张君涛[1]2004年在《蛋鸡离体小肠对二肽吸收转运的研究》文中认为小肽（Small Peptide）因其独特的吸收转运优势和特殊的生理药理学意义，已成为当今营养学和生物学研究的热点。本试验采用蛋鸡离体肠管培养法研究3种二肽的吸收转运特点。本研究主要内容如下：蛋鸡离体小肠对Gly-Gly、Gly-L-Leu和Met-Gly吸收转运的研究采用蛋鸡离体外翻肠囊培养法，将小肠分为十二指肠、空肠前、中、后段和回肠5个部位肠段，制成肠囊分别置入5种培养液（空白PBS溶液，Gly+LeuPBS溶液，Gly-Gly肽PBS溶液、Gly-L-Leu肽PBS溶液和Met-Gly肽PBS溶液）39.5℃培养30 min，测定肠囊黏膜液、浆膜液和组织匀浆液中相应二肽和氨基酸含量。结果表明，含肽培养液中肠囊浆膜液和组织匀浆液Gly含量显着高于Gly＋Leu培养液（P＜0.05），其Gly含量依次是Gly-Gly＞Gly-L-Leu＞Met-Gly。Gly-L-Leu肽培养液中肠囊浆膜液和组织匀浆液Leu含量比Gly＋Leu培养液高60.43％，差异显着（P＜0.05）。回肠肠囊的Gly和Leu含量最高。各段肠囊中均未检出完整二肽。由此可见，蛋鸡离体小肠对二肽形式Gly和Leu的吸收较氨基酸形式更具优势；Gly和Leu的吸收主要发生在回肠；二肽在培养过程发生了水解。2．肠肽酶对Gly-Gly和Gly-L-Leu水解的研究采用蛋鸡离体外翻肠段培养法，将小肠分为5个部位肠段，每个肠段分别在2种二肽培养液（Gly-Gly或Gly-L-Leu对照培养液，Gly-Gly或Gly-L-Leu培养液 + 肽酶抑制剂Bestatin和Amastatin 的抑制培养液）中39.5℃培养25 min，每5 min取样一次，测定培养液中的二肽含量。结果表明，培养5 min后2种培养液中均未能检测到完整Gly-Gly，对照培养液Gly-L-Leu含量降低83.25%，抑制培养液则下降56.6%，而抑制培养液10min后无显着降低（P＞0.10）。各培养时段抑制培养液中Gly-L-Leu含量均显着高于对照培养液（P＜0.05）。由此认为，离体肠囊在培养过程中能够迅速释放肠肽酶，快速水解2种二肽。肽酶抑制剂Bestatin和Amastatin能抑制Gly-L-Leu的水解，但不能抑制Gly-Gly的水解。3．添加酶抑制剂对Gly-L-Leu吸收转运的研究采用蛋鸡离体外翻肠囊培养法，将小肠分5个部位肠段制备外翻肠囊。试验设2个试验组。试验1组为培养液（黏膜液）添加酶抑制剂（Bestatin和Amastatin），浆膜液不加；试验2组为浆膜液添加酶抑制剂，培养液（黏膜液）不添加。肠囊置于培养液39.5℃培养15 min，测定各肠囊黏膜液、浆膜液和组织匀浆液中Gly-L-Leu、Gly和Leu含量。结果表明，试验1组Gly-L-Leu含量显着高于试验2组（P＜0.05），两组黏膜液的Gly-L-Leu含量都显着高于浆膜液和组织匀浆液（P＜0.05）。试验1组各肠囊黏膜液的Gly-L-Leu含量差异不显着（P＞0.05）；试验2组除回肠外的其它肠囊黏膜液均未测到
刘国华[2]2005年在《肉仔鸡对小肽的吸收转运及其调控研究》文中研究指明本课题研究了肉仔鸡对小肽吸收的机理和日粮、激素和活性因子对小肽转运载体的调控作用,并比较研究了不同蛋白质原料在肉仔鸡消化道生成可吸收小肽的规律。 试验一研究了温度、酸度、培养液成分、样品前处理等理化因素对Gly-Gly,Gly-L-Leu和Met-Gly的稳定性的影响。将Gly-Gly,Gly-L-Leu和Met-Gly分别进行含Ca~(2+)、Mg~(2+)的PBS培养液溶解、39.5℃恒温培养30min、0.6mol/L高氯酸溶液稀释、含Ca~(2+)、Mg~(2+)的PBS培养液稀释并煮沸5min、0.6mol/L高氯酸溶液稀释并煮沸5min的处理。结果表明,上述处理后3种二肽的同收率均在97%以上。 试验二研究了Gly-Gly和Gly-L-Leu在鸡离体小肠各段的水解以及肽酶抑制剂抑制二肽水解的效果。将12只成年产蛋鸡分为4组,每只为1个重复,取小肠分为十二指肠、空肠前段、空肠中段、空肠后段和回肠,制备外翻肠囊,分别在含有不同二肽(Gly-Gly,Gly-L-Leu)与添加和不添加肽酶抑制剂(Bestmin和Amastain)处理组成的4种培养液中培养。结果表明,鸡离体外翻肠囊培养液中存在迅速而强烈的二肽水解现象,培养5min内Gly-Gly全部被水解,而Gly-Leu也大部分被水解,25min后则被完全水解,其中以小肠前段的水解作用更为强烈。