张明[1]2000年在《胚胎脊髓移植修复周围神经缺损的实验研究》文中研究表明目的：本实验对胚胎脊髓移植修复周围神经缺损进行可行性研究 方法：大白兔36只，分3组，每组12只。手术分别造成双侧坐骨神经缺损8mm、16mm、32mm（坐骨神经直经的4倍、8倍、16倍），左侧选用孕龄25～28天的胎兔同等长度脊髓移植桥接坐骨神经缺损，右侧选用从自体左侧切除的坐骨神经移植桥接。术前、术后抽血，测血中IL-2、IL-6、IgA、IgG、IgM含量，术前、术后值进行统计学处理；按桥接长度8mm、16mm、32mm的动物分别于术后1、2、3月作肌电图测双侧胫前肌运动神经传导速度（MNCV）、运动神经末端潜伏期（Lat）及运动神经电位波幅（Amp），统计学处理；查肌电图后原切口切开肉眼观察移植段大体情况，刺激胚胎脊髓移植段远侧坐骨神经观察动物反应；然后取材、固定、切片、染色，光镜、电镜下观察神经再生情况，双侧对比分析；取双侧胫前肌，测其湿重，双侧对比分析。每组的部分动物实验侧行荧光金（FG）及辣根过氧化物酶（HRP）逆行示踪，了解胚胎脊髓移植后神经通路情况。 结果：术前、术后兔血中IL-2、IL-6、IgA、IgG、IgM含量经统计学处理无显著差异（P＞0.05），说明动物对胚胎脊髓无明显免疫排斥反应。术后两侧胫前肌MNCV、Lat及Amp经统计学处理无显著差异（P＞0.05）。切开肉眼观察胚胎脊髓移植段外形与正常神经相 似，无明显粘连，刺激远侧坐骨神经动物有非常剧烈的疼痛和肢体收 缩反应；光镜观察移植段及远侧段神经生长良好，单位面积内有髓神 经纤维数量经统计学处理两侧无显著差异（P劝．05人 电镜显示胚胎 脊髓移植段内有大量成熟的神经纤维，雪旺氏细胞正常，基底膜完整， 髓鞘板层清晰可见，轴索内微丝、微管分布均匀；经计算机图象分析 系统处理双侧有髓神经纤维直径及髓鞘厚度无显著差异u叩．05人 双侧腔前肌湿重经统计学处理无显著差异（尸功．05人FG及HRP逆 行示踪，均可在脊髓前角发现被标记的神经元细胞。 结论：研究结果证实，胚胎脊髓移植修复周围神经缺损是可行的， 效果与自体神经移植相同。
李世德, 张明[2]2003年在《兔胚胎脊髓移植与自体神经移植修复坐骨神经缺损的比较研究》文中指出目的 探讨兔胚胎脊髓 (ESC)移植修复周围神经缺损的可能性。 方法 手术造成成年家兔双侧坐骨神经缺损 ,左侧选用胎兔脊髓桥接 ,右侧为自体神经桥接 (对照组 )。对实验动物在免疫学、电生理学、肌湿重、组织学等方面进行了检测。 结果 术后血中白细胞介素 (IL) -2、IL - 6、IgA、IgG、IgM的含量分别为 (0 .14± 0 .0 1) pg/ml、(0 .2 6± 0 .0 3)pg/ml、(0 .0 6 9±0 .0 0 4 ) g/L、(3.0 5± 0 .6 4 ) g/L、(0 .2 2± 0 .11) g/L ;神经传导速度 (NCV)为 35 .7～ 4 1.6m/s ,运动神经末端潜伏期 (Lat)为 1.31～ 1.5 1m/s,运动神经电位波幅 (Amp)为 0 .5 0～ 0 .71mV。与术前或对照组比较 ,差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。光镜、电镜观察胚胎脊髓移植段及远侧段神经生长良好 ,神经纤维数量为 15 .32～ 19.18,与对照组比较 ,差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。辣根过氧化物酶 (HRP)逆行示踪 ,可在脊髓前角发现被标记的神经元。 结论 兔胚胎脊髓移植与自体神经移植修复坐骨神经在免疫学、电生理学、肌湿重、组织学及功能恢复方面无明显差异。
张明, 李世德, 郝英[3]2001年在《兔胚胎脊髓移植修复周围神经缺损的实验研究》文中进行了进一步梳理目的 对用胚胎脊髓移植修复周围神经缺损的可行性进行研究。方法 将 3 6只新西兰家兔制成兔双侧坐骨神经缺损模型。按脊髓桥接长度分为 3组 ,每组两侧神经桥接长度不同。第 1组桥接长度为坐骨神经直径的 4倍 ,第 2组为 8倍 ,第 3组为 1 6倍 ;左侧选用胎兔脊髓桥接 ,右侧为自体神经桥接。于术后 1、2、3个月任选 2只动物行辣根过氧化物酶 (HRP)逆行示踪 ,另外 1 0只取移植段中、远段组织作透射电镜观察。结果 在兔脊髓前角 3组均发现被标记的神经元细胞。扫描电镜下见到胚胎脊髓移植段及远段有大量的正常神经纤维 ,其轴突直径、髓鞘厚度与对照侧相比 ,差异均无显著性意义 (P >0 .0 5)。结论 用兔胚胎脊髓移植修复周围神经缺损的方法是可行的。
