陈一鸣[1]1996年在《T淋巴细胞识别自体慢性髓系白血病细胞肿瘤抗原的研究》文中研究指明复发是白血病化疗或骨髓移植治疗失败的主要原因，清除体内残留白血病细胞或体外净化自体骨髓以减少回输瘤细胞是减少复发的重要策略。用白细胞介素-2(IL-2)激活的自体免疫效应细胞(LAK细胞)清除体内残留白血病细胞越来越受到重视。然而，LAK细胞对自体慢性髓系白血病(CML)细胞不能杀伤或杀伤活性很低，因而，不能用来体外净化患者的骨髓。本研究旨在运用混合培养淋巴细胞技术，用自体瘤细胞刺激和一些细胞因子扩增CML患者骨髓或外周血单个核细胞(MNC)，验证CML患者体内是否存在细胞毒T淋巴细胞前体细胞，并鉴定其表型和功能特征，分析其识别的肿瘤抗原与相应BCR-ABL融合区的关系。主要结果如下： 1．CML缓解期(n=6)和慢性期(n=10)均存在对自体(平均分别为27.5％和23.2％，中位数分别是30.1％和23.3％)和异体CML细胞(平均分别为33.0％和29.1％，中位数分别是33.5％和25.5％)有杀伤活性的T淋巴细胞，这些细胞对自体和异体正常骨髓细胞没有杀伤活性(＜10％)，对K562(分别为50.1％和40.6％，中位数是47.3％和38.4％)和Raji细胞(在慢性期平均为30.6％，中位数是28.6％)有较强的杀伤活性，对正常粒单祖细胞集落形成单位(CFU-GM)无抑制作用。LAK细胞对自体CML细胞无杀伤活性(＜10％)，对异体CML细胞有较强的杀伤活性(平均25.6％；n=4)。 2．这些T细胞是CD3~+CD56~+非主要组织相容性抗原(MHC)-限制性T细胞，以及CD3~+CD56~-MHC-限制性T细胞。用自体CML细胞刺激可增加T细胞激活标志CD25和HLA-DR的表达(n=6；p＜0.01)。 3．这些T淋巴细胞对自体CML细胞呈现较弱的增殖反应，对异体CML细胞几乎无增殖反应，对载有相应融合区BCR-ABL肽的自体缓解期EBV转染的B细胞也无增殖反应。 4．用照射过的自体CML细胞进行刺激，4周内增加的T淋巴细胞效是对照组的2.5倍(n=10；p＜0.01)；培养第四周，T淋巴细胞可扩增到320.5倍(n=10；范围85.4～560.2，中位数320.8)。 5．用生物和ELISA法检测这些T细胞能释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒系祖细胞集落刺激因子(G-CSF)和IL-2等细胞因子。 6．这些T细胞不表达BCR-ABL融合基因产物，染色体核型正常，Ph染色体阴性。
严匡华[2]2002年在《急性髓系白血病细胞体外衍生的树突状细胞诱导抗自身白血病特异性T细胞反应》文中指出目的： 体外研究3种不同的细胞因子组合诱导各型急性髓系白血病(AML)细胞分化为树突状细胞(DC)的可行性、AML细胞衍生的DC(AML-DC)的生物学特性以及AML-DC是否可诱导自体T细胞产生抗自身白血病特异性的细胞毒性反应。 方法： 去T细胞的AML骨髓或外周血单个核细胞分别在含细胞因子组合GM-CSF+IL-4、GM-CSF+TNF-α或GM-CSF+IL-4+TNF-α以及不含细胞因子的培养液中培养7～14天。在相差显微镜下动态观察培养AML细胞的形态和活力。还用台盼蓝拒染法确定细胞活力以及培养AML细胞离心涂片细胞化学染色观察细胞形态。间接或直接免疫荧光染色鉴定培养前后AML细胞的免疫表型。标准5天单向混合白细胞培养(MLC)检测培养前后AML细胞的同种异体刺激能力。异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-DX)摄入试验检测AML-DC的液相大分子吞噬功能。培养前后AML细胞与经抗CD3抗体激活过的自体T细胞在低浓度IL-2条件下共培养7天，以产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。自体T细胞取自AML患者疾病初发或完全缓解时的骨髓或外周血。间接免疫荧光法检测培养前、单用IL-2以及培养前后AML细胞刺激的T细胞的免疫表型。乳酸脱氢酶(LDH)释放实验测定T细胞的溶细胞活性。筑巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光原位杂交(FISH)检测培养前后AML细胞的特异融合基因。 结果： 21例各型AML细胞在GM-CSF+IL-4、GM-CSF+TNF-α或GM-CSF+IL-4+TNF-α作用下均发生典型的DC形态变化。上述3
