贺云霞[1]2002年在《鹅细小病毒VP2基因的克隆、序列分析及原核表达》文中进行了进一步梳理鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)主要引起雏鹅、雏番鸭的高致死性疾病，称为小鹅瘟或Derzsy's病。本病主要侵害出壳后4-20日龄的雏鹅、雏番鸭，发病率和死亡率可达70％～100％。目前尚无治疗该病的特效药物，主要通过传统疫苗进行预防；该病的确诊主要依赖病毒的分离鉴定和血清学方法，这些传统方法多费时费力。由于本病传播快、致死率高，开发研制新型的基因工程疫苗以及建立一种快速、简便、特异的诊断方法非常必要。 VP2是鹅细小病毒结构蛋白之一，是GPV的重要保护性抗原，在体内诱导的抗体具有中和作用。与主要结构蛋白VP3存在相同的抗原决定簇成分，是制备基因工程疫苗的重要候选基因。本研究参考GenBank发表的GPV-B株全基因序列，借助Oligo4.1设计一对引物，采用PCR方法对国内GPV分离株H1株的VP2基因进行扩增，扩增产物与pMD18-T载体连接后测序，结果表明：H1株VP2基因核苷酸序列全长1764bp，编码587个氨基酸，与已发表B株的VP2基因相比，核苷酸序列有25个碱基差异，推导氨基酸序列有10个氨基酸差异，其中9个氨基酸的变异由相应密码子的第一位碱基引起，25个不同碱基中的其它15个变异碱基均不引起氨基酸的改变。与GenBank发表的鹅、鸭细小病毒进行核酸序列对比，结果表明H1株VP2基因与GenBank发表的GPV-B株、GPV-SHM株、GPV-YG株、番鸭细小病毒(MDPV)MDPV-FRANCE株、FM株的VP2基因相比，核苷酸同源率分别为98.6％、96.2％、93.2％、80.3％、80.0％，推导氨基酸序列同源率分别为98.3％、97.5％、96.1％、88.2％、87.4％。系统进化树分析可知：所有比较毒株分为两大分支GPV和MDPV。其中H1株属于GPV分支，与GPV-B株亲缘关系最近。H1株与GPV-B株氨基酸的差异集中在VP2、VP3重迭区的319-470位之间，这与预期暴露于病毒最表面的区域相吻合，可能是宿主免疫筛选导致的变异；GPV-H1株和MDPV之间还存在另一高变区，位于VP2和VP3起始密码子之间，这可能与两病毒有不同宿主域相关。 利用DNA重组技术，将其结构蛋白VP2基因亚克隆至原核表达载体pPROEX-HTb，IPTG诱导后成功表达出与预期大小相符的约72ku的融合蛋白，光密度扫描对表达产物进行初步定量，表明表达产物约占菌体总蛋白的14％。表达产物经Ni-NTA金属鏊合层析柱纯化后，得到了纯度较高的6His-VP2融合蛋白。采用Western-blot方法对表达产物进行反应原性分析，结果表明所得6His-VP2融合蛋白具有较好的反应原性。 本研究为了解国内外鹅细小病毒核苷酸序列演化上的关系，为开发研制新型分子诊断试剂和抗鹅细小病毒感染的基因工程疫苗提供了理论依据。
潘英[2]2008年在《鹅细小病毒SRW株VP2基因克隆及原核表达》文中认为小鹅瘟(Goose plague,GP)由我国方定一等于1956年在扬州发现,并于1961年用鹅胚分离到小鹅瘟病毒(GP Virus,GPV)。匈牙利学者Derzsy于1967年将其命名为鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)。GPV属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(Parvovirus),基因组大小为5106bp,由左右两侧两个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)组成。左侧ORF(LORF)编码非结构蛋白NS1和NS2,右侧ORF(RORF)编码VP1、VP2及VP3叁种结构蛋白。研究表明,VP2能诱导鹅体产生中和抗体,属于保护性抗原。为研究GPV基因工程疫苗,本文克隆到GPV SRW株VP2基因并在E.coli中获得了表达。参照GenBank中收录的GPV B株(登录号U25749)VP2基因序列,设计带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的扩增VP2基因的特异引物。采用PCR方法从GPV SRW株基因组中扩增出VP2基因,通过限制内切酶定点克隆到pUCm-T载体中。