添加10μmol/LAmastatin和Bestatin未能抑制Gly-Gly的水解,但可有效抑制Gly-Leu的水解,培养25min后仍有40%的Gly-Leu未被水解。 试验叁研究了日粮氮源形态对肉仔鸡离体小肠Gly-Leu吸收转运及血清小分子肽含量的影响。选取预饲氨基酸、酪蛋白水解物和酪蛋白氮源的等能等氨基酸纯合日粮3周的肉仔鸡各9只,取十二指肠、空肠和回肠,制各外翻肠囊,分别在空白培养液、氨基酸培养液和Gly-Leu培养液中培养25min,测定黏膜液、浆膜液和组织匀浆液中的Gly-Leu含量。结果表明,日粮氮源形态显着影响肉仔鸡离体小肠对Gly-Leu的吸收,酪蛋白组吸收Gly-Leu最多,酪蛋白水解物组吸收最少。离体小肠不同肠段吸收Gly-Leu的能力有显着差异,十二指肠吸收能力显着低于空肠和回肠。日粮氮源形态影响鸡血清肽分子量分布,氨基酸组血清小分子肽比例显着高于酪蛋白水解物和酪蛋白组。 试验四研究了鸡肽转运载体cPepT1基因表达的RT-PCR评定方法以及肉仔鸡小肠mRNA的分布规律。根据鸡肽转运载体cPepT1 mRNA和看家基因β-actm mRNA序列,分别设计cPepT1和β-actin引物各1对,并通过Mg~(2+)浓度、循环数等PCR条件的优化,建立了包括RNA提取、反转录、PCR的鸡小肠cPepT1基因表达检测方法。采用该方法研究了肉仔鸡cPepT1基因在小肠各段的表达差异。结果显示,肉仔鸡小肠PepT1表达水平随小肠近端到远端逐渐降低,回肠表达水平显着低于十二指肠和空肠,十二指肠和空肠差异不显着。 试验五研究了外源激素和生长因子对肉仔鸡PepT1基因表达的调控作用。25日龄肉仔鸡30只随机分为5组,分别接受表皮生长因子、甲状腺素、胰高血糖素、甲巯咪唑刺激,剂量分别为0.03mg,330μg,0.1mg,和25mg/kg体重,对照组注射蒸馏水,刺激为每日1次,连续5d,取小肠测定肽转运载体PepT1 mRNA丰度。结果表明,甲状腺素和胰高血糖素在转录水平显着上调鸡肽转运载体PepT1基因表达,而甲状腺素抑制剂甲巯咪唑和表皮生长因子则有下调PepT1基冈表达的趋势。 试验六比较研究了不同蛋白质饲料在肉仔鸡消化道内水解释放小分子肽的特性。35只21日龄肉仔鸡,分为7组,分别强饲70%待测饲料(豆粕、鱼粉、菜籽粕、花生仁粕、玉米蛋白粉、血粉、棉籽粕)和30%淀粉的混合物50g,研究各种饲料在消化道水解释放小分子肽(<600Da)的特性。结果表明,同一蛋白质饲料在肉仔鸡消化道各部位水解释放的小分子肽占水溶性蛋白质的比例有显着差异,其中腺胃释放小分子肽比例显着低于小肠各段,小肠中则以十二指肠最高,回肠后段最低,空肠前、后段和回肠前段之间无显着差异。不同饲料蛋白在肉仔鸡消化道水解释放小分子肽的比例有显着差异,其比例高低依次为棉籽粕>花生仁粕>血粉>玉米蛋白粉>豆粕>鱼粉>菜籽粕。
梁陈冲[3]2012年在《蛋鸡小肽载体PepT1mRNA表达及其调控机制的研究》文中提出本论文研究了小肽载体在蛋鸡肠道不同部位的表达特点,并探讨了不同蛋白源供应形式对蛋鸡消化道肽载体的影响,以及外源激素和生长因子对蛋鸡PepT1基因表达的调控作用。试验一研究探讨了蛋鸡肽转运载体PepT1mRNA表达的RT-PCR评定方法及蛋鸡肠道不同部位肽载体PepT1mRNA的表达形式、分布特点。根据肽载体cPepT1 mRNA和看家基因β-actin mRNA序列,分别设计cPepT1和β-actin引物各一对,通过温度、循环数等PCR条件的优化,建立包括RNA提取、反转录、PCR的蛋鸡小肠cPepT1基因检测方法,应用该方法研究蛋鸡cPepT1基因在小肠各段的表达差异。结果显示,蛋鸡空肠部位PepT1mRNA的表达水平显着高于十二指肠(p<0.05),与回肠比差异不显着(p>0.05),十二指肠PepT1mRNA的表达水平与回肠之间无显着差异(p>0.05)。试验二分别应用游离氨基酸、小肽(酪蛋白水解物)、酪蛋白为氮源,配制纯合日粮,饲喂蛋鸡,应用RT-PCR技术检测肠道转运载体PepT1mRNA表达量的变化,从而确定蛋白源形式对肽载体PepT1mRNA表达的影响大小和规律。结果表明:以小肽为氮源的试验组蛋鸡小肠不同肠段转运载体PepT1mRNA表达量较饲喂游离氨基酸和酪蛋白组明显提高(p<0.05),而游离氨基酸组和酪蛋白组间差异不显着(p>0.05)。试验叁研究了外源激素和生长因子对蛋鸡PepT1mRNA表达的调控作用。