刘楠[3]2000年在《慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因克隆、表达及其免疫诱导特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）杀伤功能的实验研究》文中研究说明慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，占成人白血病的20％，年发病率为10万分子1。常见的临床表现为衰弱、体重减轻、出汗、腹部异常包快形成等。慢粒的一个典型的细胞遗传学标志是至少95％的患者可见Ph染色体，后者是由9号染色体的原癌基因c-abl与第22号染色体断裂点集簇区(break point cluster)基因相互移位形成bcr-abl融合基因，其编码的p210／BCR-ABL蛋白具有增强的酪氨酸激酶及转化活性，是引起慢粒发病的主要致病因子。众多的临床及实验研究表明，
于臻[4]2016年在《白血病来源LSCs和CD4~+T淋巴细胞对BM-MSCs生物学特性的影响及其机制研究》文中研究指明研究背景：白血病(leukemia)是造血组织中某一系造血细胞受阻于特定分化阶段并克隆性扩增的造血系统肿瘤。根据白血病细胞的成熟程度及自然病程的长短,可将白血病分为急性白血病和慢性白血病,根据白血病细胞恶变的细胞系列可将其分为淋巴细胞白血病与非淋巴细胞白血病(又称髓系白血病)。急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)是儿童期最常见的恶性肿瘤,以不成熟的白细胞的过量产生和聚积为特征。ALL患儿在化疗之后,超过80%-85%可以痊愈,然而,仍有20%-30%的患儿在化疗之后,仍会出现复发,且复发后预后极差,是儿童ALL治疗面临的主要挑战。急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一类高发于成人的造血系统恶性疾病,占白血病总发病率的50%以上,以白细胞异常迅速增长、积聚于骨髓并干扰正常白细胞产生为特征。探寻不同种类白血病的发病机制对更好的治疗具有重要意义。白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)是具有分化成造血系细胞能力的肿瘤干细胞,对白血病细胞的存活、增殖、转移及复发有着重要作用,被公认为是ALL治疗失败和复发的主要元凶。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC)是骨髓微环境的重要组成部分,具有分化为特殊基质细胞的能力,并产生细胞因子、趋化因子,粘附分子和细胞外基质分子等造血过程必需的因子,因此是造血关键的调节因子。已有研究表明LSCs与BM-MSCs可相互作用,在白血病的发生发展中具有重要地位,而LSCs对BM-MSCs免疫表型和造血功能的影响及其机制目前尚不完全清楚。另一方面,BM-MSCs也被认为是机体最为重要的具有分化成多种类型成熟细胞的多能非造血干细胞,可保护肿瘤细胞发生免疫逃逸。研究显示AML来源的MSCs形态异常,骨髓微环境中MSCs的异常参与AML病理生理过程。外周血CD4+T淋巴细胞可通过接触依赖性和非接触依赖性机制对AML发挥强有力的抑制作用。而AML患者CD4+T淋巴细胞对MSCs增殖的影响目前还不清楚,其机制尚需进一步研究。目的：1.将B-ALL细胞系Nalm-6来源的LSCs与BM-MSCs共培养,评估LSCs对BM-MSCs的免疫表型和造血因子和差异基因表达的影响及其机制研究；2.研究AML患者CD4+T淋巴细胞对BM-MSCs增殖的影响及其机制研究。方法：1. B-ALL细胞系Nalm-6来源的LSCs对BM-MSCs生物特性的影响及其机制研究1.1 收集妊娠15-22周健康胎儿四肢进行骨髓样本采集和获取BM-MSCs,通过组织块培养法培养,光学显微镜和扫描电子显微镜观察BM-MSCs形态,流式细胞仪检测BM-MSCs免疫表型CD29,CD31,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90和CD105的表达。