序列测定结果表明,克隆得到的GPV SRW株VP2基因大小为1758bp,与GPV B株同源性达98.46%;推导的氨基酸序列与报道的共计10株GPV毒株的VP2氨基酸序列同源性为94.18%;推导的蛋白抗原性指数及亲水性分布与GPVB株VP2无显着差异。将GPV SRW株VP2基因亚克隆到表达载体pET-21a上,获得表达重组子pE-VP2。经BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子中SRW株VP2基因ORF正确,转化E.coli BL21(DE3),获得了基因工程菌株E.coli BL21(GVP2)。经优化的诱导条件是,1mM的IPTG和30℃培养,E.coli BL21(GVP2)菌体经超声波处理后的裂解物,离心沉淀,经6M盐酸胍变性以及N~(2+)亲和层析纯化,SDS-PAGE检测纯化样品中含有74kDa蛋白,Western-Blot检测发现该蛋白与兔抗GPV SRW株高免血清发生反应,出现特异条带。试验结果表明,E.coilBL21(GVP2)以包涵体形式表达出了GPV SRW株VP2。本研究为进一步筛选GPV SRW株VP2活性重组蛋白,用于制备GPV基因工程疫苗及制备检测其抗体效价的ELISA试剂盒的开发研究打下了良好的基础。
卜雨明[3]2009年在《鹅细小病毒VP2基因与鹅IL-2融合基因的构建》文中提出小鹅瘟是鹅细小病毒(GPV)感染的一种传播快、死亡率高的高度接触性传染病,以渗出性肠炎、肝、肾、心等实质器官炎症为特征,对5-13日龄的雏鹅发病率和死亡率可达100%,是目前危害养鹅业的主要疾病之一。近年来,本病在世界各地均有不同程度的流行,广泛发生于中国、欧洲各国、以色列、越南和日本等地。目前,用于防治该病的疫苗主要为弱毒苗和油乳剂灭活苗。弱毒苗价格低、效果好,但易导致病毒散播;灭活苗虽然安全,又能激发良好的体液免疫反应,但不足之处是使用剂量大,且不能诱发机体产生细胞免疫,而一系列的研究证实在疾病的免疫保护中,细胞免疫和体液免疫均占有重要的地位。核酸疫苗的出现给小鹅瘟的免疫预防带来了新的希望,但研究也发现核酸疫苗也存在许多不足之处:如免疫原性不强、质粒DNA可能整合到宿主DNA上引起病理和毒理反应等。因此,如何增强核酸疫苗的免疫效果成为目前该疫苗研究的关键。随着人们对IL-2等细胞因子的深入研究,发现其具有明显的分子佐剂效应,能特异性增强抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性。VP2是鹅细小病毒结构蛋白之一,是GPV的重要保护性抗原,可刺激机体产生中和抗体,与主要结构蛋白VP3存在相同的抗原决定簇,是制备核酸疫苗的重要候选基因。本试验参考GenBank发表的GPV-B株全基因序列,设计特异性引物,采用PCR方法扩增出GPV病毒的VP2基因,然后与鹅源性白细胞介素-2基因(Goose Interleukin-2)构建成融合基因VP2-IL-2,将该融合基因克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)中,构建出pCDNA3.1(+)-VP2-IL-2重组质粒,最后将构建的核酸疫苗免疫小白鼠,比较其诱导小鼠细胞免疫发生能力的差异,以期探讨IL-2对GPV核酸疫苗是否有免疫增强作用。并为进一步研究和开发小鹅瘟DNA疫苗提供科学依据。1.重组质粒pCDNA3.1(+)-VP2的构建根据GeneBank公布的鹅细小病毒(GPV)GPV-B株全基因序列设计特异性引物,在GPV VP2基因引物上游引入BamHⅠ位点、下游引入XhoⅠ位点。以鹅细小病毒DNA为模板,PCR扩增出VP2完整基因。再与pMD18-T质粒载体连接,转化入感受态细胞DH5a,提取重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定为阳性克隆后,与真核表达载体相连,构建了重组质粒pCDNA3.1(+)-VP2。2.重组质粒pCDNA3.1(+)-VP2-IL-2的构建根据GeneBank公布的鹅细小病毒(GPV)GPV-B株全基因序列和鹅源性白细胞介素-2(IL-2)基因序列分别设计特异性引物,且在GPV VP2基因引物上游引入BamHⅠ位点、下游引入SalⅠ位点,在IL-2基因引物上游引入SalⅠ位点、下游引入XhoⅠ、HindⅢ位点。先RT-PCR扩增上游带有SalⅠ位点、下游带有XhoⅠ、HindⅢ位点的鹅源IL-2基因,并将其克隆到pMD18-T中。