乔梦然[1]2017年在《PHLDA3通过激活GSK3β抑制体细胞重编程》文中提出胚胎干细胞(ESCs)取自囊胚的内细胞团,它具有分化成为多种多能干细胞和终端分化的体细胞的潜能,并且具有自我更新的能力,因此一直受到研究人员的青睐。近年来,胚胎干细胞的研究取得了飞跃性的发展。随着胚胎干细胞定向分化成各种终端细胞的技术日趋成熟,它在医学和临床上的应用前景也越来越明朗。同时,在基因组学、蛋白质组学、生物信息学发展的影响下,胚胎干细胞保持其分化潜能的复杂调控网络也日趋清晰地展现在人们眼前。然而,胚胎干细胞在临床应用上面临着来源有限、伦理争议等限制。体细胞重编程技术可以得到与胚胎干细胞(ESCs)特性相似的诱导性多能性干细胞(iPS)。诱导性多能干细胞技术的出现弥补了胚胎干细胞在应用领域的不足。成体细胞的来源十分广泛、取材方便,并且不具有伦理方面的困扰。这为今后干细胞在临床上的大规模应用提供了可能性。同时,这项技术打破了人们对高等动物细胞的固有认识,人们第一次发现高等动物的体细胞也可以在一定条件下转变为具有分化潜能的细胞,为后来的研究提供了启发性的思路。体细胞重编程的效率往往较低,许多基因对该过程起到抑制作用,p53就是其中之一,但是其中的分子机制并不完全明朗。我们在研究中发现,p53的一个直接靶基因,PHLDA3,具有抑制体细胞重编程的功能。该基因在之前的研究中主要被视为一个抑癌基因,而我们发现它参与了 iPS诱导过程。PHLDA3在iPS、R1、E14等干细胞当中含量相对于体细胞更低,并且该基因的表达在体细胞重编程的过程中逐渐下降,而在RA诱导胚胎干细胞分化和拟胚体形成过程中表达上升,暗示它可能与体细胞重编程和干细胞的多能性有关。过表达PHLDA3会明显降低iPS诱导效率,而它的敲低会使诱导效率提高。在体细胞重编程过程中,PHLDA3会抑制AKT的活性,从而激活AKT下游GSK3 β的活性。而抑制GSK3β可以回复PHLDA3过表达所造成的体细胞重编程效率下降,说明PHLDA3通过激活GSK3β抑制体细胞重编程。此外,在体细胞重编程过程当中PHLDA3也受到p53的正调控,并且可以替代一部分p53对体细胞重编程的抑制作用。另外,Oct4会对PHLDA3的表达起到负调控。
张丁鹏[2]2016年在《mTOR和线粒体对小鼠胚胎干细胞增殖及多能性的影响研究》文中进行了进一步梳理胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ESC),是一种可以在体内分化成其他任何一种细胞类型的细胞。在体外,它能在保持多能性的同时,无限地增殖。所以它在组织再生修复、人类疾病模型的构建和生物发育的研究中有很高的潜在价值。在本论文中,我们探讨一个保守的能量代谢感应通路mTOR和一个原始的细胞器线粒体对胚胎干细胞增殖及多能性的影响。其结果如下:一、在m TOR方面1、利用血清+Lif和2i+LIF两种培养条件下培养E14细胞株,72小时后,分别检测细胞的体积大小及增殖速度,我们发现血清+Lif培养条件下的小鼠胚胎干细胞体积及增殖速度均大于2i+Lif培养条件下的。依此我们推测血清+Lif培养条件下mTOR的活性大于2i+Lif。因为两种培养条件下的小鼠胚胎干细胞同处于初始胚胎干细胞状态,具有相同的多能性或分化潜能,所以我们推测mTOR的活性大小不影响小鼠胚胎干细胞的多能性而只影响小鼠胚胎干细胞的增殖快慢。2、我们用siRNA敲降上游mTOR抑制者的方法激活mTOR信号通路后,发现小鼠胚胎干细胞的多能性没有显着性的变化,但是细胞的增殖有一定的减缓趋势,进一步验证了m TOR的活性大小对细胞增殖的影响。