杨国顺[1]2003年在《转JERFs基因提高辣椒抗病性的研究》文中认为辣椒是一种重要的蔬菜作物和调味品。但由于各种病害的危害，辣椒的产量和品质受到严重的影响。因此提高其抗病性一直是十分重要的研究课题。通过常规育种手段从现有资源中选育出多抗、高抗、优质、高产品种难度大，耗时长。伴随病原菌的侵染，病程相关蛋白基因的表达是植物产生抗病反应的标志。通过抗微生物蛋白(如病程相关蛋白)的超表达是提高作物抗病性能的策略之一，然而，单个PR基因的表达仅能导致对几种真菌病害抗性的部份增加。在系统获得抗性中，许多病程相关基因的协同表达，从而有效地提高植物的广谱性抗病性。所以应用基因工程技术提高植物抗病性的一种更加有效的方法是使许多PR基因协同性的表达。就目前的技术而言，同时导入多个基因于一个植株中有较大的困难，因此导入控制抗逆基因表达的转录因子基因可能对全面改良作物抗逆性提供一种全新的途径。植物基因工程的发展与完善，为作物的遗传改良提供了新的策略和强有力的工具，转基因技术已在200多种植物中获得成功。辣椒基因工程经过近10年的研究，已取得了一些成就，但进展缓慢，离体再生困难和遗传转化率太低是限制其发展的两大因素。为突破上述瓶颈，本研究以中椒5号甜椒和湘研10号辣椒为试材，分别就6-BA与IAA的不同浓度及组合、PA以及ABA对子叶离体再生的影响进行了较为系统的研究，建立了辣椒子叶高效植株再生体系。在此基础之上，利用GFP作为报告基因，研究农杆菌转化过程中工程菌液的pH值、共培养基中AS的浓度、共培时的温度与共培时间对转化效率的影响，建立了稳定有效的遗传转化体系。 应用上述试验体系，本研究成功地将从番茄cDNA表达文库中分离出的编码ERF型转录因子的新基因JERF10、JERF26、JERF33、JERF36(统称JERFs)导入中椒5号甜椒和湘研10号辣椒外植体(离体子叶)中，经Km筛选、PCR、Southern杂交、Northern杂交检测，获得了抗病性明显增强的转基因植株。在未实施任何胁迫的情况下，JERF33超表达的转基因植株中可见PR蛋白基因组成型表达。 本试验获得主要结果如下： 1．不定芽分化伸长期添加100 μ mol/L的PA、不定芽分化期添加0.3mg/L的ABA能显 着提高不定芽的伸长率。建立了辣椒子叶高效离体再生体系，子叶不定芽高效分化 培养基:MB+6一BA3.5~5.omg/L+IAAO.5~1.omg/L+PA(Spd，Spm)75~100 p mol/L+ ABAO.3mg/L+A gN035.omg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%;不定芽高效伸长培养基:MB+6一BAO.9 mg/L+IAAO.3mg/L+GA31.omg/L+PA100pmol/L+蔗糖3%+琼脂0.7%。2.当工程菌液的pH值为5.2时，共培养基中添加200 p MAS，在23℃的黑暗条件下 共培sd，能较明显地提高辣椒的转化效率。3.应用农杆菌介导法将‘肠舒污基因导入辣椒中，对经Km筛选的植株进行PcR检测， 其阳性率为8.1%~10.7%;对经PCR检测的阳性植株，进行PCR一Southern杂交检 测，所检测样品的阳性率为100%;进一步进行基因组DNA点杂交，阳性率为72.2%~ 77.8%;对经基因组DNA点杂交检测的阳性植株，随机抽取转刀尸侧留-刀沈月0 与川泊松二刀沈尺扮基因的各8株植株进行Northern杂交检测，了石砰了口、刀涌心J基 因的表达率分别为75%、87.5%。4.获得了对黄瓜花叶病毒、辣椒疫病与辣椒疮痴病抗性明显增强的转基因辣椒新种 质，并进一步证实在转基因辣椒中，未经任何胁迫的条件下，pROKZ一刀汲心J基因 的超表达能诱导碱性一p一葡聚糖昔酶、碱性几丁质酶、渗调蛋白、蛋白酶抑制剂、 具RNA酶活性的蛋白与防御素等PR蛋白基因的组成型表达。这些研究结果表明: .左泥尺U在转基因辣椒中的异源表达能增强植株对病毒、细菌和真菌的抗性。从这 些研究结果可推测:在经济作物中利用转录调控蛋白基因可能增加其广谱性的抗病 力。