再以鹅细小病毒DNA为模板,PCR扩增VP2基因,将其插入到含有IL-2基因的质粒pMD18T-IL-2中,使两个基因首尾相连,且VP2基因不含终止密码子,IL-2基因不含起始密码子。最后将VP2-IL-2融合基因插入真核表达载体pCDNA3.1(+),构建了重组质粒pCDNA3.1(+)-VP2-IL-2。3.小白鼠免疫试验我们将试验小鼠随机分成5组,每组8只,分别为:pCDNA3.1(+)-VP2-IL-2核酸疫苗组(Ⅰ组)、pCDNA3.1(+)-VP2核酸疫苗组(Ⅱ组)、GPV弱毒疫苗组(Ⅲ组)、空载体pCDNA3.1(+)组(Ⅳ组)、空白对照组(灭菌生理盐水)(Ⅴ组)。接种途径为肌肉注射(100ug/只),首免后间隔14天进行第二次免疫,二免后两周进行第叁次免疫,叁免后两周,放血分离血清。通过间接ELISA检测,比较其诱导小鼠细胞免疫发生能力的差异。其结果为:核酸疫苗诱导免疫小鼠产生细胞免疫的能力总体较GPV弱毒疫苗强。一免后,核酸疫苗免疫组(Ⅰ、Ⅱ)IL-4、IFN-γ水平均显著极差异(P＜0.01)高于GPV弱毒疫苗组(Ⅲ组),GPV弱毒疫苗组(Ⅲ组)显着极差异(P＜0.01)高于空载体组(Ⅳ)和灭菌生理盐水(Ⅴ组)。二免后,pCDNA3.1(+)-VP2-IL-2核酸疫苗组(Ⅰ组)IL-4、IFN-γ水平极显著(P＜0.01)高于pCDNA3.1(+)-VP2核酸疫苗组(Ⅱ组)。这表明,核酸疫苗组(Ⅰ、Ⅱ)比GPV弱毒疫苗组(Ⅲ)诱导免疫小鼠产生细胞免疫的能力强,且融合基因组较单基因组能产生更强的细胞免疫。
侯秋莲[4]2005年在《鹅细小病毒VP2基因片段在原核系统中的表达及多克隆抗体的制备》文中进行了进一步梳理鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)主要引起4-20 日龄雏鹅和雏番鸭的高致死性疾病,称为小鹅瘟或Derzsy's 病。本病以消化道,尤其是小肠部位典型纤维素性栓塞病变为特征,发病率和死亡率可达70%-100%,是危害养鹅业的主要疾病之一。目前尚无治疗该病的特效药物,主要通过接种传统疫苗进行预防;该病的诊断主要依据临床症状结合血清学方法,这些方法大多费时费力。由于本病传播迅速、致死率高,开发研制新型的基因工程疫苗以及建立一种快速、简便、特异的诊断方法非常必要。VP2 是鹅细小病毒的主要免疫功能区,可刺激机体产生中和抗体,是GPV 的重要保护性抗原,与主要结构蛋白VP3 存在相同的抗原决定簇成分,是制备基因工程疫苗的重要候选基因。我国目前有关GPV 分子生物学和基因工程方面的研究刚刚起步。本实验室在前期的研究中成功的用鹅胚分离到鹅细小病毒中国分离株HG5/82,将非结构基因与结构基因分别进行克隆及序列测定,并与国内外分离株相应基因进行分析比较,对其分子生物学特征进行了回顾性研究。本研究对GPV 中国分离株HG5/82 鹅胚尿囊液通过电镜观察及琼脂扩散试验鉴定后,参考孔宪刚等发表的GPV 中国分离株HG5/82 基因序列,设计引物,对该毒株的VP2 基因进行扩增,利用DNA重组技术,将目的片断,即VP2 氨基端共969bp 基因亚克隆至原核表达载体pPROEXTMHTb 中,构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,用IPTG 诱导后成功表达出与预期大小相符的约36kDa 的融合蛋白,表达形式为包涵体。光密度扫描对表达产物进行定量分析,表明表达产物约占菌体总蛋白的21.4%。表达产物经镍离子亲和树脂纯化后,得到了纯度较高的带有6×His 标签的目的蛋白。用所获得的纯化产物经叁次肌肉注射新西兰白兔,制备兔抗鹅细小病毒部分结构蛋白多克隆抗体,采用Western blot 方法对表达产物进行反应原性分析,结果表明所得融合蛋白具有较好的反应原性。本研究为进一步筛选具有抗原表位的GPV 基因片段,以获得高效、具有活性的重组蛋白,以及研究GPV 衣壳蛋白的分子生物学特征奠定了基础,为抗鹅细小病毒感染基因工程疫苗、分子生物学诊断试剂的开发研制提供了理论依据和实验基础。
