌的发生机制及吸烟致癌的分子靶点,为食管癌的早期诊断、预防及基因治疗提供理论依据。 方法 随机选择46例临床确诊为食管癌且进行手术治疗的患者,术中采集食管癌及正常食管组织标本,用10%的福尔马林固定。对每一例病人临床资料进行详细记录包括术前详细吸烟情况、术后病理特征。应用免疫组织化学S-P法对食管鳞状细胞组织和正常食管组织进行FHIT基因的表达水平检测,分析FHIT基因表达与临床病理特征、临床病理分期、细胞分化程度、淋巴结转移及吸烟史的关系。 结果 (1) FHIT基因蛋白在食管癌组织中的表达水平明显低于正常食管组织(P<0.05)。 (2) FHIT基因蛋白在吸烟组食管癌组织中的表达明显低于非吸烟组食管
吴孔明[3]1999年在《食管癌组织中肿瘤相关基因的缺失和表达异常》文中研究指明食管癌是常见的消化道肿瘤之一，我国食管癌发病率更高，占全世界患者的50％以上。研究表明，多种肿瘤抑制基因突变、丢失及表达异常与食管癌的发生、发展有关，并在一定程度反映食管癌的恶性进展行为，但食管粘膜癌变的确切机理不清楚。因此，明确已知肿瘤相关基因在食管癌发生过程中的作用及进一步分离、克隆新的食管癌相关基因，对于食管癌的基础理论研究及临床应用均具有重大意义。 1．微卫星DNA异常与基因表达 采用PCR银染技术，在36例高发区食管癌组织中检测与抑癌基因p53、p16、Rb、DCC、APC、FHIT、PTEN，修复基因hMLH_1、hMSH_2及食管癌组织中表达下调基因Mal、SPRR3相关的25个微卫星多态标记杂合丢失(LOH)及不稳定性(MSI)，同时进行p53、p16、Rb蛋白的免疫组织化学分析。研究结果如下： 1) 食管癌组织微卫星DNA异常较普遍，69％的病例有6个位点以上有改变。D1S484(1q21)、D3S1255(3p24-25)、D9S162(9p21)、D9S171(9p21)、IFNa(9p21)、D13S170(13q14)和D17S261(17p13)位点较高频率LOH(＞25％)。D1S484(1q21)、D2S112(2q14)、D3S1317(3p26)位点较高频率MSI(＞20％)。临床分期越晚，微卫星异常的频率越高：低分化癌组织高于中、高分化癌；有淋巴结转移者，微卫星异常的频率高于无淋巴结转移者。 2) D17S261LOH者，p53表达增加；D13S170LOH者，Rb蛋白表达减少，两者均与临床病理分期、淋巴结转移无关。 3) 9p21位点高频率LOH，多同时伴有p16蛋白表达丧失，两者均与淋巴结转移成正相关。 4) C13-771与修复基因hMLH1连锁，当该位点异常(LOH+MSI)时，微卫星不稳定性的频率增加。 5) 与PTEN连锁的2个位点D10S541、D10S2491异常的频率较低，提
张慧霞[4]2017年在《叶酸对MNNG诱导的哈族食管上皮细胞恶变的干预作用及表观遗传学机制研究》文中进行了进一步梳理目的:1)构建哈族食管上皮DNA甲基化转移酶1(DNMT1)高表达细胞株模型,为今后食管癌发生机制研究提供重要的研究工具;2)探讨DNMT1高表达在N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)致哈族食管上皮细胞恶性转化中的作用,并构建哈族食管上皮DNMT1高表达细胞的恶性转化细胞模型,为今后深入探讨食管癌发生机制提供稳定的、简单易行的实验操作方法和研究工具;3)探讨叶酸在M N N G致哈族食管上皮细胞恶性转化中的干预作用和表观遗传学机制以及Wnt/β-catenin信号转导通路调控机制中的作用,为哈族食管癌的防治提供理论依据。方法:1)采用TALE技术将构建的p XanthoT M V.b a s i c.p u r o-W V 0 1 3 3、p XanthoTMV.basic.puro-WV0132和p XanthoTMV.basic.puro-WV072质粒转染至哈族食管上皮细胞,并利用嘌呤霉素对DNMT1高表达细胞进行筛选,通过荧光显微镜、RT-PCR和Western blot法检测细胞转染情况和目的基因DNMT1的表达情况;2)采用MTT法和克隆形成实验确定MNNG的恶性转化剂量;采用隔代染毒,每次染毒1小时的方法对细胞进行染毒,之后取不同代次细胞行软琼脂集落形成实验,观察不同染毒次数和传代次数的细胞集落形成情况,并克隆扩大培养哈族食管上皮细胞-zhz(恶性转化细胞);裸鼠成瘤实验选用SPF级BALB/c-nu裸鼠24只,按照随机化原则分为3组,即对照组(生理盐水组),哈族食管上皮DNMT1高表达细胞组和哈族食管上皮DNMT1高表达细胞转化细胞组(哈族食管上皮细胞-zhz),每组8只,调整细胞浓度为1×106个/m L,按0.2m L/只的剂量接种于裸鼠靠近右侧背部皮下,4周后观察哈族食管上皮DNMT1高表达细胞及其转化细胞(哈族食管上皮细胞-zhz)恶变程度,并进行组织病理学检测;3)采用高效液相色谱法(HPLC)测定基因组DNA整体甲基化水平改变;采用甲基化特异性PCR(MSP)法、RT-PCR和Western Blot法检测叶酸代谢相关基因(MTHFR和CBS)、DNA修复基因(MGMT)和肿瘤相关基因(P16、RASSF1A和FHIT)等6个基因甲基化状态、m RNA和蛋白表达水平改变;4)采用RT-PCR及Western Blot法检测Wnt/β-catenin信号转导通路中关键因子(β-catenin、APC和TCF)mRNA及蛋白表达水平改变。