1.2使用CD34免疫磁珠分离柱从Nalm-6细胞分离CD34+细胞,定义为LSCs,与BM-MSCs共培养24h-72h,流式细胞仪检测BM-MSCs细胞免疫表型,Real-time PCR方法检测BM-MSCs造血细胞调节因子SDF-1、IL-6、IL-10、G-CSF、IL-3、IL-7、SCF、IL-11、IL-1α、IL-1p和LIF转录水平的表达。1.3 LSCs与BM-MSCs共培养24h-72h后,采用Illumina Genome Analyzer/Hiseq2000分析BM-MSCs差异表达基因。根据RNA-Seq检测结果,使用real-time PCR对表达差异的基因进行验证。1.4构建lumican过表达载体pcDNA3.1-LUM/合成lumican干扰病毒siRNA-LUM(包括siRNA437和siRNA467),使用Lipofectamine2000将pcDNA3.1-LUM质粒和siRNA-LUM载体转染进BM-MSCs中, western blot验证转染后细胞lumican蛋白的表达。1.5 BM-MSCs转染pcDNA3.1-LUM或siRNA-LUM建立lumican过表达或者抑制细胞表达系,再与Nalm-6细胞共培养,流式细胞仪检测Nalm-6细胞的细胞周期、Annexin V/PI双染法结合流式细胞仪检测Nalm-6细胞凋亡、CCK-8法检测Nalm-6细胞对VP-16的敏感性。2.AML患者CD4+T淋巴细胞对BM-MSCs增殖的影响及其机制研究2.1收集20例AML患者和20例健康外伤者的骨髓,制备和培养BM-MSCs,光学显微镜观察两个组别的细胞形态,荧光标记的抗体结合流式细胞仪检测BM-MSCs免疫表型的表达,MTT法检测细胞增殖。2.2使用免疫磁珠分离AML患者外周血CD4+T淋巴细胞,流式细胞术进行鉴定,将AML来源的CD4+T淋巴细胞与正常人来源的BM-MSCs按照0：1、5：1、10：1以及20：1的不同比例进行共培养,MTT法检测细胞增殖。2.3收集AML患者和健康人来源的外周血CD4+T淋巴细胞,提取总RNA后,real-time PCR分别检测两组CD4+T淋巴细胞miR-10a的表达；2.4分离培养健康人来源BM-MSCs,转染miR-10a mimic和miR-10a inhibitor获得miR-10a过表达或者抑制细胞系,MTT法检测细胞增殖。AML来源的CD4+T淋巴细胞转染miR-10a antagomir获得miR-10a表达抑制细胞系,real-time PCR验证转染效率后取处理后的CD4+T淋巴细胞上清与BM-MSCs共培养,MTT检测BM-MSCs增殖；2.5生物信息学软件预测miR-10a与BCL6的3’-UTR的结合,构建BCL63'UTR荧光素酶报告质粒,BM-MSCs转染miR-10a mimic或者miR-10a inhibitor后,双荧光素酶报告基因检测BM-MSCs中荧光活性,评价miR-10a和BCL6 3'UTR的结合；BM-MSCs转染miR-10a mimic和miR-10a inhibitor, real-time PCR和western blot分别检测BCL6 mRNA和蛋白的表达：2.6收集20例正常人以及20例AML患者的血清和BM-MSCs, real-time PCR检测miR-10a表达；real-time PCR检测BCL6 mRNA表达；单因素相关性分析AML患者血清miR-10a表达与BM-MSC BCL6水平的相关性。结果：1 B-ALL细胞系Nalm-6来源的LSCs对BM-MSCs生物特性的影响及其机制研究1.1收集胎儿BM-MSCs,组织块培养法培养14天后,贴壁细胞出现骨髓间充质干细胞典型形态和特征,光学显微镜下表现为“双极纺锤状”和“旋涡状”成纤维细胞样,扫描电子显微镜确定了两种形态的细胞类型。流式细胞仪分析BM-MSCs免疫表型,发现CD29,CD44,CD73,CD90和CD105呈阳性,CD31,CD34和CD45呈阴性。1.2LSCs与BM-MSCs共孵育24h-72h后,流式细胞仪分析BM-MSCs表面分子,发现仅CD44在LSCs刺激后有显著变化,其他表面标记分子CD29,CD31,CD34,CD45,CD73,CD90和CD105在处理前后均无显著差异。