二、在线粒体方面1、我们探索了线粒体对小鼠胚胎干细胞多能性的影响。通过操纵培养条件的方法,我们鉴定了shPGC1a/b能阻碍胚胎干细胞多能性的失去,同时有利于胚胎干细胞多能性的重塑。此后我们发现线粒体的总量和线粒体ROS可能是线粒体影响小鼠胚胎干细胞多能性的关键因素。2、为了充分验证上述线粒体对小鼠胚胎干细胞增殖的作用,我们利用Crispr/Cas9技术成功获叁株PGC1a敲除细胞系。本论文的研究结论是mTOR信号通路的改变对小鼠胚胎干细胞的增殖有一定的影响,但是对其多能性的变化没有显着的作用。而线粒体的抑制能影响胚胎干细胞的多能性。
陈海霞[3]2016年在《对Erk信号通路在小鼠胚胎干细胞中基因组稳定性以及多能性维持的研究》文中进行了进一步梳理用小分子抑制剂阻断Mek/Erk信号通路极大的提高了小鼠ES细胞自我更新和多能性能力,然而激活该通路则使ES细胞走向分化。更有趣的是该通路对于人ES细胞是非常重要的,小鼠ES细胞与人ES细胞不同之处仅仅在于小鼠ES细胞是一种全能性更高的na?ve状态,人ES细胞则更类似于小鼠的epiSCs(postimplantation epiblast derived stem cells)。那么Erk信号通路对于小鼠ES细胞发挥怎样的功能?为了在小鼠ES细胞中深入探究Erk信号通路,我们应用Cas9和TALENs技术构建了强力霉素(Doxycycline,Dox)可诱导的iErk1;Erk1/2-/-ES细胞。证明了Erk信号通路对小鼠胚胎干细胞多能性的维持以及基因组的稳定性都是不可少的。当Erk基因敲除之后,小鼠ES细胞的多能性下降,增殖能力减弱,细胞周期G1/S阻滞,端粒缩短以及细胞凋亡产生,并且当Erk信号通路被阻断之后,细胞的分化能力下降,表现为特异性表征分化的基因不能被有效的激活。进而,我们通过RNA-seq高通量分析结果发现了Mek下游非Erk依赖性途径的存在,阐述了小分子抑制剂处理Mek阻断Erk与通过基因水平敲除Erk产生不同的实验效果。总之,Erk信号通路对于端粒的维持,基因组的稳定性以及多能性的维持都是非常重要的。
李妍[4]2015年在《猪类胚胎干细胞建系过程中对培养液的优化研究》文中研究指明胚胎干细胞是研究基因功能、建立疾病模型和促进再生医学领域发展的一种重要工具。猪由于生理结构与人类相似,长期以来被人们作为疾病模型广泛的应用于临床研究中,因此猪胚胎干细胞的建立对于生物医学领域有着重大意义。不仅如此,猪作为农业经济动物,其胚胎干细胞的建立可以在基因工程水平上来帮助改善猪的健康水平和生长性状提高经济效益。但在猪胚胎干细胞的研究中,人们始终没有获得一株真正的胚胎干细胞系,同时猪胚胎干细胞所需要的培养条件也不能确定,在2014年我们实验组获得了一株猪类胚胎干细胞系,512506具有一定的干细胞特点,其培养液(MXV培养液),经研究是一组比较适合猪类胚胎干细胞生长的干细胞培养液。但是由于其成分过于复杂,操作性差,并不利于猪胚胎干细胞的进一步研究。在猪胚胎干细胞培养条件的探索中,人们依据大鼠胚胎干细胞的成功,2i体系也得到了广泛的应用。但却存在着相反的两种作用效果。本实验针对MXV培养液的缺点,我们对其进行了优化,找出MXV培养液中必需成分。并探索了2i对猪胚胎干细胞建系的影响。首先是针对MXV培养液的五种主要成分bFGF,hLif,BSA,N2B27,KOSR,进行逐一简化,分别通过半量降低这五种成分的培养液和全量降低这五种成分的培养液分别培养512506细胞系最终可以去掉MXV培养液中的不重要成分。