结果:1)pXanthoTMV.basic.puro-WV0133和pXanthoTMV.basic.puro-WV0132质粒转染组细胞DNMT1 mRNA表达水平是正常细胞组的1.786倍和2.721倍,dnmt1蛋白表达水平是正常细胞组的2.734倍和3.100倍;其中,pxanthotmv.basic.puro-wv0132质粒转染组细胞dnmt1mrna和蛋白表达水平较高;2)随着mnng染毒次数和细胞传代次数的增加,细胞形态趋向不规则形,接触抑制逐渐消失,耐受性逐渐增强,生长速度逐渐增加。染毒14次第27代的哈族食管上皮dnmt1高表达细胞在软琼脂上出现细胞集落,中央凸起,由多层细胞组成,而哈族食管上皮细胞未出现阳性结果,细胞固缩死亡。接种哈族食管上皮转化细胞-zhz的裸鼠出现肿瘤包块,经组织病理学鉴定为鳞癌;3)在终浓度为1.500×10-5mol/lmnng致癌物的长期暴露之下,(1)随着叶酸浓度的增加,哈族食管上皮细胞和dnmt1高表达细胞dna整体甲基化水平逐渐升高(p<0.01)和dnmt1酶活性逐渐降低(p<0.01);随着作用时间的延长,哈族食管上皮细胞和dnmt1高表达细胞dna整体甲基化水平逐渐降低(p<0.01),dnmt1酶活性逐渐升高(p<0.01);在相同条件下,晚期阶段的哈族食管上皮细胞dna整体甲基化水平高于哈族食管上皮dnmt1高表达细胞组,差异有统计学意义(t早=0.696,p=0.494;t中=0.605,p=0.551;t晚=2.746,p=0.012);(2)叶酸浓度的增加对哈族食管上皮细胞和dnmt1高表达细胞mthfr、rassf1a和fhit(除哈族食管上皮细胞外)基因甲基化状态有影响,表现为在叶酸高浓度剂量时,mthfr、rassf1a和fhit甲基化出现逆转现象,而对cbs、mgmt和p16基因甲基化状态无影响;(3)随着叶酸浓度的增加,哈族食管上皮细胞和dnmt1高表达细胞mthfr、cbs、mgmt、p16、rassf1a和fhit基因mrna和蛋白表达水平逐渐增加(p<0.01);随着作用时间的延长,细胞mthfr、cbs、mgmt、p16、rassf1a和fhit基因mrna和蛋白表达水平逐渐降低(p<0.01);在相同条件下,哈族食管上皮细胞mthfr、cbs、mgmt、p16、rassf1a和fhit基因mrna和蛋白表达整体上高于哈族食管上皮dnmt1高表达细胞(p<0.01);4)随着叶酸浓度的增加,哈族食管上皮细胞和dnmt1高表达细胞wnt/β-catenin信号转导通路中关键因子β-catenin和tcf基因mrna和蛋白表达水平逐渐降低,apc基因逐渐增加,呈现出浓度依赖关系;随着干预时间的延长,各叶酸浓度组细胞β-catenin和tcf基因mrna和蛋白表达水平均逐渐增加趋势,apc基因逐渐降低,呈现出时间依赖关系;在相同条件下,哈族食管上皮细胞β-catenin和tcfmrna和蛋白表达水平低于哈族食管上皮dnmt1高表达细胞,apc基因mrna和蛋白表达水平高于哈族食管上皮dnmt1高表达细胞。结论:1)采用tale技术成功构建了哈族食管dnmt1高表达细胞株模型,为今后致癌机制研究提供了重要的研究工具;2)成功构建了哈族食管上皮dnmt1高表达细胞的恶性转化细胞模型,dnmt1高表达对细胞的恶性转化起到促进作用,可使细胞发生恶性转化的时间缩短;3)与哈族食管上皮细胞相比,哈族食管上皮dnmt1高表达细胞更易受到mnng和低剂量叶酸的损害作用影响,提示高浓度叶酸可降低MNNG对细胞的损伤,可逆转表观遗传学指标的改变,对细胞的不良反应起到一定的拮抗作用;4)充足的叶酸可抑制MNNG对细胞Wnt/β-catenin信号转导通路的活化,从而达到抑制细胞不良反应的作用。
杨森[5]2016年在《miR-183和miR-218参与调控食管癌发生发展的机制研究》文中研究指明研究背景与目的食管癌是常见的消化道恶性肿瘤,我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家之一。在中国食管癌的病理类型以鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)为主。阐释食管癌发生发展的分子机制,开发和改进食管癌的筛查和早期诊断技术,是降低食管癌发病率和死亡率的关键。本研究在miRNA芯片高通量筛选结合生物信息学分析的基础上遴选食管癌发生发展相关的候选miRNA,进一步扩大样本量,利用荧光定量RT-PCR技术验证并建立食管癌miRNA差异表达谱。在差异表达的miRNAs中选取反复验证的miR-183和miR-218进行后续的功能研究,探索miR-183和miR-218在食管癌细胞中的生物学作用,通过识别和验证其下游靶基因,初步探讨miR-183和miR-218影响食管癌细胞生长、增殖、凋亡等生物学行为的分子机制。同时针对miR-218在食管癌中的异常表达,进行初步的机制研究,为阐明食管癌的发病机理、发现候选生物标志提供线索。研究方法1.在针对食管癌相关环境危险因素的流行病学问卷调查的基础上,招募138例未接受放化疗的原发食管鳞状细胞癌患者,收集其癌组织及癌旁组织。送检3对食管鳞状细胞癌患者癌组织和配对癌旁组织,应用Agilent miRNA表达谱芯片技术筛选差异表达的miRNA.