张路[4]2014年在《表皮神经嵴干细胞修复大鼠坐骨神经缺损》文中进行了进一步梳理周围神经的缺损修复和功能重建一直是神经外科领域的难题之一。自体神经移植是目前临床上常规的治疗方法,但由于供体神经缺乏、修复长度有限、供体区域功能丧失、神经瘤和自发神经痛等问题,其临床应用受到很大限制。同种异体神经移植除了要面对以上问题外,还要克服免疫排斥反应。因此,应用组织工程种子细胞修复周围神经缺损可以为这一难题的解决提供帮助。神经嵴干细胞是一种多向潜能神经干细胞,它是周围神经系统的原基,也是Schwann cells的祖细胞。毛囊来源的神经嵴干细胞(Epidermal Neural Crest Stem Cells, EPI-NCSCs)由于取材方便,具有分化为周围神经系统神经元和胶质细胞的潜能,是一种具有良好应用前景的组织工程种子细胞。目前,在神经损伤修复领域中,EPI-NCSCs主要被应用于脊髓损伤的修复。聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly(DL-lactide-co-glycolide), PLGA)是一种人工合成生物可降解性材料,被认为是一种较为理想的人工神经支架材料。为了探讨EPI-NCSCs对周围神经缺损的修复作用,对原代培养的GFP-SD大鼠来源的EPI-NCSCs的体外性质进行了考察,并以其为种子细胞,将其等量与细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)混合后,预置入PLGA导管中,同时,以等量的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(Dulbecco's Modified Eagl's medium, DMEM)代替EPI-NCSCs作为对照,以用于修复大鼠坐骨神经10mm距离的缺失。噻唑蓝(Methylthiazolyl tetrazolium, MTT)试验结果显示,EPI-NCSCs在PLGA膜上的初期粘附率为89.7%。在第1、3、5、7天细胞相对增殖率分别为89.3%、87.6%、85.6%、96.6%。细胞周期与DNA倍体分析表明,与PLGA共培养的EPI-NCSCs与单独培养的EPI-NCSCs相比较,二者的细胞周期变化趋势相同,增殖指数变化趋势也相同。RT-PCR和荧光免疫组化分析表明周围神经组织液可以诱导体外培养的EPI-NCSCs向雪旺氏细胞分化。在神经导管移植4w,术部实现了组织学水平的修复。大鼠手术一侧后肢感觉功能有所恢复,坐骨神经指数有所提高,电生理功能的恢复。EPI-NCSCs移植能够促进腓肠肌湿重的恢复,有利于再生神经对靶组织的再支配。研究结果表明,在PLGA导管中预置EPI-NCSCs,有望实现较好的周围神经缺损的修复效果。
王敏[5]2003年在《甲状腺激素人工神经修复周围神经缺损的实验研究》文中认为周围神经损伤的修复仍然是目前临床面临的难题，寻找有效的修复方法是研究的方向之一。有些作者证实甲状腺激素是促进周围神经修复的有效和重要的因子，能刺激、调控更多的神经修复因子参与修复过程。近年来，随着材料科学的发展，越来越多的可降解材料应用在神经组织工程上。本课题结合两者思路，利用PDLLA和甲状腺激素（T3），设计甲状腺激素人工神经，用以桥接大鼠周围神经缺损，以期获得好的修复效果。实验分两部分：一、甲状腺激素人工神经的构建。二、甲状腺激素人工神经修复坐骨神经缺损的研究。第一部分实验主要是构建甲状腺激素人工神经，分析其物理特性，同时观察它对雪旺细胞的影响，共四个实验。实验一，用热致相分离法合成了甲状腺激素人工神经，并用50μg/ml的纤维粘连蛋白涂附材料内壁。扫描电镜证实该支架材料具有定向管状排列的立体结构，并对其物理特性（孔径、孔积率、分之量、密度等）进行了测定分析。实验二对甲状腺激素人工神经T3溶出度分析，证实T3能较平稳的释放，在大鼠体内不会引起全身血T3的改变，T3的测定用放免法（一步法）。实验三，观察材料对培养雪旺细胞的影响，在雪旺细胞培养皿内加入小块甲状腺激素人工神经材料，发现该材料能使雪旺细胞数增加，刺激雪旺细胞分泌更多的NGF，提高雪旺细胞的活性（MTT实验），提示该材料对雪旺细胞有正性促进作用。实验四，将培养好的密度为2×106 /ml的雪旺细胞种植在经过紫外线消毒、真空排气等预处理后的甲状腺激素人工神经上，细胞生长良好，在材料的内部也可见雪旺细胞生长。第二部分主要是动物实验，观察甲状腺激素人工神经修复SD大鼠坐骨神经1cm缺损的效果，共三个实验，首先制备动物模型，同时设立自体神经移植组和不含甲状腺激素的PDLLA组作为对照组，各组设立2周、1个月、2个月三个时相点。