马波[5]2002年在《鹅细小病毒VP1基因的克隆、序列分析及表达载体的构建》文中认为GPV(Goose Parvovirus)依据其形态、生化及培养特性被划归为细小病毒科细小病毒属成员，引起雏鹅和雏番鸭高度致死性疾病，主要以消化道，尤其是小肠部位的典型病变为特征。许多国家都爆发过该病，所有分离的GPV抗原性相似。目前主要依据临床症状结合血清学、病毒学方法诊断该病，这些方法大多费时、费力，容易延误该病的治疗，需建立一种快速、简便、特异的诊断方法。该病的防制依赖疫苗和抗血清及卵黄抗体的使用。目前使用的疫苗分为种鹅用和雏鹅用的鹅胚和鸭胚化疫苗，这些疫苗在实际生产中发挥巨大作用，因其为全毒苗或弱毒苗，存在着潜伏感染，排毒散毒，毒力返祖的缺陷，基因工程疫苗的研制可解决上述问题。 GPV的叁种结构蛋白VP1、VP2、VP3位于同一开放阅读框内，共用同一终止密码子，VP1包含了组成VP2、VP3的所有氨基酸，因其具有这一特殊性，成为本研究的目的基因。本试验参照Genbank中发表的GPV B株基因序列设计并合成了扩增GPV H1株VP1的一对引物，利用PCR技术扩增出长约2.2Kb的目的片段，经酶切鉴定后，将其插入原核表达载体pPRoEXHTb的XbaⅠ、XhoⅠ多克隆位点间，构建了GPVH1株VP1的原核表达载体GP1-pPRO。测序结果表明GPVVP1基因由2199个核苷酸组成，编码732个氨基酸。与B株、YG株进行了同源性比较，核苷酸同源性分别为98.5％，93.18％；氨基酸同源性分别为98.09％，95.77％。同时将该目的基因插入到杆状病毒表达系统的供体质粒pF_(AST)B_(AC)HTb的XbaⅠ、XhoⅠ多克隆位点间，经酶切、PCR鉴定后，将重组的供体质粒GP1-FAST转化到含有杆状病毒和辅助质粒的DH10B_(AC)感受态细胞中，获得了表达GPV H1株VP1的重组杆状病毒GP1-BAC。 用Antheprot5.0对GPVH1株VP1、VP2、VP3及B、YG株VP1的二级结构、抗原性进行预测及比较，表明GPVH1株VP1、VP2、VP3共同部分的二级结构、抗原性无差别：GPVH1、B、YG株VP1的二级结构、抗原性存在差别。GPVH1株与其他细小病毒VP1的氨基酸序列同源性比较证明GPVH1与依赖病毒AAV-2的同源性高于与自主细小病毒的同源性。 本试验为进一步研究GPV的分子生物学特性，VP1的理化特性、生物学活性奠定了基础：为GPV的诊断试剂、基因工程疫苗的研制做了前期工作：同时为GPV的分类地位及其进化关系提供了佐证。
布日额[6]2005年在《GPV VP及NS基因克隆及其原核表达产物的研究和应用》文中研究指明小鹅瘟(Goose plague, GP)是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)所引起的主要侵害4～20 日龄雏鹅的急性或亚急性败血性传染病,其造成的死亡率高达90-100%,是危害养鹅业最严重传染病之一。自1956 年中国学者方定一在我国扬州地区发现并进行首次报道后,世界许多养鹅国家和地区均有陆续报道。GPV 属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(Parvovirus)的成员。病毒整个基因组为5.1kb,含有两个阅读框,左侧阅读框编码NS1、NS2 非结构蛋白,右侧阅读框编码VP1、VP2 及VP3 结构蛋白,其中VP3 结构蛋白能够诱导机体产生中和抗体,因此VP3 基因片段是研究防治小鹅瘟基因工程苗和检测抗原的首选基因。在防治小鹅瘟实践中,GPV 全毒疫苗曾发挥了重要作用,但全毒苗的应用的确存在散毒、潜伏感染,以及对GPV 自然感染与GPV 全毒苗免疫抗体无法进行鉴别等不足,致使该病长期以来无法得到有效检测,直接影响到对小鹅瘟的有效控制。国内外学者先后建立了琼脂扩散试验、中和试验、免疫荧光抗体试验等血清学诊断方法,在一定程度上为防治小鹅瘟发挥了重要作用,但同时也存在灵敏度差、操作烦琐、检测所需时间长等不足,已不适应更有效地控制该病的需要。国外学者建立了根据GPV 核酸PCR 产物酶消化片段的大小来区别小鹅瘟与番鸭细小病毒感染的方法,但未见进一步深入应用的报道。本论文以建立完善、有效的分子生物学和免疫学检测方法,更加有效地控制小鹅瘟为目的,应用扩增GPV 部分核酸片段的特异性引物及其克隆产物分别研究和建立了对GPV DNA进行定性和半定量检测的PCR 及DIG 核酸标记探针方法。利用部分核酸片段的原核表达产物研究建立了定量及定性检测GPV 感染抗体及鉴别VP3 亚单位抗体的间接ELISA 及斑点ELISA 方法。本论文的研究内容和结果如下:1. 克隆了GPV H1 株的VP1-VP3 核苷酸非重迭序列片段。测序结果为,克隆产物由534bp个核苷酸组成,编码178 个氨基酸残基。扩增产物测序结果与Gen Bank 公布的GPV B 参考毒株同区段序列同源性达100%。2. 