采用荧光定量RT-PCR技术在扩大样本人群中对筛选出的差异表达miRNA进行验证,构建食管癌miRNA差异表达谱。根据候选miRNA的表达水平,连锁分析miRNA的异常表达与食管癌发病风险之间的关系。根据环境危险因素调查结果,探讨候选miRNA表达水平与食管癌患者吸烟、饮酒、饮水之间的相关性。2.利用1niR-183 mimic 和 inhibitor分别转染食管癌细胞EC9706构建miR-183过表达及表达缺失的细胞模型,采用荧光定量RT-PCR方法检测转染后细胞miR-183的表达情况,确定转染效率。在此基础上分析miR-183对食管癌细胞生物学功能的影响,包括EdU法检测细胞生长增殖、Annexin-V FITC&PI双染法检测细胞凋亡、流式细胞术检测细胞周期分布、以及Transwell法检测细胞侵袭能力。利用靶基因预测软件和nRNA表达谱芯片共同预测miR-183靶基因,通过累积分布函数方法分析生物信息学预测得到的靶基因与非靶基因在芯片中表达水平的差异。荧光定量RT-PCR和Western blot方法验证miR-183在mRNA水平和蛋白水平对候选靶基因PDCD4的调控作用,并分析miR-183和PDCD4 mRNA在人群样本中表达水平的关联性。构建野生型和突变型PDCD43'UTR重组载体,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-183与PDCD4的靶向调控关系。进一步分别构建包含3’UTR和3’UTR缺失的表达载体pcDNA3.1-PDCD4,通过基因回复实验(DCD4 restore)分析miR-183通过影响PDCD4的生物学活性对食管癌细胞凋亡产生的调控作用,在功能层面验证miR-183和PDCD4的靶向调控关系。3.利用甲基化在线预测软件分析miR-218编码基因启动子区潜在的CpG位点。根据预测目的区域的DNA序列,分别采用亚硫酸盐测序(BSP)和巢式甲基化特异性PCR(n-MSP)检测两株食管癌细胞EC9706和EC109中miR-218启动子区CpG岛甲基化状态。利用去甲基化剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)分别处理食管癌细胞株EC9706和EC109,分析去甲基化处理后miR-218表达水平的恢复情况；进一步在癌组织和癌旁组织中用n-MS P分析miR-218表达水平与其甲基化状态之间的关系。荧光定量RT-PCR检测miR-218与宿主基因SLIT2、SLIT3表达水平的相关性,分析miR-218与宿主基因的共调控关系。利用miR-218 mimic转染食管癌细胞EC109构建miR-218过表达细胞模型,荧光定量PCR检测转染效率确定过表达模型构建成功的基础上,进一步分析miR-218对食管癌细胞生物学功能的影响。同时利用生物信息学方法预测miR-218靶基因,荧光定量RT-PCR和Western blot检测miR-218对靶基因ROBO1在mRNA水平和蛋白水平的调控,构建野生型和突变型ROBO1 3'UTR重组载体采用双荧光素酶报告基因实验进行靶基因鉴定。进一步分别构建包含3'UTR和3’UTR缺失的表达载体pcDNA3.1-ROBO1,通过基因回复实验(ROBO1 restore)分析miR-218通过影响ROBO1的生物学活性从而对细胞增殖能力的调控作用,在功能层面验证miR-218和ROBO1的靶向调控关系。4.招募食管癌患者和1：1匹配的健康对照血浆样本79对。应用实时荧光RT-PCR方法分别检测组织中差异表达的miR-183和miR-218在血浆中的表达水平。同时利用单因素logistic回归分析miR-183和miR-218在血浆中的表达水平与食管癌发病风险间的关系,通过ROC曲线分析评估血浆niR-183 和 miR-218在食管癌中的诊断价值。主要研究结果1.食管癌组织nicroRNA差异表达谱的筛选利用Agilent miRNA表达谱芯片筛选出15个食管癌组织中差异表达的miRNA,其中食管癌组织中表达上调的miRNA7个,下调的miRNA8个。利用荧光定量RT-PCR在扩大的人群组织样本中验证后,确认7个食管癌相关差异表达miRNA与芯片结果一致(miR-139-5p, miR-218, miR-338-3p, miR-21-3p, miR-574-5p, miR-183, miR-601),证实了芯片数据的可靠性。其中,miR-183在食管癌组织中高表达,miR-218在食管癌组织中低表达。通过单因素logistic回归分析发现其中niR-139-5p和miR-338-3 p的低表达,以及miR-21-3p、miR-574-5p、miR-183 和 miR-601的高表达与食管癌发病风险的增加显著相关,进一步利用多因素logistic回归分析发现miR-139-5p、miR-338-3p、 miR-574-5p和miR-601的异常表达增加了食管癌的发病风险,其中结合环境危险因素分析发现miR-21-3p的表达水平与饮酒量相关。2.miR-183调控食管癌发生发展的机制研究2.1 miR-183在食管癌细胞EC9706中功能研究分别应用]niR-183 mimic 和 inhibitor转染食管癌细胞EC9706 48h后,与对照组相比,mimic转染组miR-183的表达水平显著升高(p<0.001),inhibitor转染组miR-183的表达水平显著降低(p<0.001),明确转染成功后进行后续的细胞生物学功能实验。