得到成分简化的MXV培养液,随后,我们对MXV培养液中基础培养液进行优化,X中的基础培养液为叁种基础培养液Neurobasal,KO-DMEM,和DMEM/F1的混合物。我们用单一的培养液成分来替代这个混合体系。最后可以获得简化的MXV培养液。为了进一步确定简化的MXV培养液是否可以完全替代MXV培养液,本实验探索了简化MXV培养液对猪类胚胎干细胞建系效率的影响。同时针对CHIR99021,PD0325901简称2i对于有猪多能性细胞研究中相对立的研究结果,我们探究了2i对猪胚胎干细胞建系效率的影响。经过上述内容研究的结果显示:KOSR可以从MXV培养液中去除获得MXV-K培养液,不添加KOSR的优化MXV培养液可以使512506的细胞状态更好,细胞排列紧密,脂滴消失,形态更接近人胚胎干细胞系。其他叁组主要成分虽然没有bFGF对MXV培养液那么大的影响,但去除后,512506细胞系状态仍然会变差。所以在五种成分中我们只能将KOSR去除.而针对基础培养液的简化,最终可获得两组单一的基础培养液KO-DMEM和DMEM/F12的优化MXV培养液,可以完全代替MXV培养液培养512506细胞系,获得的512506P5K和512506P5D在形态上比512506细胞系更接近人胚胎干细胞系,多能性状态与512506细胞系相似。在建系效率的研究中,实验结果显示发育至6d的体外受精胚胎在KO-DMEM培养液中贴壁率和原代克隆形成率显着高于DMEM/F12培养液,添加2i后两种培养液中的胚胎贴壁率和原代克隆形成率均下降。在KO-DMEM培养液中可获得稳定传代的细胞系,细胞形态与512506细胞系不同,无脂滴,细胞排列紧密,形态更类似与人胚胎干细胞系。细胞系呈碱性磷酸酶阳性,核型正常,表达Oct4、Sox2和Nanog,不表达Cdx2。细胞系可成功进行转基因操作。结果表明以KO-DMEM为基础培养液的优化MXV培养液体系可以获得猪类胚胎干细胞,2i不利于胚胎贴壁和原代克隆形成。该研究为猪胚胎干细胞建系培养体系选择与推断猪胚胎干细胞多能性细胞信号调控通路提供了重要的实验依据。
刘洪波[5]2015年在《基于信息熵的胚胎干细胞DNA甲基化新标记识别与表征》文中指出胚胎干细胞(ESC)具有多向分化潜能和发育的全能性。DNA甲基化在胚胎干细胞自我更新和分化过程中扮演重要角色。因此胚胎干细胞特异的甲基化新标记的识别和功能分析对于理解决定细胞命运的复杂而精细的调控网络具有重要意义。因此,整合基于重亚硫酸盐测序技术测定的发育过程中的高通量单碱基水平的DNA甲基化图谱,开发面向实验科学家的精确高效的数据库平台和生物信息学软件,系统地识别和表征胚胎干细胞特有的DNA甲基化新标记,对于深入理解胚胎干细胞的多能性维持和定向分化具有重要意义。本论文基于信息熵理论开发了定量甲基化特异性的算法,并通过随机数据和真实数据对该方法的精确性、样本适用性和资源占用等特性进行了系统评估;基于基因组相邻Cp G位点间距离依赖的甲基化相似性开发了基因组片段化的算法,进一步基于t检验开发了甲基化标记识别的统计学方法,利用Python实现了以上算法并编制了甲基化特异性分析报告软件SMART。通过与已有甲基化分析软件的比较表明了SMART在基于大样本甲基化组从头识别基因组甲基化功能区域的作用。通过整合高通量DNA甲基化数据,以胚胎干细胞为中心,以发育时间为主线,以方便实验科学家为目标,开发了小鼠发育甲基化数据库Dev Mouse。