经辣根过氧化物酶（HRP）逆行示踪证实甲状腺激素人工神经再生的神经纤维和脊髓中枢建立了联系，轴突逆行运输恢复。实验二，对再生的神经纤维进行了组织学评价，通过电镜、HE染色、Bielschowsky神经银染、S-100免疫组化观察再生神经纤维的数量、有髓神经的数量和髓鞘厚度，经过图象分析，统计分析，结果证实甲状腺激素人工神经修复效果优于PDLLA组，但与自体神经移植组相比，仍有一些差距，效果不及自体神经移植组。实验三，对大鼠神经功能的恢复进行评价，实验通过电生理（神经传<WP=7>导速度、潜伏期）、胫前肌肌湿重恢复率、坐骨神经功能指数（SFI）三方面评价神经恢复情况，结果证实，2个月后甲状腺激素人工神经组的神经传导速度、潜伏期、肌湿重恢复率、坐骨神经功能指数指标好于PDLLA组，与自体神经移植组相比，仍有差异，但部分指标接近自体神经移植组。通过本课题的研究，主要得到以下结论：1. 构建了甲状腺激素人工神经,该神经呈立体定向管状排列结构,孔径60～100μm，孔积率达91%，每mg PDLLA含有35ngT3。具有稳定、长期释放T3的性能，文献中尚未见有类似报道。2. 甲状腺激素人工神经体内、体外降解时间均为2个月。并且在大鼠体内降解时不会引起全身T3的变化。3. 甲状腺激素人工神经刺激体外培养的雪旺细胞数量增加、活性增强、产生的NGF增加。雪旺细胞可以作为种子细胞种植在该支架上，生长良好。4. 新生的神经纤维可以通过甲状腺激素人工神经支架，起到桥接、引导神经再生的作用。5. 首次从组织学上观察了甲状腺激素人工神经修复的效果。甲状腺激素人工神经可以桥接修复大鼠坐骨神经缺损，再生神经的数量，有髓神经数量和髓鞘的厚度各项指标均好于不含甲状腺激素的支架材料组；神经传导速度、潜伏期，胫前肌肌湿重恢复率，以及坐骨神经功能指数也均优于不含甲状腺激素的支架材料组。6. 甲状腺激素人工神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果尚不及自体神经移植组，但有些指标接近自体神经移植。
李贵涛[6]2006年在《骨髓基质细胞源性神经干细胞坐骨神经和脊髓移植实验》文中提出研究背景：中枢神经和周围神经系统的形成，是胚胎发育过程中最复杂的过程。早在1908年，Tello等就发现中枢神经系统可以再生，但由于当时的证据不够充分而没有得到学术界的公认，以致于很快被遗忘。传统观点认为，成年哺乳类动物中枢神经系统是非再生性组织，分化成熟的神经细胞无法再分裂，神经元细胞损伤后不能再增殖替代死亡的细胞。神经轴突再生的能力在中枢神经系统特别是脊髓中非常差，其基本原因是脊髓轴突的再生反应性弱，中枢神经系统的微环境抑制轴突再生和胶质瘢痕的存在限制了轴突有效地再生。尽管人们已尝试用雪旺细胞、嗅束、外周神经及胚胎神经组织移植修复脊髓和周围神经损伤，并取得了一定的进展。但因细胞来源困难、无法产生新的有功能的神经元，因此，这些方法难以在临床上推广应用。神经干细胞的发现对传统观念提出了挑战，同时也为脊髓损伤的移植治疗带来了新的希望，因为脊髓损伤后，神经元死亡传导束断离，支配区完全瘫痪，现有的常规治疗技术无法使其康复，神经干细胞的移植治疗为众多瘫痪病人带来了新的希望。 目前有关神经元和神经胶质细胞的起源大多数神经生物学家接受的是“一元论”的发生机制，即神经元和神经胶质细胞来源于共同的干细胞。这种干细胞由胚胎早期室管膜上皮细胞产生并具有多向分化的潜能，故被称为多潜能神经干细胞(multipotential neural stem cell)。该种细胞通常具有下列特征：一是可自我复制和更新，产生与自己相同的子代细胞，维持稳定的细胞储备；二是处于
于振海[7]2014年在《骨髓神经组织定向干细胞源性感觉神经元移植修复周围神经感觉缺损》文中研究表明临床患者常见的腰部及下肢放射性痛多由腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄、腰骶椎不稳定等原因造成的脊神经根受压所致，严重者可以造成患肢的运动功能丧失。椎板开窗、髓核摘除、神经根减压等手术治疗，虽然可以使患者的运动功能及疼痛症状得到缓解，但患肢的麻木等感觉功能障碍却难以恢复，这成为长期困扰临床医生的棘手问题。神经损伤后感觉功能受损的主要表现是患者的痛觉、温度觉障碍以及继发性的感觉性共济运动失调。此外，感觉神经元构成神经系统反射弧的传入路径，因此还可能造成各种生理性的反射功能丧失等严重后果。如阴部神经的感觉功能缺损，可造成肛门反射异常而引起大便失禁；盆内脏神经的感觉功能缺损，可造成病人膀胱反射消失而引起尿潴留等一系列临床症状。