细胞凋亡结果显示,miR-183 mimic转染组早期凋亡率明显低于对照组(3.31±1.20 vs.7.43+1.01,p<0.001),晚期凋亡率亦显著低于对照组(5.83±0.29 vs.8.77±1.59,p<0.01)。而miR-183 inhibitor转染组早期凋亡率高于对照组(12.39±1.89 vs.6.56±1.87,p<0.001),晚期凋亡率也高于对照组(9.53士1.58 vs.7.36±2.42,p<0.05)。EdU法检测细胞增殖能力结果显示miR-183 mimic转染组中处于增殖期的细胞比例显著高于对照组p<0.05)。细胞周期结果显示转染miR-183 mimic细胞与对照组相比G1期比例显著下降(54.87±1.135vs.56.89±0.82,p<0.05)。2.2 miR-183在食管癌细胞EC9706中靶基因的识别与验证应用mRNA表达谱芯片在miR-183过表达EC9706细胞和对照组细胞中筛选候选靶基因。mRNA表达谱芯片共筛选出表达上调基因100个,下调基因83个,其中下调倍数前五位基因是：HLA-DRB5、ITGB1、MICB、PSEN2、PDCD4。对下调基因进行GO聚类和KEGG pathway分析。结果发现差异基因主要富集在细胞周期蛋白依赖性激酶调控信号通路上,并与多个肿瘤相关信号通路相关。基于芯片筛选结果,分别针对miRNA靶基因预测数据库TargetScan预测出的靶基因与非靶基因在芯片中的表达水平进行累积分布函数分析,结果发现TargetScan预测到的靶基因表达水平明显低于非靶基因(p<0.001)。结合miRNA靶基因预测数据库TargetScan和 miRDB,进一步分析并确认PDCD4为候选靶基因。荧光定量RT-PCR和Western blot结果发现miR-183主要抑制了PDCD4的蛋白质翻译过程。双荧光素酶报告基因结果显示,共转染miR-183 mimic和野生型PDCD4 3'UTR时,细胞荧光素酶活性被显著抑制,约为NC和突变型载体共转染组的47%(p<0.01),从而证实miR-183与PDCD4 3'UTR有直接靶向结合关系。通过相关性分析发现miR-183与PDCD4 mRNA的表达水平在食管癌组织中呈负相关关系(r=-0,189,p<0.05)。PDCD4 restore结果发现,分别转染包含3'UTR或3’UTR缺失的PDCD4表达载体时,细胞的凋亡率无显著性差异,而共转染包含3'UTR PDCD4载体和miR-183mimic时,细胞凋亡明显低于其他各组(p<0.01)。3. miR-218调控食管癌发生发展的机制研究3.1 miR-218 CpG岛甲基化状态检测应用CpG island searcher (http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx)分析miR-218编码基因(miR-218-K miR-218-2)启动子区CpG岛覆盖情况,结果发现编码基因miR-218-1转录起始位点TSS上游-760到一212处,编码基因]miR-218-2TSS的-407到+117处均为CpG岛富集区域。针对此区域DNA序列设计引物,采用BSP和n-MSP检测食管癌细胞株EC109和EC9706 CpG岛甲基化水平,发现miR-218-1和niR-218-2区域均呈现高甲基化水平。采用5-Aza-CdR去甲基化处理两株食管癌细胞EC109、EC9706和一株人正常食管上皮Het-1A,结果发现处理后细胞miR-218的表达水平升高,而Het-1A中miR-218表达无明显改变。利用n-MSP检测食管组织中miR-218-1和miR-218-2的甲基化水平,发现miR-218-1在癌组织中甲基化率(34/42)显著高于癌旁组织(14/42)p<0.05),但miR-218-2甲基化率在癌组织和癌旁组织中无显著差异。分别将组织样本按照miR-218-1 和 miR-218-2的甲基化水平将其分为甲基化组和非甲基化组,与miR-218的表达水平进行关联分析,结果显示miR-218-1甲基化组中miR-218的表达水平显著低于非甲基化组；而对于miR-218-2而言,其甲基化与否和miR-218的表达水平无显著相关性。荧光定量RT-PCR检测组织样本中miR-218、SLIT2、SLIT3的表达水平,结果显示,SLIT2在癌组织中表达水平为癌旁组织的38.5%(p<0.01),但SLIT3在癌组织和癌旁组织中的表达差异无统计学意义,而宿主基因SLIT2和SLIT3与miR-218的表达均显著相关(p<0.001),提示miR-218与宿主基因可能共转录。3.2 miR-218在食管癌细胞EC109中功能研究miR-218 mimic转染食管癌细胞EC109 48h后,与对照组相比,miR-218的相对表达水平显著升高(p<0.001)。EdU结果显示miR-218 mimic转染组中细胞增殖能力(53.45±1.20)%明显低于阴性对照组(73.61+3.21)%(p<0.001)。细胞周期结果显示miR-218mimic转染组的Gl期细胞比例增加(p<0.01),G2期减少(p<0.01),S期无明显变化。但]miR-218 mimic对细胞凋亡的改变并不明显。