并基于信息熵理论开发集成了全自动化的在线分析和可视化工具。同时整合人类的高通量DNA甲基化数据,构建了以胚胎干细胞为中心的人类甲基化数据库Human MethyDB。两个发育甲基化数据库的构建不仅为本论文的后续研究奠定了数据基础,也有利于实验科学家方便快捷地从事发育相关DNA甲基化的生物信息学分析。基于本文开发的信息熵算法分析Dev Mouse中收录的小鼠由胚胎干细胞向脑发育过程中DNA甲基化等表观基因组学数据,结果发现了DNA甲基化与组蛋白修饰H3K27me3的共同变化。进一步识别了小鼠脑发育过程中1 341个差异甲基化的Cp G岛,发现了其与差异H3K27me3修饰Cp G岛的显着重迭。对429个差异表达基因的分析证实了DNA甲基化与其他组蛋白修饰对发育相关基因差异表达的协同调控,特别是对重编程转录因子基因和印记基因的动态调控。并揭示了基因间区Cp G岛作为新基因标记及重要调控元件的潜能。将SMART应用到Human MethyDB收集的人类DNA甲基化组,从头识别了757 887个功能片段。其中75%的片段在所有细胞类型中一致甲基化,表明了人类基因组甲基化的稳定性,分析发现一致超高甲基化片段多位于重复元件上,而一致超低甲基化片段多为基因启动子Cp G岛。对高特异甲基化片段的分析则发现胚胎干细胞特异超低甲基化不仅可以作为干细胞的稳定标记,还参与调控重要的发育基因。并利用SMART识别了人类胚胎干细胞中的3 758个DNA甲基化标记,且发现各多能性干细胞间共享更多的超高甲基化标记。利用高通量的表观基因组数据对胚胎干细胞甲基化标记进行了系统的表征。结果发现人类胚胎干细胞超低甲基化标记显着富集在发育相关功能,对长度大于3500 bp的甲基化标记的分析揭示了胚胎干细胞的特异性甲基化模式。通过组学分析发现了胚胎干细胞超低甲基化标记以细胞特异性的方式显着富集了超级增强子标记(H3K27ac和转录因子结合位点)。发现了胚胎干细胞中超低甲基化标记和超级增强子的显着重迭,识别了二者重迭的超低甲基化标记以及71个相关的多能性基因,功能富集分析揭示了这些基因的敲除可导致发育异常。人鼠间的比较分析则揭示了胚胎干细胞甲基化标记的物种保守性。综上所述,本文基于信息熵开发了甲基化分析的软件和数据库,有助于实验人员进行胚胎干细胞甲基化新标记的筛选和功能分析。对小鼠和人类胚胎干细胞的DNA甲基化新标记进行了系统的识别和表征,为深入理解胚胎干细胞的多能性维持和定向分化机制提供了新的重要参考。
赵颖, 孔庆然, 刘忠华[6]2010年在《猪胚胎干细胞研究进展》文中研究说明胚胎干细胞是一类具有在体外无限自我复制和分化为体内任何种类细胞的多潜能细胞。目前,公认的胚胎干细胞全能性判断标准包括:体内及体外向叁胚层细胞分化和二倍体嵌合后能形成生殖细胞。从1981年Kaufman等第一次分离小鼠胚胎干细胞至今,能满足这些标准的只有小鼠、大鼠和鸡的胚胎干细胞系。猪作为一种生理结构和器官的叁维结构和人都比较相似的传统药物实验模型,其胚胎干细胞系的建立一直受到广泛的关注,但是迄今为止真正的猪胚胎干细胞系(即满足上述判定标准)还未被建立起来。本文将从多个方面阐述猪胚胎干细胞系的研究进展及亟待解决的问题。猪的全基因组序列已经测序完成,相信随着干细胞研究的深入开展,对维持多能性的转录因子和细胞信号通路认识的逐步加深,建立真正的猪胚胎干细胞系将成为可能。