李义良[2]2008年在《转基因杨树的分子检测及抗逆性评价》文中进行了进一步梳理杨树速生、种类繁多、分布广泛,是重要的经济树种和短轮伐期工业用材树种之一,在水土保持和维护生态平衡方面发挥着重要作用。但长期以来多以追求速生性为主要育种目标,造成培育的品种适应性和抗逆性较差,以致在我国广大的干旱、半干旱、盐碱荒地以及涝渍地区难以发挥其作用,制约了当地生态建设和经济的发展。而基因工程技术的发展,为短期内培育抗逆转基因杨树提供了可能。本文将抗干旱、耐盐碱及耐涝基因转入杨树,并对转基因植株进行了分子检测、温室抗逆性、苗圃生长性状、逆境生境生长表现等进行了评价,得到以下主要研究结果:1.转果聚糖蔗糖转移酶(SacB)基因银腺杂种杨(Populus alba×P.glandulosa)的分子检测及抗旱性评价。对53株转SacB基因银腺杂种杨抗性植株进行了Southern杂交、RT-PCR检测,结果显示有28株检测到阳性信号,表明该基因已整合到银腺杂种杨基因组中并得到表达。在此基础上,对转基因植株进行了温室干旱胁迫试验,结果表明,随着干旱胁迫时间的延长,对照植株出现叶片变黄和脱落等现象,而转基因株系叶片变得浓绿而厚重,受到的影响明显小于对照植株,在转基因株系内对干旱胁迫的抵抗能力也不同,其中T23、T72在生长量、生物量方面与对照相比差异达到显着水平。从SacB基因表达产物果聚糖含量的测定结果来看,在转基因株系的叶片中检测到了果聚糖的积累,而对照植株未检测到,这一结果初步表明可能由于果聚糖的积累提高了转基因银腺杂种杨的抗旱性。而后对移栽至苗圃的转基因株系进行了生长性状和光合参数的测定,结果表明,有5个转基因株系对于株高和地径性状均高于对照;叶间距、比叶重均超过未转化植株;同时转基因株系的水分利用效率也均高于对照植株。对内蒙古干旱区转基因杨树对比试验林生长量的观测结果表明,在测定的12个转基因株系中有9个在生长量上超过对照植株。以上研究初步表明SacB基因的导入可提高转基因银腺杂种杨的抗旱性,最终获得了抗旱性增强的转基因植株。2.转茉莉酸和乙烯应答元件结合因子(JERFs)基因银中杨(P.alba×P.berolinensis Dipple)的分子检测及耐盐性评价。对先前获得的18株转JERF基因的银中杨进行了DNA和RNA水平的分子检测,获得了13株整合并初步得到表达的银中杨植株。在此基础上,选择生长正常且表现较好的5个转化株系及对照进行了不同浓度的NaCl胁迫处理,结果发现,随着盐浓度的上升和处理时间的延长,转化株系和未转化植株在生长上均明显受到抑制,但转基因株系受抑制程度明显低于对照植株;同时转基因株系叶片内的脯氨酸和Na~+含量升高而MDA含量下降,而未转化对照植株变化相反,说明由于JERFs基因在银中杨中的表达,促进了脯氨酸含量的提高并加强了细胞膜的稳定性,进而提高了转基因银中杨的耐盐能力。移栽到苗圃后对转基因植株生长量测定结果表明,转基因株系、株高和地径均超过对照植株。另外,转JERFs基因株系叶间距相对较小,比叶重得到了提高,水分利用效率明显高于对照植株。在滨海盐碱地区和内陆盐碱地区营建了转基因杨树的对比试验林,调查结果发现,在参试的8个转基因株系中有4个在成活率、生长量方面表现优于未转化植株。初步证实JERFs基因在银中杨中的表达提高了转基因植株的耐盐性。3.转透明颤菌血红蛋白(vgb)基因银腺杂种杨的分子检测及耐涝性评价。对73株转vgb基因银腺杂种杨抗性植株进行了分子生物学检测,获得了24株转化植株。温室持续淹水胁迫试验,发现未转化植株在淹水第2d时大部分叶片出现萎蔫,第4d后下部叶片脱落,第10d地上部分变黑直至死亡,死亡率达66.7%,而转基因株系死亡率均明显低于对照。同时在涝渍胁迫下转基因植株叶绿素含量降幅低于非转基因植株,生长受抑制程度低于未转化对照植株,说明在淹水胁迫下vgb基因的表达增强了银腺杂种杨叶绿素含量的积累,进而促进了转基因植株的生长,提高了转基因株系对淹水的忍受能力。在苗圃转基因株系生长性状测定表明,转基因株系株高、地径、叶间距、比叶重均高于对照植株。对湖南汨罗高降雨区转基因杨树对比试验林生长量测定结果表明,3个转基因株系株高、地径均超过对照植株。初步获得了耐涝的转vgb基因银腺杂种杨。上述研究通过对转SacB、JERFs、vgb基因杨树抗性植株进行分子检测及温室抗逆性、苗圃生长性状、逆境生境生长表现进行评价,获得了抗逆性得到明显改良的转基因杨树,建立了转基因杨树抗逆性评价体系,对我国干旱盐碱涝渍地区的环境建设和经济发展具有重要的理论意义和应用价值,也为其它树种抗逆性状的遗传改良奠定了基础。
参考文献：
[1]. 转JERFs基因提高辣椒抗病性的研究[D]. 杨国顺. 湖南农业大学. 2003
[2]. 转基因杨树的分子检测及抗逆性评价[D]. 李义良. 北京林业大学. 2008