3.3 miR-218在食管癌细胞EC109中靶基因的识别与验证挑选靶基因预测数据库TargetScan、miRDB 和 Pictar 3个数据库均预测到的ROBO1为候选靶基因。荧光定量PCR和Western blot发现在mRNA和蛋白水平miR-218均能调控ROBO1的表达。双荧光素酶报告基因结果显示miR-218与野生型ROBO1 3'UTR共转染组荧光素酶活性与其他各组相比显著降低,是阴性对照与突变型ROBO1 3'UTR共转染组的55.7% (p<0.001)。相关性分析揭示了人群样本中miR-218与ROBO1 mRNA的表达负性相关(r=-0.258,p< 0.05)。ROBO1 restore结果表明,与对照组相比,包含3'UTR的ROBO1表达载体和1miR-218 mimic共转染时,细胞的增殖能力明显低于其他各组(p<0.01)。4.miR-183和miR-218在食管癌筛检中的诊断价值研究荧光定量RT-PCR结果显示,与健康对照比较,食管癌患者血浆中miR-183的表达水平明显增加(p<0.05),而miR-218的表达显著降低(p< 0.001). Logistic回归分析发现血浆中miR-218的低表达与食管癌发病风险的增加有关(OR=0.787,0=0.685-0.903)p<0.001)。ROC曲线评估血浆miR-218诊断食管癌的AUC为0.651(p=0.001)。初步研究结论1.本研究在食管癌组织和癌旁组织中共筛选分析得到7个差异表达的miRNA,其中3个miRNA表达上调,4个miRNA表达下调。miR-183在食管癌组织中显著高表达,miR-218在食管癌组织中显著低表达。2.增加食管癌细胞EC9706中miR-183的表达水平可诱导EC9706的增殖能力,抑制细胞凋亡,缩短G1期比例。miR-183通过作用于其靶基因PDCD4的3’UTR区域参与调控食管癌细胞的凋亡过程。3.miR-218在食管癌中的低表达与miR-218的编码基因miR-218-1启动子区CpG岛异常高甲基化有关。增加食管癌细胞EC109中miR-218的表达可有效抑制EC109的细胞增殖能力,阻滞细胞周期于G1期。miR-218通过作用于其靶基因ROBO1 3'UTR区域参与调控食管癌细胞的增殖。4.血浆中miR-218和miR-183的表达水平与组织中的趋势一致,其中miR-218在食管癌患者血浆中表达显著低于健康对照者,而miR-183在食管癌患者中表达显著高于健康者对照。根据血浆miR-218的表达水平,可以有效的区分食管癌患者和健康对照者,是食管癌潜在的诊断生物标志,可对现有食管癌早期诊断方法进行有效补充。
赵燕[6]2011年在《哈、汉民族食管癌抑癌基因DNA异常甲基化及其与预后关系的研究》文中研究说明目的：探讨新疆哈萨克族、汉族食管癌(Esophageal Carcinoma,EC)患者p16基因和FHIT基因的甲基化状态与食管癌发生的关系,并分析其与哈、汉民族食管癌患者预后的关系。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR,MSP)的方法,检测哈、汉民族共71例食管癌患者的p16基因和FHIT基因的甲基化状态,并分析年龄、性别、淋巴结转移、分化程度、及临床病理分期等因素与预后的关系。结果：36例哈族食管癌患者中癌组织、癌旁组织p16基因甲基化率分别为：44.4%、13.9%;FHIT基因甲基化率分别为：58.3%、19.4%。35例汉族食管癌患者中癌组织、癌旁组织p16基因甲基化率分别为：42.9%、14.3%；FHIT基因甲基化率分别为：51.4%、14.3%。哈、汉民族食管癌患者中癌组织和癌旁组织的p16基因的甲基化率差异有统计学意义(χ2=7.360,P0.007；χ2=7.000,P=-0.008)；FHIT基因的甲基化率差异也有统计学意义(χ2=11.455,P=0.001；χ2=10.944,P=0.001).而哈、汉民族之间的癌组织、癌旁组织p16基因甲基化率差异无统计学意义(χ2=0.018,P=0.893；χ2=0.002,P=0.962)；FHlT基因的甲基化率差异也无统计学意义(χ2=0.342,P=0.559；χ2=0.336,P=0.562).哈、汉民族的多因素生存预后分析,结果表明肿瘤浸润程度、病理分期、淋巴结转移区域数是食管癌预后的独立影响危险因素；性别是食管癌预后的保护因素。结论：新疆哈、汉民族食管癌患者中p16基因和FHIT基因甲基化与食管癌的发生有密切的关系。
郑峰[7]2013年在《抗原呈递元件基因甲基化对哈萨克族食管鳞癌发生的作用研究》文中研究指明目的：食管癌是较常见的恶性肿瘤之一，我国食管癌的发病率和死亡率居世界第一，每年约有16～20万人死于此病。新疆是食管癌高发区之一，其中哈萨克族发病率最高，比其他少数民族高2～3倍，病死率在全国少数民族中占第一位。食管癌作为新疆的常见病和多发病，已严重影响了本地区各族人民的身体健康。哈萨克族生活习惯及居住环境特殊，是较好的研究人群。利用新疆哈萨克族食管癌疾病资源，开展食管癌的基础研究，建立肿瘤分子标志物体系，结合临床研究来明确食管癌发病原因，对于新疆食管癌的预防、诊断及临床治疗具有重大意义。食管癌的病因复杂，目前普遍认为食管癌是多因素作用、多基因参与、多阶段发展的疾病，然而其发生和发展的确切机制仍不太清楚。在对哈萨克族食管癌高发区流行病学调查工作中，发现哈萨克族食管癌具有家族聚集现象，并且遗传免疫因素在食管癌的发生中起着一定的作用。