薛冰华[7]2016年在《胚胎来源的猪多能性干细胞系建立及其多能性改善研究》文中研究表明猪在机体大小、器官解剖结构、遗传和免疫学等方面与人类非常接近,同时猪又是全世界广泛饲养的肉用家畜,伦理限制相对较少,故猪被认为是最具潜力的生物医学模型动物,但因猪没有真正的胚胎干细胞而限制了猪在这些领域的应用。在过去的二十多年中,研究人员在人和啮齿类动物胚胎干细胞的研究基础上对猪多能干细胞的分离和培养进行了广泛地探索。猪胚胎来源的多能干细胞系的研究始于20世纪90年代初,Evans等和Strojek等将猪植入前胚胎作为原代材料,在已有的小鼠胚胎干细胞的研究基础上探讨了猪胚胎干细胞培养过程中涉及的饲养层细胞类型、胚胎胚龄、全胚或分离内细胞团对原代克隆生成的影响,并初步描述了猪类胚胎干细胞的特征。此后研究人员针对猪胚胎干细胞建系的各种影响因素进行了更为全面的研究,主要包括建系所用胚胎的胚龄、饲养层细胞的种类、胚胎接种方式、胚胎来源和培养体系等,但目前仍然面临几个以下问题:(1)获得的细胞系均为猪胚胎干细胞样的细胞系;(2)各细胞系的多能性鉴定指标参差不齐;(3)无有效的培养体系,建系效率低;(4)细胞系体内和体外分化能力弱,很难形成畸胎瘤;(5)获得的细胞系很难进行基因编辑操作,携带的外源基因不能稳定表达;(6)不能获得生殖系嵌合动物。本研究针对这些问题进行了以下四部分的探索:(1)探索氧气浓度、培养液和胚胎胚龄对猪胚胎干细胞建系所产生的影响;(2)探索猪多能干细胞的多能性特征及其体内和体外分化能力;(3)探索猪胚胎来源的干细胞是否可用于基因编辑操作;(4)探索猪胚胎来源的干细胞获得克隆动物和嵌合动物的可行性。经过对上述内容的研究,结果显示:(1)我们能够在新研发的MXV培养液和5%氧气浓度的培养体系下从5.5天的猪体外受精囊胚中分离培养获得猪多能干细胞系(porcine PluripotentStemCells,pPSCs)。pPSCs已在体外培养超过75代,其克隆形态和人胚胎干细胞相似。对pPSCs的鉴定结果表明,pPSCs呈碱性磷酸酶阳性,具有正常核型,表达经典的多能性标记OCT4、SOX2和NANGO。拟胚体自发分化的结果和畸胎瘤的结果均证明pPSCs具有体外和体内分化能力。携带外源基因fuw-Dsred的pPSCs细胞系(pPSC-FDs)能够在稳定传代的同时表达DsRed和多能性标记。把pPSC-FDs作为供体细胞用于体细胞核移植后,11.52%的重构胚胎可以在体外培养至囊胚期。将pPSC-FDs注射到4.5天的小腔囊胚中,pPSC-FDs细胞能够参与到体外胚胎的发育中,将嵌合胚胎移入到受体母猪中时,pPSC-FDs细胞能够嵌合到妊娠50天胎儿的内脏组织和胎盘组织中。(2)MXV培养液成分极其复杂,该培养环境不利于对pPSCs多能性维持机制的进一步研究,因此,我们对MXV进行优化后获得了一个新的成分明确的无血清培养基(KO培养基)。在KO培养体系中,我们可以从猪5.5天的体外受精胚胎中分离培养获得猪多能干细胞系pPSC-KOs,该细胞系多能性正常,在体外可自发分化为叁胚层细胞系,可向神经方向和成骨方向定向诱导分化,能够进行转基因操作,可嵌合到体外发育的胚胎中。综上,这些结果显示我们获得的两个猪多能干细胞系(pPSCs和pPSC-KOs)将会成为猪遗传工程和阐释猪特异性多能性调控分子机制的有效细胞系。通过对上述研究内容的总结,具体结论有:(1)通过优化影响猪胚胎干细胞建系的因素(氧气浓度,培养液和胚胎胚龄),我们培养获得了可持续传代的pPSCs,pPSCs具有与人和小鼠胚胎干细胞类似的多能性。