成年蛋鸡42只,随机分为7组,分别接受表皮生长因子(EGF)、甲状腺素、胰岛素、胰高血糖素、肾上腺素受体激动剂、甲硫咪唑刺激,剂量分别为0.03mg/kg、330ug/kg、0.1mg/kg、0.1 mg/kg、0.03 mg/kg、25mg/kg,对照组注射蒸馏水,每日一次,连续5d,取小肠检测肠道肽转运载体表达量变化。结果表明:EGF对蛋鸡小肠PepT1 mRNA表达量有降低的趋势;皮下注射胰岛素、胰高血糖素、肾上腺素受体激动剂和口服甲状腺素后对蛋鸡十二指肠PepT1 mRNA表达量有上调的作用,其中胰岛素的上调作用最为明显;皮下注射胰岛素和口服甲状腺素对空肠和回肠PepT1 mRNA表达量有上调的趋势,其中以胰岛素的上调作用更为明显;皮下注射胰高血糖素、肾上腺素受体激动剂和口服甲硫咪唑对空肠和回肠PepT1 mRNA表达量有降低的趋势,但均未达到显着水平。
江勇[4]2008年在《肉仔鸡小肽转运载体的克隆表达及其转运调控研究》文中进行了进一步梳理本课题研究了肉鸡小肽转运载体不同肠段的发育及分布规律,并克隆,表达、纯化了肽转运载体C端抗原表位区,同时建立了肉鸡肽转运载体cPEPT1外源表达的293-T细胞模型、研究了激素和调节因子对细胞模型中小肽转运载体的调控作用。试验一荧光定量PCR检测肉仔鸡肠道肽转运载体cPEPT1 mRNA方法的建立:根据鸡肽转运载体cPEPT1 mRNA和看家基因18SrRNA序列,分别设计cPEPT1和18SrRNA引物,建立了包括RNA提取、反转录、PCR的鸡小肠cPEPT1基因表达检测方法,并通过模板浓度、引物浓度及退火温度等条件的摸索进行了试验条件的优化,试验二实时定量PCR评定肉鸡小肠PEPT1 mRNA基因发育变化:分析不同日龄肉仔鸡小肠不同肠段肽转运载体PEPT1 mRNA的发育规律。选用1日龄商品代雄性Arbor Acre (AA)肉鸡100羽,随机分为5组,采用实时定量PCR法研究肉鸡肠道表达的肠段差异;以9、18、27、36、45日龄AA肉鸡十二指肠、空肠、回肠样品为模板研究肉鸡肠道肽转运载体(Peptide transporter1, PEPT1) mRNA表达发育变化。结果表明:AA肉鸡PEPT1 mRNA的表达丰度从十二指肠、空肠到回肠依次降低;AA鸡PEPT1 mRNA在十二指肠及空肠发育规律表现出相反趋势,十二指肠9、18、27丰度较高,其中27日龄显着高于45日龄,而空肠36、45表达丰度较高,显着高于9、18日龄丰度。试验叁实时定量PCR评定北京油鸡小肠PEPT1mRNA基因发育变化:分析不同日龄北京油鸡小肠不同肠段肽转运载体PEPT1 mRNA的发育规律。选用1日龄雄性商品代北京油鸡100羽,随机分为5组,采用实时定量PCR法研究肉鸡肠道表达的肠段差异;以18、36、54、72、90日龄北京油鸡十二指肠、空肠、回肠样品为模板研究肉鸡肠道肽转运载体1 mRNA表达发育变化。结果显示: (1)北京油鸡肠道PEPT1 mRNA的表达丰度从十二指肠、空肠到回肠依次降低;北京油鸡PEPT1 mRNA在十二指肠与空肠、回肠发育规律不同,十二指肠18、36日龄丰度较高,显着高于54、72及90日龄的相应值,其中18日龄表达量最高,而72日龄最低;空肠90日龄时PEPT1 mRNA表达量最高,显着高于18、36日龄的相应值,而在54、72日龄时的表达丰度则高于18、36日龄,但结果不显着;回肠PEPT1 mRNA表达量以72日龄时最高,54、72及90日的表达量龄显着高于18、36日龄时的表达量。试验四北京油鸡cPEPT1基因编码区的克隆:试验成功构建了重组载体pEASY-T3-PEPT1。根据GenBank发布序列设计引物,通过RT-PCR成功从肉鸡空肠肠道粘膜组织中扩增出PEPT1基因,将其克隆进pEASY-T3载体并测定核苷酸序列,经扩增成功获得到测序正确的2145bp的基因。测序结果证明测序和方向均正确,该基因通过基因序列分析包括12个跨膜区一个较大的亲水环,抗原表位区集中于蛋白的C端。试验五鸡PEPT1抗原表位基因的原核表达及序列鉴定:表达并纯化鸡肠道肽转运载体PEPT1抗原表位区。根据GenBank的原鸡PEPT1保守区序列设计引物,提取鸡十二指肠道黏膜总RNA进行反转录,以合成的cDNA为模板,PCR扩增PEPT1抗原表位区序列后与pEASY-T3载体进行T克隆;测序正确后,采用定向克隆的方法将PEPT1抗原表位区基因连接到pET22B+载体上,成功构建了pET-22B-PEPT1重组质粒。将重组质粒克隆转化到原核表达宿主Rosetta (DE3)中。诱导蛋白表达,并通过SDS-PAGE和Westernblot及质谱测序验证。