可见，神经损伤后，修复患者的感觉功能，是提高神经修复效果、改善患者生活质量，必须重视的问题。通过再生医学移植神经干细胞修复神经损伤是公认的有效方法和手段，但目前注意点主要集中在损伤神经的运动功能恢复方面，对感觉功能的恢复缺乏重视。本课题拟通过成体干细胞源性感觉神经元移植，探讨修复感觉缺损的可能性及机制。通过再生医学移植神经干细胞的方法修复周围感觉神经缺损，首先必须解决移植细胞的种类、来源，和诱导分化为感觉神经元细胞的问题。骨髓神经组织定向干细胞（neural tissue committed stem cells，NTCSCs），是骨髓间充质干细胞的一种亚型，或组分，可以自然分化为神经元细胞。NTCSCs可来源于自体、无伦理学争议、避免了免疫排斥反应，并且取材容易，活性好，易于诱导分化，应是较为理想的移植用种子细胞来源。我们实验室前期成功分离、培养了NTCSCs，并诱导分化为神经元样细胞，用于修复周围神经缺损，取得了初步研究成果，但，由于该干细胞存在一定争议，应用研究较少涉及。Kondo T等通过Forskolin（腺苷酸环化酶激活剂）和成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF2）预诱导，再经音猥因子(sonic hedgehog，SHH)和维甲酸（retinoic acid，RA）的联合诱导，可以将C57小鼠的骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）诱导分化为特异性表达VGluT1（Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体）、calretinin（钙结合蛋白）、P2X3（ATP调控的一种离子通道受体）等谷氨酸能感觉神经元特异性标志蛋白的细胞，且可以在脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）存在的微环境中长期存活。这为我们通过骨髓NTCSCs获得大量稳定的可移植用的感觉神经元提供了借鉴依据。通过移植感觉神经元的方法修复周围神经感觉缺损，还需要找到适宜的周围神经感觉缺损的动物模型。脊神经节内聚集着假单极感觉性神经元，这种感觉神经元负责接收来自躯体和四肢的感觉信息，并进一步传递至中枢神经。背根神经节神经元是一种终末分化神经细胞，一旦死亡，不能再生，从而造成肢体的感觉功能出现异常。Helgren等采用腹腔注射过量吡哆醇的方法导致神经纤维轴索变性及背根神经节神经元的坏死。后续研究证明，通过注射过量吡哆醇制作感觉神经病动物模型的方法简单、操作性强、重复性好，是目前神经科学领域研究感觉神经病的常用模型。综上所述，本课题拟在成功制备背根神经节病变大鼠动物模型基础上，研究同种异体骨髓NTCSCs源性感觉神经元样细胞移植，修复感觉神经缺损的效果与机制，探讨成体干细胞源性感觉神经元移植，修复感觉神经缺损的可行性，为临床治疗周围神经感觉缺损提供理论和实验依据。第一部分骨髓NTCSCs源性感觉神经元的分离、培养、诱导分化及鉴定研究目的：获取移植应用所需的骨髓NTCSCs源性感觉神经元细胞。材料和方法：从成年SD大鼠骨髓组织中分离获得单个核细胞，采用先贴壁培养筛选、后无血清神经干细胞培养液悬浮培养的方式，分离、扩增出单克隆生长的NTCSCs；对得到的NTCSCs进行鉴定；扩增得到的NTCSCs采用SHH和RA等联合诱导的方法使其向感觉神经元方向分化；对得到的骨髓NTCSCs源性感觉神经元进行鉴定。结果：SD大鼠骨髓组织中的单个核细胞采用单细胞克隆、无血清悬浮培养得到大量的神经球；神经球细胞表达神经干细胞特异蛋白Nestin和组织定向干细胞特异蛋白CXCR4，同时具有MSCs表型特征：CD29（97.81%）、CD44（91.31%）、CD90（93.85%）、CD105（95.08%）、CD34（3.78%）、CD45（1.59%）；超微结构显示多个核仁、丰富的线粒体、常染色质较多等干细胞特征。神经球细胞经SHH和RA联合诱导后表现神经元样细胞外形特征，并且表达NeuN、MAP-2、β-tublinⅢ、GluR-4等蛋白；Gria4、Gria3、Calb2、Pou4f1、Tau、NeuN、MAP-2、Tubulin Ⅲ、NF、GFAP、Neurogenin2等基因表达上调，Nestin、Ret、GATA3等基因表达下调；Tau、MAP-2、NF、NSE、NeuN、Gria4等蛋白表达量增加，Nestin蛋白表达降低。