(2)获得的pPSCs具有良好的体外和体内分化能力,能够稳定携带外源基因;将pPSCs作为供体细胞用于体细胞核移植生产克隆胚胎时,重构胚胎可以在体外培养至囊胚期;将pPSCs用于囊胚嵌合时,pPSCs具有胎盘和内脏嵌合能力。(3)通过对MXV培养液的成分逐一撤除,我们最终得到了成分明确的无血清培养基(KO),该培养体系下建立的pPSC-KOs细胞系的多能性与小鼠胚胎干细胞的多能性更相近。(4)获得的pPSC-KOs具有良好的体外自发分化和定向诱导分化能力,能够稳定携带外源基因,用作核移植供体细胞后重构胚胎能够发育至囊胚期,能够嵌合到体外培养的胚胎中。(5)不同培养体系下(MXV和KO)培养获得的猪多能性干细胞(pPSCs和pPSC-KOs)主要依赖的信号通路具有差异性,pPSCs同时依赖FGF和LIF两条信号通路,而pPSC-KOs则更倾向于依赖LIF信号通路。
陈忠尧, 曹泽宇, 黄艳, 汲婧, 陈晓芳[8]2018年在《外环境因素对体细胞重编程诱导多能干细胞的影响》文中研究指明背景:诱导多能干细胞具有广阔的应用前景,转录因子介导的细胞重编程效率较低,不利于多能干细胞的临床应用。近年来研究发现多种微环境因素对细胞重编程有显着影响,能够有效提高重编程效率,对这些因素的总结和归纳有利于建立适合细胞重编程的培养环境,促进该技术的广泛应用。目的:对有利于多能干细胞干性维持和提高细胞重编程效率的微环境因素进行归纳总结。方法:由第一作者检索Web of Science数据库2006年至今有关外环境理化因素对多能干细胞干性维持和细胞重编程影响的文章,从中挑选80篇与研究目的相关性较强,质量较高的文章进行总结。结果与结论:细胞与基质材料的黏附以及细胞间黏附不仅调控细胞的基因表达,还通过肌动蛋白骨架与核膜直接连接,影响细胞的表观遗传状态,因而可以调控细胞重编程。此外低氧、动态培养和电信号等因素也能够影响重编程效率。
杜娟[9]2015年在《SB431542对小鼠胚胎干细胞多能性的调控研究》文中研究说明胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs),是从植入前囊胚期胚胎的内细胞团(Inner Cell Mass,ICM)中分离出来的一种具有多向分化潜能的细胞。胚胎干细胞具有自我更新、无限增殖和分化形成机体所需各种类型细胞的能力,是揭示胚胎发育机制和再生医学研究的细胞模型。然而,胚胎干细胞的自我更新和分化机制尚未明确,这显着制约着胚胎干细胞在生物医学领域中的广泛应用。已有研究证实,Tgf-β信号通路能够促进胚胎的分化。但抑制Tgf-β信号通路是否有助于胚胎干细胞多能性的维持目前还存在争议。4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺水合物(SB431542)是Tgf-β-Smad2/3通路的特异性抑制剂。SB431542与Tgf-βⅠ型受体Alk4、Alk5和Alk7的ATP结合结构域结合,抑制Smad2/3的磷酸化,并阻止Tgf-β通路信号的转导。研究显示SB431542有助于胚胎干细胞多能性的维持,能够提高诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem cells,i PS)的形成效率,但相关机制尚不明确。为揭示SB431542对胚胎干细胞多能性的调控作用,明确Tgf-β信号抑制对胚胎干细胞多能性的影响,本文以小鼠J1胚胎干细胞为研究材料,利用表达谱芯片技术、高通量测序技术和一些分子生物学研究技术探究SB431542对小鼠胚胎干细胞多能性的调控作用。