Real-timePCR结果显示LSCs刺激后,BM-MSCs中SDF-1和IL-6 mRNA表达水平降低,IL-10、G-CSF、IL-3、IL-7、SCF、IL-11、IL-1α、IL-1p和LIF mRNA表达水平升高。1.3 BM-MSCs经LSCs处理后,Illumina Genome Analyzer/Hiseq 2000结果显示SLC7A5和TRIB3两个基因上调,WSB1, NKTR,LUM,OGT和LENG8这5个基因表达下调,根据以上RNA-Seq分析结果,real-time PCR验证发现TRIB3表达显著上调,而LUM和LENG8基因表达显著下调,这三个基因的改变与测序得到的结果一致,其中LUM的表达在LSCs处理前后变化最大,选LUM进行下一步研究。1.4 BM-MSCs转染pcDNA3.1-LUM后,lumican蛋白表达上调,是对照组的2倍多；BM-MSCs转染siRNA-LUM (siRNA437和siRNA467)后,lumican蛋白表达下调,且与siRNA467相比siRNA437转染的BM-MSCs, lumican蛋白下调更明显,因此,我们选siRNA437转染的BM-MSCs进行下一步研究。1.5 LUM表达抑制的BM-MSCs与Nalm-6细胞共孵育后, Nalm-6细胞在G0/G1期比例显著升高,而S期、G2/M期比例下降,细胞总凋亡率下降(13.96%比7.31%)。在对VP-16敏感性的实验中,发现转染siRNA-LUM-437可显著增加Nalm-6细胞存活率,与Nalm-6组和Nalm-6+normal BMSCs组相比对VP-16的敏感性降低；LUM过表达的BM-MSCs与Nalm-6细胞共孵育后,Nalm-6细胞在G0/G1期比例略有下降,而G2/M期比例略增加,细胞总凋亡率和细胞存活率无显著变化。2 AML患者CD4+T淋巴细胞对BM-MSCs增殖的影响及其机制研究2.1分离AML患者和健康人群BM-MSCs,光学显微镜发现AML患者中BM-MSCs细胞形态较对照组更稀疏和不均匀,流式细胞仪结果显示BM-MSCs表面阳性标记物CD73,CD90和CD105的阳性率均大于98%,阴性标志物CD45,CD14,CD19,CD34和HLA-DR阳性率均小于2%,细胞增殖曲线显示AML患者来源的BM-MSCs增长较为缓慢。2.2 AML患者CD4+T淋巴细胞与健康人来源BM-MSCs按照0：1、5：1、10：1以及20：1的比例共孵育,分别在0h、12h、24h以及48h时去除悬浮T细胞,结果发现CD4+T淋巴细胞可抑制BM-MSCs的增殖,且共孵育中CD4+T淋巴细胞的比例越高,增殖能力越低。2.3 Real-time PCR检测结果显示,较健康志愿者来源的CD4+T淋巴细胞相比,AML患者CD4+T淋巴细胞中miR-10a表达水平显著上调。2.4 miR-10a过表达可显著抑制BM-MSCs增殖,而miR-10a inhibitor促进BM-MSCs的增殖。AML来源的CD4+T淋巴细胞降低MSCs生长速率,CD4+T淋巴细胞转染niR-10a antagomir后,可逆转对MSCs生长抑制作用。2.5 microRNA.org预测发现miR-10a与BCL6的3’-UTR存在结合位点；荧光素酶报告基因法结果显示miR-10a mimic组中相对荧光值显著降低,而miR-10a inhibitor组中相对荧光值显著升高,提示BCL6是miR-10a的一个靶分子。BM-MSCs中miR-lOa过表达可显著下调细胞BCL6 mRNA和蛋白的表达,niR-10a抑制可显著上调BCL6 mRNA和蛋白表达。2.6 AML患者血清-niR-10a表达较健康志愿者血清miR-10a显著升高；AML患者来源BM-MSCs的BCL6 mRNA显著下调；单因素相关性分析结果表明AML患者血清miR-10a表达与BM-MSCs BCL6 mRNA水平存在显著负相关(R2=0.5777,P＜0.05)。结论：1. LSCs使BM-MSCs表面分子CD44发生变化,LSCs与BM-MSCs的相互作用可引起造血细胞调节因子复杂的改变。2. LSCs可诱导BM-MSCs出现多个基因表达差异,LUM编码的lumican变化最大,进一步实验证实下调lumican的BM-MSCs与Nalm-6细胞共培养后可减少Nalm-6细胞的凋亡,降低Nalm-6细胞对VP-16的敏感性,增加了Nalm-6细胞的生存率。3. AML患者CD4+T淋巴细胞可通过分泌miR-10a抑制BM-MSCs增殖,其中BCL6是miR-10a一个靶基因,miR-10a/BCL6通路可能是AML来源CD4+T淋巴细胞抑制BM-MSCs增殖的可能机制之一。