构建得到原核融合重组载体pET22B-6His-PEPT1;诱导后表达得到6His-PEPT1融合蛋白,纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定,所得产物经质谱分析其序列正确。试验六鸡肠道肽转运载体抗原表位基因毕赤酵母表达系统的构建:根据GenBank发布序列设计引物,从鸡空肠肠道粘膜组织中扩增出PEPT1基因,将其克隆进pEASY-T3载体并测定核苷酸序列,设计一对PEPT1抗原表位区段外源表达的PCR引物,利用已得到得的全长目的基因(2145)pEASY-T3 -PEPT1载体为模板,设计酶切位点为EcoRⅠ和NotⅠ,扩增出目的片断。将该片段克隆到pPIC9K载体,通过重组质粒酶切验证、菌落PCR鉴定,证明得到的阳性重组质粒含有目的基因片段,抗原表位区1000bp,。将抗原表位区基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,测序结果证明测序和方向均正确,并将其命名为pPIC9K-PEPT1(s)。通过诱导蛋白序列正确。试验七北京油鸡PEPT1基因编码区的克隆及其在HEK293-T细胞的转染条件优化:通过本试验,我们构建了北京油鸡PEPT1的真核pcDNA3-PEPT1,并且同时为了检测转染体系的状态,同时建立了绿色荧光蛋白的共转染体系,通过对HEK293-T的生长条件优化,确定了最佳转化时间及转化条件,为建立细胞模型建立了基础。试验八北京油鸡肠道肽转运蛋白PEPT1基因表达载体在293-T细胞的表达鉴定:本试验通过分子生物学手段建立了北京油鸡PEPT1细胞模型。根据GenBank的原鸡PEPT1保守区序列设计引物,从北京油鸡肠道粘膜组织中扩增出PEPT1基因,将其与pEASY-T3载体连接并测定核苷酸序列,成功获得到测序正确的2145bp的基因,并将北京油鸡肠肽转运载体PEPT1基因克隆到真核表达载体pcDNA3.0,构建了真核表达载体pcDNA3-PEPT1。采用脂质体介导将表达质粒pcDNA3-PEPT1转染293-T细胞,同时转染pcDNA3.0-EGFP荧光蛋白进行转染体系荧光监测,流式细胞术检测转录后16h、20h、24h的荧光强度。分别在16h、20h、24h、44h收集等量转染细胞,抽提转染细胞总RNA,DNAseⅠ处理残留的DNA污染,反转录合成cDNA,以构建不同稀释度的pEASY-T3-PEPT1质粒为模板,建立SYBERGREEN实时荧光定量标准曲线,检测PEPT1在293-T细胞中的转录水平。结果表明,在质粒转染入293-T细胞后,在16h、20h、24h、44h均有稳定的转录水平。从而建立了在293-T细胞表达北京油鸡PEPT1的外源模型。试验九北京油鸡肠道肽转运蛋白PEPT1基因表达载体在293-T细胞的转运调控:通过克隆北京油鸡cPEPT1基因在293-T细胞中进行瞬时表达,检测重组蛋白cPEPT1的异源转运甘亮肽活性。方法:培养293-T细胞待细胞生长至90-95%融合时,以胰酶消化稀释1:2传代至24孔板,待细胞融合度达到约95%,将构建好的重组pcDNA3-cPEPT1采用脂质体转染法导入293-T细胞,每孔质粒添加量1ug,Real-Time PCR检测mRNA表达,同时在PEPT1导入后22h加入3H标定的甘亮肽孵育液,孵育液中添加H+、GH及胰高血糖素,分别在30、60min中止反应,液闪仪测定孵育液放射性。结果:用Real-Time PCR法检测表明293-T细胞可表达cPEPT1;在表达细胞中,与H+及胰高血糖素相比,生长激素添加有效的促进了表达细胞对甘亮肽的吸收。
王辉[5]2010年在《谷氨酰胺二肽在断奶仔猪离体空肠的转运特点和对空肠发育影响的研究》文中认为为研究丙氨酰谷氨酰胺二肽(Alanylglutamine dipeptide, Ala-Gl)和甘氨酰谷氨酰胺二肽(Glyc ylglutamine dipepti de, Gly-Gln)在断奶仔猪肠道中的降解、吸收特点和两种二肽对断奶仔猪肠道发育的影响,本研究进行了以下叁个试验：试验一：谷氨酰胺二肽在断奶仔猪离体空肠的水解本试验旨在研究Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽在断奶仔猪空肠中的水解特点。试验采用体外培养断奶仔猪外翻肠段的方法,将培养液分叁个处理(空白对照组、Ala-Gln二肽组和Gly-Gln二肽组),每个处理叁个重复,每个重复一个肠段,37℃恒温孵育60min,每5 min取样一次,通过检测培养液中完整二肽的含量来研究Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽在空肠中的水解情况。