大量研究表明，人类白细胞抗原Ⅰ类分子(human leukocyte antigenclass Ⅰ，HLA-Ⅰ)表达低下或缺失，可导致肿瘤细胞逃逸宿主免疫监视，从而与肿瘤发生密切相关。HLA-Ⅰ类分子是机体免疫应答信息产生和传递的基础，主要功能是将细胞内源性抗原肽呈递到细胞表面，实现CD8+T细胞对自身抗原的识别和免疫监视。而此内源性抗原肽呈递过程必须在抗原呈递元件(antigen processing machinery，APM)的协助下才能完成。APM成员蛋白是一组抗原呈递相关蛋白，负责协助HLA-Ⅰ类分子组装、负载和提呈内源性抗原肽，介导抗肿瘤的T细胞免疫功能。APM成员蛋白表达下调可影响正常的抗原呈递过程，使肿瘤逃避免疫监视而增加肿瘤发生和发展的风险。DNA甲基化是肿瘤表观遗传学调控的一个重要方式，肿瘤细胞基因组整体水平低甲基化和启动子区高甲基化是已被公认的肿瘤表观遗传性机制。APM基因启动子区的异常甲基化可引发基因表达沉默，导致功能蛋白的表达下调或缺失，从而促进肿瘤的发生和发展，在宫颈癌、膀胱癌、头、颈部肿瘤中已有报道，但有关食管癌的研究很少。本研究拟从表观遗传学角度，以HLA-Ⅰ和APM成员基因为候选基因，利用新疆哈萨克族食管癌病变资源，从基因表达调控层次，分析APM成员基因启动子区异常甲基化与哈萨克族食管鳞癌发生之间的关系。方法：(1)采用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfate sequeneing PCR，BSP)法检测人食管鳞癌ECa109细胞DNA中基因启动子区甲基化位点。利用在线数据库提供的人类基因组计划资源，对HLA-B、TAP1、TAP2、LMP2、LMP7、ERAP1，Tapasin和ERp57等8种基因启动子区设计特异性PCR引物，经基因启动子区目的CpG岛片段的PCR扩增、克隆和测序，获得基因启动子区甲基化相关的序列和CpG位点信息。(2)收集新鲜哈萨克族食管癌及癌旁正常食管组织标本50例，提取组织DNA。选取前一步研究中筛选出来的HLA-B、TAP2、LMP7、Tapasin和ERp57等5种基因，利用MassARRAY甲基化检测技术，对候选基因启动子区CpG岛甲基化水平进行定量分析，明确食管癌和癌旁正常组织中总体及单个CpG位点甲基化水平的差异。(3)采用免疫组织化学SP法，检测LMP7、Tapasin、ERp57和HLA-Ⅰ蛋白在食管癌组织中的表达水平。使用SPSS16.0统计分析软件包对数据进行处理，采用非参数秩和检验分析以上4种蛋白表达水平与食管癌患者临床病理特征的关系。采用Spearman等级相关分析检验LMP7、Tapasin、ERp57与HLA-Ⅰ蛋白表达水平的相关性，采用方差分析检验LMP7、Tapasin、ERp57基因甲基化和蛋白表达水平的关系。P值取双侧，以a=0.05为临界值。结果：(1)在人食管鳞癌ECa109细胞DNA中，HLA-B、TAP2、LMP7、Tapasin和ERp57等5种基因启动子区的目的CpG岛均发生了不同程度的甲基化，发生甲基化的CpG位点占所有CpG位点的比例分别为10/14、8/8、2/22、5/12和18/18。而TAP1、LMP2、ERAP1等3种基因启动子区没有发现甲基化位点。(2)根据MassARRAY技术对50例哈萨克族食管癌及癌旁正常组织中的甲基化定量检测结果，发现LMP7、Tapasin和ERp57基因在食管癌中的甲基化水平高于癌旁组织(P＜0.05)，HLA-B和TAP2基因在食管癌和癌旁组织中的甲基化水平无差异(P＞0.05)。进行单个CpG位点甲基化水平分析显示：LMP7基因启动子区CpG_5、CpG_9、CpG_20、CpG_21、CpG_22位点；Tapasin基因启动子区CpG_1、CpG_6位点；ERp57基因启动子区CpG_1位点的甲基化水平在食管癌和癌旁正常组织之间存在统计学差异(P＜0.05)。对3种基因甲基化水平与肿瘤临床病理特征进行分析，发现LMP7和ERp57基因甲基化与食管癌患者TNM分期有关，Ⅰ期+ⅠⅠ期组的甲基化水平高于ⅠⅠⅠ期+ⅠV期组；LMP7、ERp57基因甲基化与肿瘤分化程度有关，中、低分化组的甲基化水平高于高分化组；ERp57基因甲基化与肿瘤的血管侵袭性有关，侵袭血管生长组的甲基化水平高于不侵袭血管生长组，以上差异均有统计学意义(P＜0.05)。(3)免疫组化结果显示：食管癌组织中HLA-Ⅰ、Tapasin、LMP7和Erp57蛋白均有明显的表达下调或缺失，与癌旁正常组织相比有统计学意义(P＜0.05)。HLA-Ⅰ蛋白表达下调与肿瘤分化程度、肿瘤侵润深度密切相关；LMP7蛋白表达下调与肿瘤分化程度、肿瘤侵润深度、肿瘤血管侵袭性生长、淋巴结转移、TNM分期密切相关；Tapasin蛋白表达下调与肿瘤分化程度、肿瘤侵润深度密切相关；ERp57蛋白表达下调与淋巴结转移、肿瘤血管侵袭性生长、肿瘤侵润深度、TNM分期密切相关，以上差异均有统计学意义(P＜0.05)。在食管癌组织中，HLA-Ⅰ与LMP7、Tapasin、ERp57蛋白表达水平呈正相关(r值分别为0.823、0.721、0.378，P值均＜0.05)。LMP7、ERp57基因在不同甲基化水平之间的蛋白表达水平差异有统计学意义(P＜0.05)，随着基因启动子区甲基化水平的增高，相应蛋白的表达水平降低。