利用扩增VP1-VP3 及NS1 核酸片段的两对引物建立了检测GPV 核酸的PCR 方法。两对引物只扩增GPV 模板DNA,对GPMV、AIV 等对照病毒核酸模板的PCR 呈阴性。扩增VP1-VP3 及NS1 核酸片段引物分别能从系列稀释至4.4fg、44pg 或0.01LD50、10LD50的GPV 感染鹅脏器DNA 中扩增出GPV DNA。对7 组感染鹅脏器检测结果表明,两对引物均能快速、准确地扩增出病鹅脏器中的GPV DNA,阳性检出率达100%。2001-2004 年间对多起送检病鹅的PCR 检测均获得一致的结果。但由于扩增NS1 片段引物的检出灵敏度比扩增VP1-VP3 核酸片段引物低1000 倍,因此选择扩增VP1-VP3 核酸片段的一对引物作为建立GPV PCR 检测方法的特异性引物。由于PCR 具有强大的扩增效应,能够从病鹅脏器提取DNA中直接扩增GPV DNA,从而为准确地检测GPV 提供了一项快捷、有效的方法。3. 对VP1-VP3 及NS1 核苷酸片段的扩增产物利用Digoxigenin 进行标记,建立了检测GPV 核酸的DIG 标记探针方法。两个标记探针均能与各自相应核酸片段PCR 产物、重组质粒及不同毒株的GPV 核酸发生特异性杂交,而与GPMV、AIV 核酸杂交呈阴性。VP1-VP3
李雪梅[7]2001年在《鹅细小病毒和番鸭细小病毒部分基因组克隆、序列分析及VP2-VP3基因的表达》文中研究表明根据国外己发表的GPV B株和MPV FM株基因组核苷酸序列设计了四对引物，分别对国内四株鹅细小病毒分离株和两株番鸭细小病毒分离株的非结构蛋白（NS）基因和主要结构蛋白（VP2- VP3）基因进行PCR扩增，并进行几种内切酶的酶切分析比较，证实两种病毒NS基因和VP2-VP3基因具有较高同源性，但酶切位点有较大差异：GPV NS基因缺乏Sac I位点，存在Pst I位点；而MPV的NS基因则含有Sac I位点，却无Pst I位点。另外发现，与国外毒株和GPV CC株不同，GPV FS、GPV JL株均含有EcoR I位点。GPV VP2-VP3基因含有B_gⅠⅡ、Dra Ⅰ位点，而无Xba Ⅰ位点；MPV VP2-VP3基因则与之相反。因此可以通过对两段基因内切酶酶切分析结果的差异，将两种病毒进行鉴别区分。 将GPV CC株、GPV FS株和MPV YZ株和MPV FS株的ns基因和VP2-VP3基因分别克隆到pCR3．1 T载体，并进行核苷酸序列分析比较。结果表明：GPV CC株、GPV FS株、MPV YZ株和MPV FS株的NS基因均含有1884个核苷酸，编码628个氨基酸。GPV和MPV同一种病毒不同毒株之间NS基因核苷酸和氨基酸序列同源性在92．7％～99．3％和96．5％～99．4％之间；而GPV和 MPV两种病毒之间的核苷酸和氨基酸序列同源性则为79．6％～83．0％和86．9％～90．7％；其中GPV FS株的变异较大，变异主要区域在460～480位氨基酸。 GPV CC株、GPV FS株、MPV YZ株和MPV FS株的VP2-VP3基因核苷酸数为1764，编码528个氨基酸。同一病毒的不同毒株之间VP甚-VP3基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为93％～99．5％和96．3％～98．6％，但GPV FS弱毒株与GPV CC株和国外参考毒株GPV B株之间核苷酸序列以及氨基酸序列差异较大：GPV和MPV两种病毒之间核苷酸和氨基酸序列同源性则分别为78．3％～80．6％和84．8％～87．6％，并且两种病毒之间在氨基酸序列一些区域存在较大差异。GPV和MPV VP2-VP3基因核苷酸和氨基酸序列的差异可能与这两种病毒毒力、抗原性可能有一定的关系。 为进一步探讨GPV和MPV主要结构蛋白的特性与功能。分别将GPV和MPV VP2-VP3基因插入到原核表达质粒pET－28a的多克隆位点上，构建了表达两种病毒VP2-VP3基因的原核表达载体pEGVP1和pPEMVP。将它们分别转化到宿主表达菌BL21中，经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳可见表 且 且 中文须县一达产物的分子量均约为 75kDa和 60kDa；Western blot检测表达产物与相应抗体具有一定的反应原性。另将这两种病毒的W－VP3基因分别克隆到核酸疫苗质粒PIRESI neo载体上，构建了核酸疫苗重组质粒PIGVPI和PIMVP，重组质粒转染到鹅胚成纤维细胞和番鸭胚成纤维细胞上，经Western blot检测证明，GPV和 MPV VPZ－VP3均获得表达并具有良好的反应原性。