结论：骨髓组织中存在NTCSCs，可以分离，并能通过细胞球悬浮培养的方法得到大量扩增；NTCSCs在SHH和RA的联合诱导作用下可以分化为具有谷氨酸能特征的感觉神经元样细胞。第二部分周围神经感觉缺损动物模型的建立研究目的：建立周围神经感觉缺损动物模型。材料和方法：成年雌性SD大鼠，体重180-220g，采用早晚两次，连续8天，腹腔注射800mg/kg/d吡哆醇盐酸盐，进行周围神经感觉缺损动物模型的制作。通过动物功能行为学、神经电生理学、受损背根神经节及坐骨神经的组织形态学观察与计量等实验方法，对得到的动物模型进行综合性评价。结果：造模后动物步态蹒跚、平衡及稳定性较差；足底温度觉和痛觉敏感度降低；坐骨神经感觉潜伏期延长，传导速度降低；背根神经节的神经元萎缩、变性、坏死，神经纤维轴索变性，排列疏松紊乱，伴有髓鞘塌陷、扭曲等。结论：通过腹腔注射过量吡哆醇的方法可以制作周围神经感觉缺损动物模型。第三部分骨髓NTCSCs源性感觉神经元移植修复大鼠周围神经感觉缺损的作用与机制研究目的：探讨骨髓NTCSCs源性感觉神经元样细胞移植修复SD大鼠周围神经感觉缺损的作用与机制。材料和方法：采用显微注射的方法，将CM-Dil标记的骨髓NTCSCs源性感觉神经元细胞，移植进入吡哆醇诱导的感觉缺损模型动物的L4、L5背根神经节内。分别于移植术后第2周、4周、8周、12周对模型动物进行行为学观察；感觉功能评测；坐骨神经电生理学检测；坐骨神经及背根神经节形态学观察及计量学分析；荧光金（FG）逆行示踪等实验方法与手段，观测移植的感觉神经元对模型动物感觉功能的修复情况。结果：移植骨髓NTCSCs源性感觉神经元后，模型动物的一般姿势、动作步态随时间的延长出现明显好转的迹象；足底温度觉和痛觉敏感度逐渐恢复；坐骨神经有髓神经纤维计数明显增加，感觉潜伏期缩短、感觉神经传导速度增加，且与时间线性相关；免疫荧光染色CM-Dil标记的骨髓NTCSCs源性感觉神经元在DRG内迁移、定植，并表达NeuN和GluR-4蛋白；DRG内检测到FG标记的神经元细胞数量显著增多。结论：移植骨髓NTCSCs源性感觉神经元可以有效修复周围神经感觉缺损。
刘勇[8]2011年在《几丁糖/聚乙烯醇神经导管修复周围神经缺损的实验研究》文中指出第一部分几丁糖/聚乙烯醇神经导管修复大鼠周围神经缺损的实验研究[研究目的]本课题通过反复冻融技术制备几丁糖/聚乙烯醇神经导管,应用几丁糖/聚乙烯醇神经导管修复大鼠坐骨神经缺损,在不同时间节点,通过组织学方法评价几丁糖/聚乙烯醇修复大鼠周围神经缺损的效果。[研究方法]选取健康SD大鼠84只,随机分成4组,每组21只。造成坐骨神经15mm缺损,然后分别用几丁糖/聚乙烯醇神经导管、聚乳酸己内酮共聚物导管、硅胶管桥接和自体神经逆行原位移植,即几丁糖/聚乙烯醇神经导管组、[P(LLA-CL)]组、硅胶管组和自体神经移植对照组。分别在术后4,8和12周对动物进行大体观察、坐骨神经功能指数检查、电生理检查、肌肉湿重、肌细胞横截面积恢复率、有髓神经纤维计数、电镜观察,和神经逆行示踪检查评价神经再生。[结果]术后所有实验大鼠均成活,未发现切口感染,所有切口均Ⅰ期愈合。术后2周,几丁糖/聚乙烯醇神经导管组3只,聚乳酸己内酮共聚物导管组4只,硅胶管组6只,自体神经移植组有2只大鼠开始出现术侧足趾红肿、溃疡,脱趾现象。术后4周,几丁糖/聚乙烯醇神经导管组再生神经已完全长过神经缺损段,导管没有出现塌陷变扁现象,再生神经直径较细;术后8周,再生神经直径变粗;术后12周,再生神经直径变粗,再生神经粘连较轻,表面血管形成丰富。坐骨神经功能指数比较:术后4周,4组大鼠之间差异无统计学意义(p﹥0.05);术后8周,几丁糖/聚乙烯醇神经导管组优于P(LLA-CL)组和硅胶管组,差异有统计学意义(p<0.05),几丁糖/聚乙烯醇神经导管组和自体神经移植组,差异无统计学意义(p﹥0.05);术后12周,几丁糖/聚乙烯醇神经导管组优于P(LLA-CL)组和硅胶管组,差异有统计学意义(p<0.05);几丁糖/聚乙烯醇神经导管组和自体神经移植组差异无统计学意义(p﹥0.05)。肌电图检查:术后4周时所有组都未检测出肌电图表现;术后8周时自体神经移植组神经传导最快,但是与几丁糖/聚乙烯醇神经导管组和P(LLA-CL)组比较,差异无统计学意义(p>0.05),波幅自体神经移植组和几丁糖/聚乙烯醇组均优于P(LLA-CL)组之间差异有统计学意义(p﹤0.05),几丁糖/聚乙烯醇神经导管组不及自体神经移植组,差异有统计学意义(p﹤0.05);术后12周时几丁糖/聚乙烯醇神经导管神经传导速度和波幅自体移植组优于P(LLA-CL)组和硅胶管组,差异有统计学意义(p﹤0.05);几丁糖/聚乙烯醇神经导管和自体神经移植组之间,差异无统计学意义(p>0.05)。