本文的主要研究内容和结果如下:1.无饲养层条件下,检测SB431542能否抑制Smad2/3蛋白质的磷酸化、维持小鼠ES细胞的多能性。蛋白质磷酸化Western blot和CCK-8细胞增殖检测结果显示,SB431542可抑制Smad2/3蛋白质的磷酸化,且对J1细胞的增殖活性无影响。无饲养层条件下,J1 ES细胞倾向于分化,干性促进因子BIO、CHIR99021和SC1都能增强J1 ES细胞的胞间连接作用,使其呈紧密的克隆状生长。用SB431542培养J1细胞时发现:LIF存在的条件下,SB431542能增强J1小鼠胚胎干细胞的胞间连接作用使其呈典型克隆状生长;无LIF的条件下SB431542可也可阻碍J1细胞的分化。对主要干性调控基因和分化促进基因的q PCR检测结果显示:SB431542对核心干性调控基因Oct4、Sox2和Klf4的表达无影响,但可以抑制叁胚层分化基因T、Nestin和Gata4的表达。因此,在无饲养层条件下SB431542可以抑制Smad2/3蛋白质磷酸化,也能够维持小鼠ES细胞的未分化状态。2.在基因组水平上研究SB431542对小鼠胚胎干细胞多能性的调控作用。实验用表达谱芯片技术检测了对照和SB431542处理的J1小鼠胚胎干细胞内全基因组基因的表达。基因的差异表达分析结果显示:SB431542未增强主要干性调控基因的表达,但提高了其它干性相关基因如Dppa3、Klf2和Nr5a2等的表达量;SB431542对分化相关基因如T、Fgf8和Gata4等的表达具有抑制作用。对SB431542调控基因的GO和KEGG富集分析结果显示:SB431542可通过基因转录调节、生物粘附和胞内信号传递过程调节胚胎干细胞的多能性。在信号转导过程中SB431542除影响Tgf-β通路外还可通过MAPK通路、Erb B通路、VEGF通路以及细胞粘附通路等调节小鼠胚胎干细胞的多能性。用DLR检测SB431542对不同信号通路活性的影响时发现,SB431542抑制了具有分化促进作用的JNK和MAPK/ERK的活性。此外SB431542还抑制了JAK/STAT通路的活性,这一结果与SB431542对c-Myc表达量的下调、在无LIF条件下不能维持ES细胞的未分化状态一致,说明SB431542可以抑制ES细胞的分化,但它对ES细胞的多能性也有“负作用”,不能在无LIF的条件下维持ES细胞的多能性。3.探究SB431542对分化相关通路活性的调节。SB431542可以降低Smad1/5/8通路的抑制性蛋白Smad7的表达,通过基因的体外克隆、过表达和蛋白质磷酸化Western blot检测实验发现,SB431542在降低Smad2/3蛋白质磷酸化的同时可通过抑制Smad7基因的表达激活Smad1/5/8-Id通路,最终发挥分化抑制作用。另外,SB431542对神经分化相关基因和通路有抑制作用。SB431542下调了RA通路相关基因的表达,体外用RA诱导J1细胞分化时,SB431542的添加能够阻碍J1细胞向神经细胞的分化,同时也可降低RA诱导基因的表达。另外,受SB431542调控的9个Fgf家族基因在SB431542处理的J1细胞中表达量均下调,其中包括对ERK通路具有激活作用的Fgf4。4.通过全基因组mi RNA的表达变化验证SB431542对小鼠ES细胞的分化抑制作用。SB431542处理J1小鼠胚胎干细胞24 h后,用深度测序法检测J1细胞全基因组内mi RNA的表达变化。