贺亦龙[8]2014年在《5株水禽细小病毒基因组的克隆与遗传进化分析》文中研究说明鹅细小病毒病是主要引起雏鹅和雏番鸭发生高致死性的病毒病。本病主要以消化道,尤其是肠道的卡他性和纤维素性炎症为主要特征；番鸭细小病毒又称“叁周病”,是由于该病主要侵害叁周龄以内的雏番鸭。二者早先属于细小病毒属成员,在国际病毒分类委员会第八次分类报告中将二者分类于依赖病毒属。本病以以腹泻、喘气、软脚为主要症状的细小病毒病。这两种病都具有较高的发病率和死亡率,严重危害着水禽业的发展。对付这两种疾病没有什么特异性的治疗方法,多以接种疫苗来预防该病；诊断方法也多以血清学诊断或者分子生物学诊断为主。自首次发现以来,经过国内外多年的研究,虽然可以较好的控制本病的发生,但该病依旧危害着水禽业。为了更好的控制该病的发生,我们就要仔细的研究其分子水平上的特性,首要的就是其基因水平上的特性。鹅细小病毒基因组由5106个核苷酸构成,而番鸭细小病毒基因组有5132个核苷酸。他们的编码区均由左右两个开放阅读框组成,左侧阅读框编码的蛋白为非结构蛋白,包括NS1和NS2两种；右侧阅读框编码结构蛋白为结构蛋白,包括VP1、VP2和VP3叁种。其中NS1蛋白主要参与病毒对细胞的毒性作用、病毒复制以及基因表达,NS2则能促进NS1蛋白对细胞的毒性作用,编码结构蛋白的叁个基因都是两种细小病毒主要的免疫原基因,且病毒装配过程中,其中的VP3蛋白主要在病毒衣壳的表面,是病毒最主要的保护性抗原。本实验应用PCR技术扩增GPV和MDPV的5株病毒,序列分析结果表明：其中非结构基因(NS)全长1884bp,编码627个氨基酸；结构基因(VP)全长2199bp,编码732个氨基酸。鹅细小病毒NS基因核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为93.5%-99.8%和95.9%-99.8%；而番鸭细小病毒NS基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.7%～100.0%和98.6%～100.0%；鹅与番鸭细小病毒NS基因之间核苷酸和氨基酸同源性分别为80.0%-83.0%和88.9%-90.4%。鹅细小病毒VP编码基因间核苷酸与氨基酸的同源性分别为88.8%-99.9%和90.2%～100.0%,相应的番鸭细小病毒VP编码基因间的同源性为98.0%-99.5%和96.9%-99.3%,而鹅与番鸭细小病毒之间的同源性大多低于90%,而番鸭细小病毒与鹅细小病毒病的DY毒株氨基酸的相似性较高,在91.5%-92.8%之间。而且几个毒株序列的主要差异集中在VP2与VP3重迭的区域,这跟VP3蛋白位于病毒衣壳最外层有关,这部分的的变化可以使病毒逃避宿主的免疫系统。与细小病毒亚科其他成员序列比对,结果表明腺联病毒非结构蛋白部分无论在核苷酸水平还是氨基酸水平都与水禽细小病毒同源性较高,这表明其二者的亲缘性较其他成员更近。潜在糖基化位点预测结果显示出MDPV与GPV在非结构蛋白部分含有相同的糖基化位点,这表明他们来自相同的祖先；而在结构蛋白部分MDPV的2个毒株含有全部的8个糖基化位点,而GPV的3个毒株除ZJ株存在全部6个糖基化位点,而G3和LJY株均存在5个糖基化位点,分别缺少582-584NTT和703-705NRT。系统进化树分析可知：所有比较毒株分为两大分支GPV和MDPV, GPV的叁株以及MDPV的两株病毒分别在其各自分支中,并未发生重组现象。在结构蛋白水平上,GPV的LJY毒株跟国内各毒株在遗传进化上相接近,而G3和ZJ毒株却与国外的几个毒株比较接近。这说明随着水禽业的发展,本地品种自身的不断改良或通过引入外来优良品种来改良本地品种,就使得不同地域的鹅细小病毒与番鸭细小病毒传播的风险提高,也加速病毒间的基因交流,促使他们变得更加多样化。而非结构蛋白的水平上并没有这样明显的地域关系,这表明NS基因在遗传进化过程中较VP基因保守。细小病毒亚科成员全基因进化树分析可以了解到腺联病毒与水禽细小病毒分在同一大的分支中,这与分类报告中同属依赖病毒属是相符合的,而整个依赖病毒属分支与牛犬细小病毒属在进化上有着较近的亲缘关系。本试验为进一步了解两种病毒的理化特性,分子生物学特性奠定了基础,也为了解国内外毒株的演化进程以及他们的差异。