肌肉湿重恢复率:术后4、8和12周几丁糖/聚乙烯醇神经导管组、P(LLA-CL)组和自体神经移植组肌肉湿重恢复率优于硅胶管组,差异有统计学意义(p﹤0.05),几丁糖/聚乙烯醇神经导管组、P(LLA-CL)组与自体移植组之间差异无统计学差异(p﹥0.05)。有髓神经纤维计数:术后12周,几丁糖/聚乙烯醇神经导管组和自体神经移植组比较差异无统计学意义(p>0.05),二组均优于PLLA-CL组和硅管组,差异有统计学意义(p﹤0.05)。再生神经纤维直径:术后12周,几丁糖/聚乙烯醇神经导管组和自体神经移植组比较差异无统计学意义(p>0.05),二组均优于PLLA-CL组和硅管组,差异有统计学意义(p﹤0.05)。髓鞘厚度:几丁糖/聚乙烯醇神经导管组、PLLA-CL组不及自体神经移植组比较差异有统计学意义(p﹤0.05),三组均优于硅胶管组,差异有统计学意义(p﹤0.05)。术后12周各组神经逆行示踪:几丁糖/聚乙烯醇组、PLLA-CL组、硅管组和自体神经移植组中,均可见到Trueblue标记的阳性神经元细胞。各组脊髓前角运动神经元计数:几丁糖/聚乙烯醇神经导管组和自体神经移植组比较差异无统计学意义(p>0.05),二组均优于PLLA-CL组和硅胶管组,差异有统计学意义(p﹤0.05)。[结论]在SD大鼠实验中,几丁糖/聚乙烯醇神经导管具有促进神经轴突再生的作用,有望成为自体神经的替代材料应用于周围神经缺损的修复。第二部分几丁糖/聚乙烯醇神经导管修复猕猴周围神经缺损的实验研究[研究目的]探讨应用制备的几丁糖/聚乙烯醇神经导管,修复猕猴周围神经缺损的效果。[研究方法]选取健康猕猴12只,随机分成3组,每组4只。造成桡神经20mm缺损,然后分别用几丁糖/聚乙烯醇神经导管桥接、神经切除旷置和自体神经逆行原位移植处理,即几丁糖/聚乙烯醇神经导管组、空白组和自体神经移植对照组。在术后8月对动物进行大体观察、电生理检查、有髓神经纤维计数,评价神经再生。[结果]术后8个月,几丁糖/聚乙烯醇组再生神经已通过神经导管长入神经缺损的远侧端,再生神经粘连较轻。肌电图检测:几丁糖/聚乙烯醇神经导管组和自体神经移植组可检测出肌电图表现,但空白对照组未检测出肌电图表现;波幅:自体神经移植组和几丁糖/聚乙烯醇神经导管组之间差异无统计学意义(p>0.05),均不及正常对侧桡神经,差异有统计学意义(p<0.05);自体神经移植组神经传导速度优于几丁糖/聚乙烯醇神经导管组,差异有统计学意义(p<0.05),均不及正常桡神经,差异有统计学意义(p<0.05)。有髓神经纤维计数:几丁糖/聚乙烯醇神经导管组、自体神经移植组不及正常桡神经,差异有统计学意义(p<0.05);几丁糖/聚乙烯醇神经导管组和自体神经移植组比较,差异无统计学意义(p>0.05),但是正常桡神经纤维直径和髓鞘厚度明显大于自体神经移植组和几丁糖复合聚乙烯醇神经导管组。[结论]在猕猴实验中,几丁糖/聚乙烯醇神经导管具有促进神经轴突再生的作用,有望成为自体神经的替代材料应用于周围神经缺损的修复。
丁坦[9]2009年在《纳米银组织工程外周神经支架对坐骨神经缺损修复的实验研究》文中研究表明周围神经缺损的修复一直是神经科学的一大难题,自体神经移植是临床上修复神经缺损常用的方法,但自体神经来源有限,难于在临床上开展应用。而异体神经或异种神经更受到免疫排斥反应的限制。近年来,应用组织工程技术构建具有良好生物相容性的支架材料修复外周神经损伤成为研究的热点。应用神经修复支架桥接神经两断端,引导神经轴突轴向生长,避免神经瘤的形成,为神经再生提供一个相对隔绝的微环境。理想的组织工程化周围神经必须具备三个基本要素:①支架:是神经轴突黏附和爬行的临时性支持结构;②种子细胞或蛋白:是促进和引导周围神经功能性再生的主要成份;③构建技术:使种子细胞或蛋白与支架完美结合,使它们的作用能够最大化,并最终替代缺失的组织。本研究以I型胶原和明胶为主要原料,并加入纳米银颗粒,通过冷冻干燥技术制备具有轴向排列微管结构的纳米银――胶原蛋白支架材料。微管直径在20—80μm,使其不仅在组成成份上,更在三维结构上高度仿生神经。这种轴向排列的微管结构,有利于引导再生轴突定向生长。材料内部均匀分布的纳米银颗粒在湿润的体内环境中表面携带正电荷,可以直接和神经细胞表面带负电的基团相互作用,有利于神经细胞的黏附。同时正电荷离子还可以吸附细胞外基质蛋白在材料内表面均匀分布,以模拟雪旺细胞基底膜对神经再生的引导作用,从而加速外周神经在支架中的修复再生过程。实验第一部分是使用I型胶原和明胶为支架原料,与不同浓度纳米银溶液混合,通过冰冻干燥技术制得多组纳米银――胶原蛋白支架。