结果如下：在孵育60 min后,培养液中Ala-Gln二肽含量为9.00±1.57 mmol/L, Gly-Gln二肽含量为8.85±1.78 mmol/L,两种二肽浓度差异不显着(P>0.05)；孵育60 min后,Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽的降解速率分别是0.17±0.03 mmol/L/miin、0.19±0.03 mmol/L/min,两者之间差异不显着(P>0.05)。结果表明：60 min内Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽在断奶仔猪肠段培养液中的含量均随着时间的延长逐渐降低,但并未完全降解,本试验为进一步研究这两种小肽的完整吸收提供了依据。试验二：谷氨酰胺二肽在断奶仔猪离体空肠中的吸收特点本试验旨在研究Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽在断奶仔猪空肠中的吸收特点。试验采用外翻肠囊的方法,将培养液分五个处理,即空白对照组、Ala-Gln二肽组、游离Ala+Gln组、Gly-Gln二肽组和游离Gly+Gln组,每个处理叁个重复,每个重复一个外翻肠囊,37℃恒温孵育40 min后取样,通过检测培养液、浆膜液和组织匀浆液中完整二肽和单体谷氨酰胺的含量,来研究Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽在小肠中的吸收情况。结果如下：Ala-Gln的吸收量和吸收速率分别是10.26±0.74 mmol/L、0.26±0.02 mmol/L/min,显着高于Gly-Gln吸收量和吸收速率(分别是7.25±1.47 mmol/L、0.18±0.04 mmol/L/min) (P＜0.05); Gly-Gln二肽吸收量(速率)高于Gly+Gln处理的中Gln吸收量(速率),Ala-Gln二肽吸收量(速率)显着高于Ala+Gln处理中Gln吸收量(速率)(P<0.05)；游离Ala+Gln处理中Gln吸收量和转运速率分别是7.28±0.54 mmol/L和0.18±0.01 mmol/L/min,均高于Gly+Gln处理中Gln吸收量和吸收速率(P<0.05),分别是4.79±0.54 mmol/L和0.12±0.01 mmol/L/min.以上结果表明,Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽均能以完整形式被迅速吸收；Ala-Gln二肽吸收速率高于Gly-Gln二肽吸收速率,高于游离谷氨酰胺吸收速率。试验叁：谷氨酰胺二肽对断奶仔猪空肠发育的影响本试验旨在研究Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽对断奶仔猪空肠发育的影响。采用体外培养肠组织的方法,将培养液分为叁个试验组：空白对照组、Ala-Gln组和Gly-Gln二肽组；两个二肽组分别包括2mmol/L、4mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30. mmol/L相应二肽处理,将组织置于二氧化碳培养箱中,95%O2 37℃恒温培养48 h～96 h,通过检测培养液中乳酸脱氢酶的活性、肠组织蛋白含量、谷氨酰胺酶和二胺氧化酶活力、BrdU掺入细胞核的情况、Caspase-3表达情况,来研究Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽对肠组织中谷氨酰胺代谢、细胞增殖和凋亡的影响。结果显示：与空白对照组相比,添加Ala-Gln二肽或Gly-Gln二肽后能降低培养液中乳酸脱氢酶活力；能显着提高断奶仔猪空肠组织蛋白含量(P<0.05)、谷氨酰胺酶活力(P<0.05)和二胺氧化酶活力(P<0.05),且随着二肽浓度提高而逐渐增加,当Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽浓度分别为20 mmol/L、30 