丁轲[9]2006年在《鹅细小病毒VP3基因与鹅白细胞介素-2基因分泌性融合表达载体的构建及在乳酸杆菌中表达的研究》文中研究表明随着养殖业向集约化和管理向人性化发展，口服疫苗逐渐成为研究的热点和重点，乳酸杆菌是肠道正常的益生菌，具有天然的抗菌、抗病毒和抗肿瘤的作用。利用基因工程手段，将乳酸杆菌开发成为具有特定功能的基因工程菌，使其在肠道分泌抗原蛋白以达到免疫的目的。本研究以较为保守的鹅细小病毒(Goose Parvovirus，GPV)VP3基因为抗原基因，同时为了更好地提高免疫效果，将鹅白细胞介素-2(Intedeukin-2，IL-2)成熟蛋白基因IL2c与VP3基因融合，并使其在乳酸杆菌中得到良好表达，为研制鹅IL-2增强鹅细小病毒VP3乳酸杆菌口服基因工程疫苗准备了材料。1．为了探索乳酸杆菌在鹅养殖业中的应用，首先本研究对鹅肠道乳酸杆菌进行了调查，结果表明雏鹅在20日龄时肠道的乳酸杆菌已达到较高的水平，最高可达10~8CFU／g。分离鉴定了15株乳酸杆菌，分别属于旧金山乳杆菌、发酵乳杆菌、弯曲乳杆菌、类高加索乳杆菌、瑞士乳杆菌、双发酵乳杆菌、小鼠乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌和棒状乳杆菌棒状亚种。通过耐酸和耐胆盐试验表明L2和L8两株乳酸杆菌具有较强的耐受性，质粒检测均没有发现有质粒存在。2．根据GenBank上注册的短小乳酸杆菌(L．brevis)S-层蛋白基因序列设计一对引物，采用PCR法获得了S-层蛋白信号肽基因，将其克隆到pMD18-T载体并测序。序列分析表明序列全长为352bp，其中编码信号肽部分的90bp的碱基与GenBank中Z14250的完全相同，生物信息学分析也表明这是一段信号肽基因，氨基酸序列分析也表明它具备信号肽的典型特征，结果表明本试验克隆得到了短小乳酸杆菌S-层蛋白信号肽基因。3．根据GenBank中的鹅细小病毒B株全基因序列，设计合成一对引物，应用PCR技术扩增了鹅细小病毒强毒CHv株的VP3基因片段，将扩增后的VP3基因重组到pUC57载体上，并对插入片段进行序列测定，将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV、MDPV、PPV和CPV等不同宿主来源的细小病毒的VP3进行生物信息学比较及分析。结果表明，我国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1605bp，编码534个氨基酸，与国内外10株GPV的VP3基因进行比较，核苷酸同源性为93.4％-99.8％，氨基酸同源性为96.5％～99.3％，变异较小，是GPV保持一个血清型的分子基础。与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6％和89.9％，而与其它种属的细小病毒同源性均在30％以下，表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远。生物信息学分析表明它是一种疏水性的、稳定的、有强抗原性的膜外蛋白，有3个潜在的糖基化位点。4．参照GenBank中发表的鸭IL-2基因保守序列，设计了一对引物，采用RT-PCR技术从ConA刺激的四川白鹅外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出了鹅IL-2基因，并进行了克隆和测序。结果显示鹅IL-2基因全长468bp，含有一个441bp的ORF区，编码146个氨基酸。生物学软件分析表明该序列编码的氨基酸序列中有4个磷酸化位点，1个糖基化位点，含有21个氨基酸残基组成的信号肽。同源性分析表明四川白鹅IL-2基因与浙江白鹅的同源性极高，核苷酸和氨基酸同源性分别为99.8％和100％，与鸭、鸡和火鸡IL-2核苷酸及氨基酸序列同源性分别为92.2％、77.5％、78.2％和85.8％、65.5％、64.1％，而与其它种属的哺乳动物及啮齿类动物(如人、猴、大鼠、牛、马、猪、猫、小鼠、兔和鹿)的IL-2基因的核苷酸和氨基酸同源性分别低于45％和28％，进化树分析也表明四川白鹅IL-2基因与鸭和鸡具有较近的亲源关系。成熟蛋白IL2c基因全长为407bp，含有一个378bp的编码区，编码126个氨基酸。5．首先通过酶切连接和PCR方法将SP基因与VP3基因连接，然后再利用酶切连接的方法通过在引物上加上一个由GSGGSGG 7个氨基酸组成的短肽将VP3基因与IL2c基因连接，从而构建成了VP3-IL2c的融合蛋白基因。