通过扫描电镜观察其内部孔径排列和机械强度测试,选取最具有仿生结构和具有较强机械强度的纳米银――胶原蛋白支架。将最优纳米银含量的胶原蛋白支架分别在体内进行降解实验和银颗粒蓄积毒性的实验,在体外进行抗菌性实验。以证明纳米银――胶原蛋白支架具有良好的抗菌性能及无细胞毒性和无体内蓄积毒性。结果证实:1.通过冷冻干燥技术制备的纳米银――胶原蛋白支架为圆柱状,其中当纳米银浓度在0～4mg/ml之间支架材料内部结构较为理想。扫描电镜观察横切面显示微管内径较均一,孔径在20～80微米,为轴向平行排列,与周围神经结构相似,可以为神经轴突的再生提供仿生引导通道。而当纳米银溶液浓度大于4mg/ml时,支架材料内部微管直径不均匀,并伴随有大量实心部分的出现,不能为神经轴突的穿行提供仿生的微环境。2.使用含不同浓度纳米银(0～4mg/ml)的纳米银――胶原蛋白支架进行微拉伸强度测试。结果含不同浓度纳米银的胶原蛋白支架在充分浸湿的情况下均能抵抗一定强度的拉伸力。根据拉伸强度公式:微拉伸强度(MPa)=最大断裂载荷(N)/材料横截面积(mm2)计算各浓度组支架材料的拉伸强度。其中含纳米银浓度为(0～2mg/ml)的胶原蛋白支架抗拉伸强度无显著差异,达到0.212～0.22MPa。而其余浓度组抗拉伸强度随纳米银含量的增加而明显下降。3.将4组含不同浓度纳米银(0～2mg/ml)的胶原蛋白支架制成薄膜状贴覆于96孔板底面,每组10孔。对照组10孔不添加。将雪旺细胞悬液均匀接种于96孔板。使用MTT法检测实验组与对照组每日吸光度值,以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制生长曲线。结果显示4组实验组与对照组雪旺细胞生长曲线在各观察时间点基本重合。证实了实验组与对照组雪旺细胞生长状态无明显差异,纳米银所含浓度不同均对雪旺细胞无细胞毒性。4.按照琼脂筛选平板法将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌标准菌落以0.5麦氏单位在筛选平皿上进行点种,后将2实验组纳米银――胶原蛋白支架(含纳米银分别为2mg/ml和1mg/ml)与不含纳米银的普通胶原蛋白支架分别贴覆在平皿中心,置于37℃培养箱中孵育24h后观察发现2mg/ml组的纳米银――胶原蛋白支架周围均明显存在抑菌环,证明2mg/ml组纳米银――胶原蛋白支架对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用。1mg/ml组纳米银――胶原蛋白支架和不含纳米银的胶原蛋白支架没有显示出抑菌作用。根据以上研究结果,认为纳米银――胶原蛋白支架抑菌能力随支架中纳米银浓度的增加而提高,含2mg/ml纳米银的纳米银――胶原蛋白支架是最理想的外周神经再生支架。5.8只大鼠被随即分成两组,将实验组纳米银――胶原蛋白支架(含纳米银2mg/ml)与对照组胶原蛋白支架(不含纳米银)共24根每组12根分别称重后植入大鼠皮下,每只3根。每间隔一个月实验组与对照组各处死大鼠一只,并取出两组共6根支架材料通过扫描电镜观察支架在体内的降解情况。通过实验观察发现实验组与对照组降解过程极为相似。在植入大鼠皮下一个月后支架内部部分管壁降解,局部融合成粗大的管腔。两个月后更多的管壁发生降解。三个月后,内部降解的更为明显,失去内部结构支撑的支架材料部分发生塌陷。四个月后支架材料结构不再完整,仅余残存。将每观察日残存支架干燥称重,实验组四个月中残存支架分别为初期重量的79.2%、59.9%、38.3%和12.3%,对照组四个月中残存支架重量分别为初期的76.9%、51.4%、33.7%和10.1%。无论是实验组还是对照组的胶原蛋白支架都可以完全降解,实验组纳米银――胶原蛋白支架降解速度略慢于对照组。无论是实验组还是对照组胶原支架均可以满足神经再生临时支架的需要。6.使用纳米银――胶原蛋白支架(含纳米银2mg/ml)通过桥接手术植入大鼠坐骨神经两断端共2组每组6只共12只,每间隔一月处死两实验组大鼠各两只,取脑、脊髓、肝和肾通过原子吸收分光光度计测定吸光度并与标准银溶液对比,观察发现三个观察日所取大鼠组织器官均不含银成分,纳米银――胶原蛋白支架被证实随材料降解而释放的银颗粒不具有造成蓄积毒性的可能。实验的第二部分:使用对神经再生具有促进作用的层粘连蛋白和纤维连接蛋白通过静电吸附的作用与纳米银――胶原蛋白支架结合,使用吸附了细胞外基质蛋白的纳米银――胶原蛋白支架修复兔及大鼠坐骨神经10mm缺损,结果证实:1.纳米银在胶原蛋白支架内部分布均匀;2.层粘连蛋白在不含纳米银的胶原蛋白支架内部分布不均匀,大量成晶体状聚集,甚至局部堵塞微管腔,不利于外周神经的再生。