结果显示SB431542在小鼠胚胎干细胞mi RNA的表达过程中主要发挥表达抑制作用,在SB541542调节的114个mi RNA中仅有4个mi RNA被上调。除去直接受Tgf-β-Smad2/3信号调节的mi RNA,SB431542下调的mi RNA主要是一些能够抑制多能性维持和促进胚胎干细胞分化的mi RNA,说明SB431542主要通过分化抑制维持胚胎干细胞的多能性。总之,本研究显示,LIF存在的条件下SB431542可用于胚胎干细胞的体外无饲养层培养。SB431542可以维持胚胎干细胞的多能性:ES细胞生长过程中SB431542不能增加主要干性基因的表达,但可以抑制分化相关基因、mi RNA和信号通路的活性。SB431542主要通过抑制分化维持胚胎干细胞的未分化状态。
曲纳[10]2015年在《利用CRISPR/Cas9建立Nanog-EGFP小鼠胚胎干细胞系及在培养液成分筛选中的应用》文中进行了进一步梳理胚胎干细胞因其具有体外自我更新以及多向分化的能力,成为研究基因功能、细胞治疗和组织再生等的有力工具。近年来,随着胚胎干细胞技术的发展及临床研究不断取得新的突破,胚胎干细胞在再生医学领域的价值越来越为人们所重视。1981年科学家们第一次通过饲养层体系实现了小鼠胚胎干细胞的分离以及体外培养。胚胎干细胞体外培养体系经历了一个漫长的发展阶段。2008年小鼠胚胎干细胞的N2B27+2iL培养体系被广泛应用,现己成为大多数实验室培养小鼠胚胎干细胞的首选。尽管这种培养体系可以使小鼠胚胎干细胞在体外很好地维持克隆形态以及多能性状态,但N2B27成分复杂,且成本过高；在不影响培养效果的同时简化培养液成分,使其组分更加明确,相应降低培养成本是一个重要研究方面。随着基因编辑技术的发展,使得包括干细胞在内的多个领域有了突破性的进展。从ZFNs到TALENs,再到CRISPR/Cas9;从最初由蛋白进行识别到核酸酶的识别,基因编辑技术的发展日新月异。近年来,CRISPR/Cas9技术的发展使得基因编辑研究进入了一个新的时代。它利用sgRNA对DNA特定位点的识别以及Cas9蛋白的DNA酶活性,使DNA双链产生断裂。DNA双链的断裂诱导细胞启动同源重组机制的基因自我修复,使得基因敲除和基因重组的效率大大提高,为科学研究提供了新的技术平台。本论文拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了Nanog-EGFP小鼠胚胎干细胞系,并以此为报告系统对于N2B27中有效的培养成分进行筛选。利用荧光显微镜观察,流式细胞术分析以及高内涵细胞成像系统分析等方法,我们观察到N2B27培养液中某些成分对维持胚胎干细胞多能性具有的重要作用。研究发现,胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺以及亚硒酸钠这五种成分浓度的降低,不利于胚胎干细胞干性的维持；另外Neurobasal作为最为基础的培养液之一,可能与这五种成分中的某一种共同作用,维持胚胎干细胞克隆形态。本论文不仅对研究小鼠胚胎干细胞多能性提供了新的技术平台和研究思路,对于胚胎干细胞的临床应用也具有指导意义。
参考文献：
[1]. PHLDA3通过激活GSK3β抑制体细胞重编程[D]. 乔梦然. 中国科学技术大学. 2017
[2]. mTOR和线粒体对小鼠胚胎干细胞增殖及多能性的影响研究[D]. 张丁鹏. 吉林大学. 2016
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