mmol/L时,空肠组织蛋白含量和二胺氧化酶活力最高,当两种二肽浓度均为20mmol/L时,空肠组织谷氨酰胺酶活力最高；Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽都能显着提高BrdU掺入细胞核的阳性细胞百分比(P<0.01)、增加BrdU免疫阳性细胞的平均光密度(P<0.01),均随着二肽浓度提高而逐渐增加,当两种二肽浓度均为30 mmol/L时效果最佳；Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽都能显着降低肠组织Caspase-3免疫阳性细胞百分比(P<0.01)和Caspase-3免疫阳性细胞平均光密度(P<0.01),随着二肽浓度增加而逐渐降低；两种二肽浓度在20 mmol/L与30 mmol/L时,作用效果差异不显着(P>0.05)。结果表明,Ala-Gln二肽、Gly-Gln二肽通过提高肠组织谷氨酰胺代谢酶活力而加强组织对Gln利用,从而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、提高空肠组织蛋白含量。谷氨酰胺二肽作用效果随其浓度提高而呈剂量依赖效应,且相同浓度的两种二肽作用效果基本一致。当两种二肽浓度均为20 mmol/L时,空肠组织谷氨酰胺酶活力最高；当Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽浓度分别是20 mmol/L、30 mmol/L时,空肠组织蛋白含量和二胺氧化酶活力最高；当两种二肽浓度为30mmol/L时,其促进空肠细胞增殖,抑制细胞凋亡效果最佳。综上所述,Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽在断奶仔猪空肠培养液中培养60 min后并不完全被降解,其降解速率分别是0.17±0.03mmol/L/min. 0.19±0.03 mmol/L/min。40 min内,Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽能以完整形式被吸收,吸收量分别是10.26±0.74 mmol/L和7.25±1.47 mmol/L; Ala-Gln二肽吸收速率高于Gly-Gln二肽,高于游离谷氨酰胺吸收速率。Ala-Gln二肽和Gly-Gln二肽通过提高空肠组织谷氨酰胺酶活力和二胺氧化酶活力,加强细胞对谷氨酰胺的利用强度,从而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、提高组织蛋白含量,最终起到保护细胞完整性的作用。两种肽作用效果均随二肽浓度提高而呈剂量依赖效应,且相同浓度的两种二肽作用效果基本一致。
刘国华, 蔡辉益, 张君涛[6]2005年在《蛋鸡离体小肠对Gly-L-Leu肽的吸收转运研究》文中提出本试验采用离体外翻肠囊法研究了蛋鸡小肠对Gly-L-Leu肽的吸收和转运。将6只 206日龄的海兰褐蛋鸡的小肠分割为十二指肠、空肠前、中、后段和回肠5段,分别制备外翻肠囊。每3只鸡的肠囊为1个试验组,将灌注浆膜液(含Ca2+/Mg2+PBS缓冲液)的各肠囊置于相同的二肽培养液(含20mmoL/LGly-L-Leu的Ca2+/Mg2+PBS缓冲液)中进行培养。试验1组培养液添加了肽酶抑制剂(10μmoL/L Bestatin和Amastatin),试验2组浆膜液添加了等量的肽酶抑制剂。培养15分钟后测定培养液、浆膜液、肠组织匀浆液中二肽和游离氨基酸的含量。结果表明,鸡十二指肠、空肠前、中段对Gly-L-Leu有强烈的水解作用,空肠后段和回肠的水解能力相对较弱。鸡各肠段均能迅速吸收GJy-L-Leu,并将其转运到浆膜液中。吸收量和转运量有沿肠道延伸而增强的趋势。
徐运杰, 方热军[7]2009年在《外翻肠囊法在养分吸收机制中的研究进展》文中认为外翻肠囊体外培养技术属于生理学实验技术,在动物营养吸收机理研究中应用较多。文章主要综述了外翻肠囊体外培养方法及其在动物营养领域的应用。
徐运杰, 方热军[8]2009年在《外翻肠囊法的应用研究》文中进行了进一步梳理外翻肠囊法是在体外培养小肠肠环技术和刷状缘膜囊技术的基础上发展而来的。外翻肠囊法是指在动物麻醉无痛或屠宰状态下立即分离小肠,去掉肠系膜,用生理盐水或缓冲液冲洗干净,然后根据试验目的将所需肠段分割为若干小段,外翻使肠黏膜向外,结扎一端形成肠囊状,灌注人工培