而Tapasin基因在不同甲基化水平食管癌组织中的蛋白表达水平没有统计学差异(P＞0.05)。结论：(1)在人食管鳞癌ECa109细胞中，HLA-B、TAP2、LMP7、Tapasin和ERp57等5种基因启动子区的CpG岛均发生了不同程度的CpG位点甲基化，可能是导致人食管鳞状上皮细胞癌变的重要原因。(2)在新疆哈萨克族食管癌组织标本中，LMP7、Tapasin和ERp57基因甲基化水平异常增高，并与肿瘤的临床病理特征密切相关，是导致哈萨克族食管癌发生的高危因素。LMP7基因启动子区的CpG_5、CpG_9、CpG_20、CpG_21、CpG_22位点；Tapasin基因启动子区的CpG_1、CpG_6位点；ERp57基因启动子区的CpG_1位点与基因的甲基化密切相关，可能是调控相应基因启动子区甲基化的关键位点。(3)在新疆哈萨克族食管癌组织标本中，HLA-Ⅰ、LMP7、Tapasin和Erp57蛋白出现明显的表达下调和缺失，并与食管癌的临床病理特征密切相关，说明HLA-Ⅰ及APM成员蛋白协同参与了食管鳞状上皮的免疫应答，可以防止食管癌的发生，对机体有保护作用。APM成员LMP7、ERp57基因启动子区甲基化，可以抑制基因蛋白表达，影响HLA-Ⅰ分子的组装和呈递，造成HLA-Ⅰ在肿瘤细胞表面的下调或缺失，使肿瘤细胞逃避了机体的免疫监视和杀伤，导致了肿瘤的发生，可能是新疆哈萨克族食管癌发生的表观遗传学机制。
杨壹羚[8]2005年在《重复多色荧光原位杂交技术的建立及其在食管癌中的应用》文中提出目的:染色体畸变包括数目和结构改变,是肿瘤发生的重要事件。由于技术原因,迄今报道食管癌染色体畸变的资料很少。本研究旨在建立重复多色荧光原位杂交技术(Repetitive multicolourfluorescence in situ hybridization,RM-FISH)及原发性食管癌染色体直接制备方法,并以食管癌细胞系RM-FISH分析为出发点,对食管癌染色体畸变进行初步探讨。同时,为食管癌及其它实体肿瘤的染色体研究提供新的技术平台。 方法:采用六色荧光原位杂交技术与重复杂交策略相结合的方法,建立重复多色荧光原位杂交技术:该技术将24条特异性的染色体(22条常染色体和2条性染色体)涂染探针,分别用Cy3、Cy5、FITC三种荧光素直接标记,组合制备四组六色的探针池,对同一染色体片先后进行四次杂交,探针及4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)信号通过装备了相应滤镜及CCD相机的荧光显微镜捕获,图像的摄取及转化为数字格式存储的过程应用Metamorph Imaging System软件;运用RM-FISH技术对三个食管癌细胞系KYSE410-4、KYSE410-1、EC9706进行全染色体组畸变分析,根据ISCN1995标准鉴定核型及一致性的改变;同时以15例手术切除的食管癌新鲜组织为材料,建立原发性食管癌染色体直接制备的方法。 结果:1) 在常规FISH技术的基础上建立了重复多色荧光原位杂交方法。2) 对食管鳞癌细胞系KYSE 410-4、KYSE 410-1及EC9706进行了RM-FISH分析,结合反相DAPI显带完成了核型的鉴定,发现了众多染色体畸变。这些异常包括缺失、易位、插入和标记染色体等,平均每个细胞系有26.7处改变.发生改变最多的染色体是1号、5号和11号;在三个细胞系中均检测到3号染色体短臂缺失和长臂增益及Y染色体的丢失;在KYSE 410-4和-1中发现了3号染色体长臂的等臂现象;在所有检测到的48个易位中,5号和9号染色体发生频率(10/48)最高,另外还检测出1号、3号和5号着丝粒的染色体易位。3) 建立了原发性食管癌染色体直接制备的方法,成功率达26%,并完成了一例组织染色体的FISH核型鉴定,结果是46,XY。 结论:1) 本研究建立的重复多色荧光原位杂交技术简便、易行,能够用于全染色体组型分析,尤其是染色体隐匿性重排及复杂核型的鉴定。2) 以食管癌细胞系的核型分析为出发点,所发现的5号和9号染色体易位、3号染色体长臂的等臂染色体形成、整臂染色体易位及Y染色体丢失,对于进一步了解食管癌并揭示其发生、发展规律提供了信息。3) RM-FISH技术与原发性食管癌染色体直接制备方法的联合,为食管癌和其它实体肿瘤的染色体畸变及其发生、发展机制的研究提供了新的技术平台。
许智雄[9]1999年在《人食管癌表达下调基因的克隆及其结构分析》文中提出食管癌是人类常见恶性肿瘤之一，其发病率位居我国恶性肿瘤发生的第四位。我国是食管癌高发区，世界上一半以上的食管癌发生在我国。食管癌遗传流行学调查显示遗传因素在食管癌发生中起着重要的作用。但是，至今尚未发现食管癌的易感基因，食管上皮的癌变分子机理仍未明确。当前肿瘤分子遗传学的研究重点已逐渐向基因表达研究转变，即从着重质(结构)的改变转向质和量(表达)的改变并重。研究基因表达的外遗传学(epigenetics)亦己成为目前肿瘤分子遗传学研究的一个重要内容。其中，肿瘤表达下调基因分离是筛选侯选肿瘤抑制基因的一个有效途径而倍受重视。目前，国内外对食管癌表达下调基因了解甚少。鉴别和克隆更多的食管癌表达下调基因并了解其在不同个体食管癌组织与正常食管粘膜的基因表达差异状况，不仅可以加强对食管癌发生发展分子机制的阐明，而且有助于食管癌的早期诊断、有针对性的个体治疗以及设计新的抗食管癌药物。 1．