将该融合基因连接到乳酸杆菌表达载体pMJ67中，获得了重组的分泌性表达载体pMJ-SP-VP3-IL2c，通过电转化方法，将其转化到乳酸杆菌L．casei，通过乳糖诱导，成功表达了融合蛋白，SDS-PAGE结果显示在约76kD处有一特异性条带，其分子量与融合蛋白基因所推导的蛋白质分子量相符。并对表达条件进行了优化，结果表明在诱导剂的浓度为0.5％，诱导剂加入时间为OD_(600)=0.5，诱导时间为20h时，可得到最高表达量。用兔抗GPV阳性血清进行West-blotting试验表明该重组表达的融合蛋白对GPV具有较好的免疫原性。采用Sepharose 4B琼脂糖凝胶为填料对重组表达蛋白进行分子筛层析，得到了纯度较高的重组蛋白。采用MTT法测定IL2c蛋白的活性，试验结果表明表达后的VP3-IL2c融合蛋白的淋巴细胞增殖系数可达3.84，表明IL2c蛋白具有生物学活性。
毕玉海[10]2006年在《鹅副粘病毒F基因与鹅细小病毒VP3基因遗传变异及其表达研究》文中研究说明鹅细小病毒病(俗称小鹅瘟)与鹅副粘病毒病是严重危害水禽养殖业的两大重要病毒性疾病,在临床症状上十分相似,不易区分,给水禽养殖业带来了严重的经济损失。为进一步研究GPV和MDPV感染谱、病毒分子致病机理、为下一步更深入地研究NDV跨种间传播的分子生物学机制奠定基础,及有效预防控制这两种疾病的发生和流行,本研究以本实验室分离、保存的GPMV NA-1株、GPV GD-01株为研究对象,与国内外相关毒株分析比较了GPMV NA-1株主要免疫原性蛋白F基因、GPV GD-01株主要免疫原性蛋白VP3基因的遗传变异情况。并对这两种主要免疫原性基因进行了表达研究。遗传变异研究显示:GPMV NA-1株的F基因全长1 662 bp,编码553个氨基酸,与已发表的5株GPMV毒株核苷酸、氨基酸同源性分别平均为97.76%、98.0%,与国家标准毒株F48E9、LaSota传统弱毒株的核苷酸、氨基酸同源性分别为87.4%、92.2%,84.8%、89.0%,与其他鸡源NDV毒株核苷酸、氨基酸的同源性也都在84.7%以上;由NA-1株的F基因推导的氨基酸序列,在其裂解位点的氨基酸组成具有NDV中强毒株的标志,即112R-R-Q-K-R-F117。同时具备VII型NDV的典型特征,即101位的K和121位的V两个特征性氨基酸,结合F基因进化树分析确定,NA-1株与近年来流行的GPMV毒株同属F基因VII型、即APMV-1;抗原表位分析比较显示,不同宿主来源的NDV F蛋白抗原表位不尽相同,不同地域GPMV毒株的F蛋白抗原表位不尽相同,同时发现猪源NDV SP13毒株与LaSota株、鸭源NDV FM1/03株、阿根廷侯鸟分离株88T.00株、鸡源NDV ZJ/2000株抗原表位基本相同。GPV GD-01株VP3基因全长1 605 bp,编码534个氨基酸。GPV GD-01株与其他GPV、MDPV毒株的VP3基因核苷酸序列同源性分别平均为96.15%、89.16%,与HG5/82、YG株同源性最高分别达到99.8%。与其他GPV、MDPV毒株的氨基酸
参考文献：
[1]. 鹅细小病毒VP2基因的克隆、序列分析及原核表达[D]. 贺云霞. 东北农业大学. 2002
[2]. 鹅细小病毒SRW株VP2基因克隆及原核表达[D]. 潘英. 西南大学. 2008
[3]. 鹅细小病毒VP2基因与鹅IL-2融合基因的构建[D]. 卜雨明. 西南大学. 2009
[4]. 鹅细小病毒VP2基因片段在原核系统中的表达及多克隆抗体的制备[D]. 侯秋莲. 新疆农业大学. 2005
[5]. 鹅细小病毒VP1基因的克隆、序列分析及表达载体的构建[D]. 马波. 东北农业大学. 2002
[6]. GPV VP及NS基因克隆及其原核表达产物的研究和应用[D]. 布日额. 东北农业大学. 2005
[7]. 鹅细小病毒和番鸭细小病毒部分基因组克隆、序列分析及VP2-VP3基因的表达[D]. 李雪梅. 中国人民解放军军需大学. 2001
[8]. 5株水禽细小病毒基因组的克隆与遗传进化分析[D]. 贺亦龙. 东北农业大学. 2014
[9]. 鹅细小病毒VP3基因与鹅白细胞介素-2基因分泌性融合表达载体的构建及在乳酸杆菌中表达的研究[D]. 丁轲. 四川农业大学. 2006
[10]. 鹅副粘病毒F基因与鹅细小病毒VP3基因遗传变异及其表达研究[D]. 毕玉海. 吉林大学. 2006
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