在纳米银――胶原蛋白支架内部,层粘连蛋白均匀贴覆在微管壁上,没有晶体状聚集,可以更好的模拟神经再生时的微环境;3.使用层粘连蛋白复合过的纳米银――胶原蛋白支架修复兔坐骨神经10mm缺损,30d后通过电生理和透射电镜等检验方法证实坐骨神经通过神经支架的引导作用已经部分成功修复。修复效果与自体移植组相比较效果相近,明显优于不含纳米银的胶原蛋白支架组。通过实验证实吸附了层粘连蛋白的胶原蛋白支架内部微管结构可以部分的模拟雪旺细胞基底膜的组成从而对外周神经的再生具有明显的促进作用。4.纤维连接蛋白作为细胞外基质的主要成分之一同样在神经的再生过程中扮演着重要的角色。根据层粘连蛋白与纤维连接蛋白结构特点将这两种蛋白分层覆盖在纳米银――胶原蛋白支架内部微管壁上。使用这种支架修复大鼠坐骨神经10mm缺损30d可以部分恢复功能。与对照组自体神经移植相比较修复效果极为近似。层粘连蛋白和纤维连接蛋白共同黏附胶原蛋白支架可以进一步仿生神经再生过程中雪旺细胞的重要作用。本实验发现了纳米银颗粒在胶原蛋白支架中通过静电吸附作用可以将对神经再生具有重要作用的层粘连蛋白均匀吸附,这使得支架内部结构可以模拟有利于神经再生的微环境从而促进神经纤维的再生。基于这种想法制得的纳米银――胶原蛋白支架对于实验动物坐骨神经10mm缺损的修复效果均接近自体移植修复效果,为外周神经组织工程化修复提供了新的实验依据。
姜俊杰[10]2003年在《坐骨神经损伤后Nogo-A在相应脊髓节段的表达》文中指出目的：通过切断及切断后再修复坐骨神经，观察在其相应脊髓节段中Nogo-A表达的变化规律，了解在周围神经损伤及修复过程中相应中枢部位Nogo-A的作用规律，为合理的选择周围神经损伤的修复方法和修复时间，有效避免Nogo-A对周围神经损伤修复的影响提供基础理论依据。 方法：选用健康Sprague Dawley(SD)大鼠150只，体重约200克，雌雄不拘，按照实验目的随机分为6组，每组25只。第一组：切断坐骨神经。第二组：切断坐骨神经，随即在手术显微镜下用10／0无创伤缝合线缝合神经外膜以修复切断的坐骨神经。第三组：切除坐骨神经1cm。第四组：切除坐骨神经1cm，随即用第三组切除之坐骨神经行同种异体神经移植。第五组：切除坐骨神经1cm，随即将切除之坐骨神经原位缝合神经外膜修复坐骨神经，模拟自体神经移植。第六组(假手术对照组)：参照以上各组手术方法显露坐骨神经但不损伤。以上各组大鼠术后每一组随机分为5组，每组5只，分别于术后24小时、48小时、1周、2周、32天处死。经左心室—升主动脉插管灌注固定，然后迅速取出相应节段脊髓，将取出的脊髓多聚甲醛固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、免疫组织化学处理，光镜观察，并对脊髓前角运动神经元行光密度测定。 结果：光镜下可见，Nogo-A在脊髓前角运动神经元胞浆内有明显 坐骨神经损伤后Nog，A在相应脊翻节段的表达表达，而细胞核内未见表达。平均光密度测定显示，坐骨神经切断、切除、切除后自体神经移植组及异体神经移植组脊髓灰质前角坐骨神经损伤侧Nogo一A表达阳性的运动神经元平均光密度较未损伤侧明显增高。其中，坐骨神经切断、切除及切除后自体神经移植组，相应损伤侧脊髓前角Nogo一A表达阳性的运动神经元平均光密度增强的规律基本相似，于伤后1、2天即出现增高，l周时达高峰，之后逐渐降低，32天时趋向正常。坐骨神经切断后立即修复组，相应损伤侧脊髓前角Nogo一A表达阳性的运动神经元平均光密度较未损伤侧无明显增强，且各观察时间点平均光密度无明显差别、而坐骨神经切除后行异体神经移植组，术后第1、2天相应损伤侧脊髓前角Nog。一A表达阳性的运动神经元平均光密度即较未损伤侧明显增高，1周时增高幅度减小，2周时达高峰，后虽逐渐降低，但至32天时仍处于较高水平。 结论:坐骨神经损伤后，脊髓相应节段损伤侧前角运动神经元胞浆内Nogo一A的表达较未损伤侧明显增强。伤后立即行端一端吻合术修复，脊髓相应节段损伤侧前角运动神经元胞浆内Nog。一A的表达基本正常，无明显表达增强改变。伤后立即行自体神经移植术，脊髓相应节段损伤侧前角运动神经元胞浆内Nogo一A的表达变化规律与不治疗组相同;而立即行异体神经移植术，早期即可加重Nogo一A表达的增强，在术后32天Nogo一A表达的增强仍维持于较高水平。
参考文献：
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[10]. 坐骨神经损伤后Nogo-A在相应脊髓节段的表达[D]. 姜俊杰. 青岛大学. 2003