应用改进的uRNA差异显示技术分离食管癌组织表达下调cDNA片段 本文首次应用三条锚定引物等摩尔混合物(GT_(15)N，N代表A，G和C)进行mRNA差异显示。采用40个10-mer随机引物(OPA-1至OPA-20，OPB-1至OPB-20)与3条锚定引物的等摩尔混和物(GT_(15)N，N为A，G和C)组合，共获得同时在三对人食管癌组织中均不表达或低表达而在同一病人癌旁食管粘膜都高表达的差异表达带30个。经Northern杂交和PCR分析证实，我们已获得在食管癌组织中表达下调的基因9个，其中有4个是新基因片段。本文主要介绍其中的三个即已知基因Ma1和新基因DRC1和DRC2。本文结果显示此方法重复性较好而且可以加快筛选差异表达基因的速度。 2．两个食管癌表达下调新基因DRC1和DRG2全长cDNA的分离和克隆 应用Marathon RACE技术，以食管癌旁cDNA为模板，分别经过两次和三次RACE反应扩增出DRC1和DRC2基因的5'cDNA末端，从而拼接得到新基因DRC1和DRC2初步的全长cDNA。最后，应用PCR技术从胎儿食管cDNA扩增而得到新基因DRC1和DRC2的全长cDNA。DRC1基因全长cDNA具有51bp
何嵘[10]2008年在《PTEN及livin在食管鳞癌组织中的表达及临床意义》文中提出目的恶性肿瘤的发生发展不仅与肿瘤细胞异常增殖和分化有关,而且与细胞凋亡受抑制、凋亡不足也有关,凋亡调节紊乱是恶性肿瘤形成的重要机制之一。于是,细胞凋亡与癌变的关系引起人们的广泛注意,成为目前分子细胞生物学一个新的研究热点。因此,研究凋亡相关基因与肿瘤发生、演进的关系对深入了解肿瘤的发病学十分重要,对开辟肿瘤治疗新方法和提高治愈率有重要的现实意义和广阔的前景。PTEN基因已是公认的抑癌基因,其抑癌作用的机制主要是通过促进细胞凋亡实现的,被认为是一个促凋亡调控基因。Livin基因是近年发现的一个凋亡抑制基因,不但具有抑制细胞凋亡的功能,而且其表达具有明显的组织特异性,已发现在多数肿瘤中表达,与肿瘤发生有密切关系,目前关于Livin蛋白在食管癌中表达的报道甚少,其与食管癌临床病理特征的关系尚无公认的结论。本实验检测了食管癌组织中Livin蛋白和PTEN蛋白的表达及其相关性,旨在研究其在食管癌发生、发展中的意义。材料和方法一、实验方法选择食管癌组织标本60例。经手术后病理切片证实均为食管鳞癌。10例食管正常组织标本做组织对照。每例标本常规石蜡连续切片2张,分别做PTEN和livin免疫组织化学染色,采用SP法检测PTEN及livin的表达。二、结果判定标准Livin蛋白阳性反应为淡黄至棕黄色颗粒,主要定位于胞浆:PTEN蛋白阳性反应为黄至棕黄色颗粒,定位于胞浆。三、统计学处理用SPSS12.0软件包进行统计分析。对病例组和对照组PTEN和livin采用x~2检验。P＜0.05为具有统计学意义。结果1、食管癌组织Livin蛋白的阳性表达率明显高于食管正常组织的;Livin蛋白阳性表达率与TNM分期及淋巴结转移有关,与食管癌患者的年龄、分化程度无关。2、PTEN蛋白在食管正常组织中阳性表达率明显高于食管癌组织的;PTEN蛋白的阳性表达率与食管癌的分化程度及淋巴结转移有关,与食管癌患者的年龄及TNM分期均无关。3、在食管癌组织中Livin蛋白阳性表达率与PTEN蛋白表达率均呈负相关。结论1、Livin蛋白在食管癌中高表达,而在食管正常组织中不表达,提示Livin蛋白的表达可能与食管癌的发生有关,有可能作为食管癌诊断的肿瘤标志物;Livin蛋白表达与食管癌的TNM分期与淋巴结转移密切相关,提示Livin可能与食管癌的发展及恶性潜能有关。2、PTEN蛋白在食管正常组织中高表达,在食管癌组织中阳性表达率显著减低,且与食管癌的分化程度和淋巴结转移密切相关,提示PTEN的表达缺失在食管癌的发生发展中起重要作用。3、Livin蛋白的表达上调可能抑制PTEN的活性、PTEN蛋白的缺失可能促进Livin蛋白的表达,二者共同参与了食管癌的发生发展。二者联合检测可能对食管癌的辅助诊断具有一定的意义。
参考文献：
[1]. 新疆哈萨克族食管癌早期相关基因甲基化分析及功能研究[D]. 刘玲. 新疆医科大学. 2012
[2]. 食管鳞状细胞癌中FHIT基因的表达异常及与吸烟关系的研究[D]. 杜嘉慧. 山东大学. 2005
[3]. 食管癌组织中肿瘤相关基因的缺失和表达异常[D]. 吴孔明. 中国协和医科大学. 1999
[4]. 叶酸对MNNG诱导的哈族食管上皮细胞恶变的干预作用及表观遗传学机制研究[D]. 张慧霞. 新疆医科大学. 2017
[5]. miR-183和miR-218参与调控食管癌发生发展的机制研究[D]. 杨森. 东南大学. 2016
[6]. 哈、汉民族食管癌抑癌基因DNA异常甲基化及其与预后关系的研究[D]. 赵燕. 新疆医科大学. 2011
[7]. 抗原呈递元件基因甲基化对哈萨克族食管鳞癌发生的作用研究[D]. 郑峰. 新疆医科大学. 2013
[8]. 重复多色荧光原位杂交技术的建立及其在食管癌中的应用[D]. 杨壹羚. 石河子大学. 2005
[9]. 人食管癌表达下调基因的克隆及其结构分析[D]. 许智雄. 中国协和医科大学. 1999
[10]. PTEN及livin在食管鳞癌组织中的表达及临床意义[D]. 何嵘. 中国医科大学. 2008
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