宋小珍[9]2008年在《藿香、苍术提取物复合制剂对高温应激猪小肠消化吸收的影响》文中认为夏季高温高湿天气易诱发猪热应激,导致猪生产性能下降,对营养物质的吸收能力降低,给养猪业带来巨大损失。小肠是应激反应的敏感器官之一,又是营养物质消化吸收的主要场所。肠上皮细胞的刷状缘膜和基底膜上富含双糖酶和各类转运载体蛋白,在动物营养物质的消化吸收上起着重要作用。研究显示,藿香、苍术、黄柏等具有清热祛湿作用,同时还可改善动物小肠的消化吸收。本研究通过人工模拟夏季高温高湿环境诱发猪热应激,研究藿香、苍术提取物复合制剂对高温应激状态下猪小肠消化吸收功能的调控作用,建立小肠上皮细胞体外热应激模型,筛选抗热应激效果显着的提取物,探讨藿香、苍术提取物复合制剂改善猪小肠吸收功能的机制。本研究包括以下五个试验部分：1.藿香、苍术提取物复合制剂对高温应激猪生产性能及血清指标的影响在人工气候仓模拟夏季高温高湿环境对中国小型实验猪(CEMP,农大Ⅰ系)进行为期10天的高温刺激(40℃,5h/d),研究不同配比的藿香、苍术、黄柏和石膏混合提取制备的复合制剂Ⅰ和Ⅱ在饲粮中添加后对高温应激猪生产性能和血清指标的影响。试验选用2月龄实验猪64头,分为常温组、高温组、提取物Ⅰ组和提取物Ⅱ组四个处理,每组16头猪。各组分别于试验的第1、3、6、10天,随机取4头猪称重,静脉采血后分离血清,测定血清SOD、GSH-Px活性,葡萄糖、MDA含量。结果表明,高温刺激可引起猪日采食量和日增重下降,血糖水平降低(P<0.05),血清SOD、GSH-Px活力升高；MDA含量升高(P<0.05)。提取物Ⅰ可降低高温应激猪血清MDA含量,提高日采食量(P<0.05),但对日增重没有明显改善(P>0.05)；提取物Ⅱ可显着提高高温应激猪的日增重和日采食量,降低其血清MDA含量(P<0.05)。以上结果提示在改善高温应激猪生产性能和血糖水平上,提取物Ⅱ效果优于提取物Ⅰ。2.藿香、苍术提取物复合制剂对高温应激猪小肠脂质过氧化损伤的影响研究了藿香、苍术提取物复合制剂Ⅰ和Ⅱ对高温应激猪小肠脂质过氧化损伤的保护作用。试验处理同试验1,在试验的第1、3、6、10天,从每组中取4头猪,快速放血处死,分离十二指肠、空肠和回肠,取部分肠组织制作电镜超薄切片,测定各段肠组织匀浆液SOD、GSH-Px活性及MDA含量。结果显示：(1)与常温组相比,高温组试猪小肠SOD、GSH-Px活性显着降低(P<0.05),MDA含量显着升高(P<0.05)；小肠上皮细胞微绒毛变细变短,线粒体内脊变短。(2)与高温组比较,提取物Ⅰ显着提高猪小肠组织SOD、GSH-Px活性；提取物Ⅱ可显着提高猪小肠组织SOD、GSH-Px活性,并降低小肠MDA含量,改善小肠上皮细胞微绒毛的吸收表面积(P<0.05)。这提示添加藿香、苍术提取物复合制剂可促进高温应激猪抗氧化酶活性的恢复,改善其受损的小肠上皮微绒毛结构,且提取物Ⅱ效果优于提取物Ⅰ。3.藿香、苍术提取物复合制剂对高温应激猪小肠消化和吸收的影响选择抗热应激作用显着的藿香、苍术提取物复合制剂Ⅱ,研究其对高温应激猪小肠消化吸收功能的影响。选用2月龄中国实验用小型猪48头,随机分成常温组、高温组和提取物组。各组试验猪分别于第1、3、6、10天采样,测定小肠木糖吸收水平,同时制备十二指肠、空肠和回肠刷状缘膜囊,测定蔗糖酶、乳糖酶、麦芽糖酶和碱性磷酸酶活性。结果表明：猪小肠各段的刷状缘二糖酶活性呈现明显差异,以空肠最高,其次是回肠和十二指肠。碱性磷酸酶活性在回肠最高,其次为空肠和十二指肠。高温应激猪十二指肠和空肠刷状缘叁种二糖酶、碱性磷酸酶活性均在第1、3、6天比常温组猪显着下降(P<0.05),而后又逐渐恢复(P>0.05)；小肠木糖吸收水平在第3、6天显着下降(P<0.05),第10天回升(P>0.05)。添加藿香、苍术提取物复合制剂可显着上调高温应激猪小肠木糖吸收水平,提高小肠刷状缘二糖酶和碱性磷酸酶活性(P<0.05),使其在热应激的第6天提前恢复至正常水平。4.藿香、苍术提取物复合制剂对高温应激猪小肠葡萄糖转运相关载体表达的影响为探讨藿香、苍术提取物复合制剂对高温应激猪小肠营养吸收的调控作用,本试验研究了其对热应激第6天猪小肠葡萄糖转运相关载体表达的变化。测定小肠Na+/K+-ATP酶活性,采用ELISA法分析猪小肠SGLT1和GLUT2含量,荧光PCR技术检测小肠各段Na+/K+-ATP酶、SGLT1和GLUT2mRNA表达量。结果表明：高温应激猪小肠Na+/K+-ATP酶的活性降低(P<0.05),十二指肠和回肠GLUT2蛋白水平下降(P<0.05)；但小肠各段SGLT1和GLUT2mRNA表达量均无显着变化(P>0.05)。提取物组猪小肠Na+/K+-ATP酶的活性、Na+/K+-ATP酶mRNA表达量比高温组显着升高；小肠各段SGLT1和GLUT2蛋白水平,十二指肠和空肠SGLT1和GLUT2mRNA表达量比高温组和常温组都显着上升(P<0.05)。回肠SGLT1和GLUT2的mRNA表达量在叁个处理组间均无显着差异(P>0.05)。以上结果提示,藿香、苍术提取物复合制剂可通过上调小肠葡萄糖转运相关蛋白的表达水平来改善高温应激猪葡萄糖吸收功能,但对小肠各段SGLT1和GLUT2mRNA表达的调控并不一致。5.藿香、苍术挥发油对高温应激小肠上皮细胞葡萄糖吸收的影响利用大鼠IEC-6细胞系,建立小肠上皮细胞体外热应激模型,研究组成提取物复合制剂的四种提取物(藿香挥发油、苍术挥发油、黄柏生物碱和石膏水提物)对高温应激状态下小肠上皮细胞增殖和葡萄糖吸收的影响。结果表明：41℃热应激2h可抑制大鼠肠道IEC-6细胞增殖作用,降低细胞葡萄糖吸收率和Na+/K+-ATP酶的活性；下调细胞Na+/K+-ATP酶mRNA表达量(P<0.05),但对细胞SGLT1、GLUT2的mRNA表达量无影响(P>0.05)。在常温和高温条件下,100μg/mL以上的藿香挥发油和50lμg/mL以上苍术挥发油、石膏水提物对大鼠IEC-6细胞系具有促增殖作用(P<0.05),而各浓度的黄柏生物碱均可抑制IEC-6细胞的增殖,且呈现剂量递增效应(P<0.05)；进一步的研究表明,100μg/mL藿香挥发油可促进葡萄糖的吸收,提高Na+/K+-ATP酶的活性,上调高温应激小肠上皮细胞SGLT1、GLUT2、Na+/K+-ATP酶mRNA表达(P<0.05),但在常温下这些基因的表达没有改变(P>0.05);50μg/mL苍术挥发油可上调常温下葡萄糖转运相关载体(SGLT1、GLUT2、Na+/K+-ATPase)的基因表达和高温下SGLT1的基因表达量,促进细胞对葡萄糖的吸收,提高Na+/K+-ATP酶的活性(P<0.05)。以上结果提示藿香挥发油和苍术挥发油可促进小肠上皮细胞葡萄糖吸收,且这种促进作用与葡萄糖转运相关载体的基因表达水平上调有关。
张君涛, 刘国华, 刘庆生, 王建华[10]2004年在《Gly-Gly肽和Gly-L-Leu肽在蛋鸡肠道内水解的研究》文中进行了进一步梳理采用蛋鸡离体外翻肠段培养法,将小肠分为十二指肠、空肠前段、中段、后段和回肠五个部位肠段,洗净外翻。2种二肽培养液(Gly-Gly肽和Gly-L-Leu肽溶液)作为两组对照培养液,每种二肽培养液中添加肽酶抑制剂(Bestatin和Amastatin),作为试验培养液,39.5℃培养25min,每5min取样一次,测定培养液中的二肽含量。结果表明,培养5min后,含Gly-Gly肽的对照和试验培养液中均未能检测到完整Gly-Gly肽。而含Gly-L-Leu肽的对照培养液Gly-L-Leu肽的含量降低到16.75％,试验培养液则下降到43.40％。而试验培养液中Gly-L-Leu肽的含量10min后无显着降低(P>0.05)。各培养时段试验培养液Gly-L-Leu含量均显着高于对照培养液(P<0.05)。由此认为,离体肠囊在培养过程中能够迅速释放肠肽酶及一些生物活性物质,快速水解2种二肽。肽酶抑制剂(Bestatin和Amastatin)能抑制Gly-L-Leu的水解,但不能抑制Gly-Gly的水解。
参考文献：
[1]. 蛋鸡离体小肠对二肽吸收转运的研究[D]. 张君涛. 西北农林科技大学. 2004
[2]. 肉仔鸡对小肽的吸收转运及其调控研究[D]. 刘国华. 中国农业科学院. 2005
[3]. 蛋鸡小肽载体PepT1mRNA表达及其调控机制的研究[D]. 梁陈冲. 河北农业大学. 2012
[4]. 肉仔鸡小肽转运载体的克隆表达及其转运调控研究[D]. 江勇. 中国农业科学院. 2008
[5]. 谷氨酰胺二肽在断奶仔猪离体空肠的转运特点和对空肠发育影响的研究[D]. 王辉. 四川农业大学. 2010
[6]. 蛋鸡离体小肠对Gly-L-Leu肽的吸收转运研究[J]. 刘国华, 蔡辉益, 张君涛. 中国家禽. 2005
[7]. 外翻肠囊法在养分吸收机制中的研究进展[J]. 徐运杰, 方热军. 饲料博览. 2009
[8]. 外翻肠囊法的应用研究[J]. 徐运杰, 方热军. 饲料研究. 2009
[9]. 藿香、苍术提取物复合制剂对高温应激猪小肠消化吸收的影响[D]. 宋小珍. 南京农业大学. 2008
[10]. Gly-Gly肽和Gly-L-Leu肽在蛋鸡肠道内水解的研究[J]. 张君涛, 刘国华, 刘庆生, 王建华. 中国家禽. 2004
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