耿微[5]2008年在《脐血源性T淋巴细胞对红白血病小鼠治疗的实验研究》文中认为目的:研究脐血源性T淋巴细胞(cord blood-derived T lymphocytes,CBTLs)在小鼠体内存活、浸润情况以及对红白血病(erythroleukemia,EL)小鼠的治疗作用,为深入探讨CBTLs的生物学特性及其生物治疗白血病提供实验和理论依据。方法:用密度梯度离心分离脐血单个核细胞(cord blood mononuclearcells.CBMNCs),加植物血凝集素(PHA)诱导活化为T淋巴细胞;分别经腹腔或尾静脉注射移植入正常BABL/C小鼠体内,采用免疫荧光(immunofluorescence,IMF)和免疫组织化学法(immunohistochemistry,IMC)观察CDTLs在小鼠体内的存活时间及迁移状况;建立EL小鼠模型,将CBTLs经腹腔移植入EL小鼠体内,运用免疫荧光、图象分析和透射电子显微镜等方法,观察脐CBTLs在小鼠体内的浸润状况及其对EL小鼠肝、脾形态结构的影响。结果:(1)诱导活化的细胞大部分为CD3~+T淋巴细胞,阳性率可达(83.42±1.26)%;(2)分别经腹腔或尾静脉注射人CBTLs后,第3、7、14天均可在小鼠外周血和脾中检测到人CD3~+和Brdu~+标记的T淋巴细胞,肝脏中没有发现人CD3~+和Brdu~+细胞;(3)两实验组(experimental group,EG)EL小鼠肝、脾组织中均发现CD25~+细胞散在浸润;(4)两实验组EL小鼠平均存活时间分别为27.25±7.06天和18.74±2.93天,与对照组(control group,CG)比较,均有统计学意义(P＜0.05);两实验组比较,亦有统计学意义(P＜0.05);(5)免疫组织化学显示,Caspase-3和Bc1-2主要在胞浆内表达,图像分析系统检测阳性细胞的光密度(optical density,OD)值,实验组Caspase-3表达增强,Bc1-2表达降低,与对照组较,均有统计学意义(P＜0.05);(6) Hoechst33258染色法检测显示,在荧光显微镜下见对照组细胞核荧光均匀,凋亡细胞较少;实验组部分白血病细胞呈现凋亡的形态学改变:染色质高度凝聚,致密浓染,或裂解成碎块状,边缘光滑清晰;(7)透射电镜下见对照组小鼠脾脏中白血病细胞广泛浸润;实验组部分白血病细胞呈现典型的凋亡形态学改变:核染色质浓缩、边集;核碎裂,可见凋亡小体,粗面内质网(rough endoplasmic reticulum,RER)扩张,线粒体呈现空泡样变及髓样变。结论:(1)CBMNCs经PHA诱导可得到大量T淋巴细胞。(2)CBTLs能由腹腔迁移至小鼠的外周血,并能在小鼠周围淋巴器官,如脾脏中定居,这为CBTLs在小鼠体内适当部位发挥有效的免疫应答提供了物质保证。(3)T淋巴细胞移植组EL小鼠肝、脾均发现CD25~+细胞散在浸润,表明人CBTLs能在小鼠体内活化并趋化至白血病细胞浸润部位,发挥相应的功能。(4)经腹腔注射CBTLs能延长EL小鼠存活时间,对白血病有一定的治疗作用。
罗畅如[6]2009年在《急性髓细胞白血病患者外周血T细胞TCRVβ亚家族表达及克隆性增殖分析》文中研究表明目的:探讨AML患者在初发、治疗缓解、复发等不同疾病状态下外周血T细胞及AML细胞体外诱导自体T细胞的TCR Vβ亚家族利用及克隆性增殖情况,为利用AML细胞特异性TCRVβT细胞进行细胞免疫治疗以清除微小残留病变(MRD)提供研究资料。方法:应用RT-PCR扩增11例AML白血病患者不同疾病状态下及3名正常供者外周血的TCRVβ24个家族的基因序列,通过基因扫描(Genescan)的方法判断TCRVβ家族的克隆表达、CDR3克隆性质,比较不同疾病状态下白血病患者外周血T细胞Vβ亚家族的取用、克隆性增殖、T细胞的复杂性的变化。结果:11例AML白血病患者初诊时外周血T细胞表达部分TCR Vβ亚家族,经体外诱导后TCR Vβ亚家族表达增加,完全缓解期患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族数量明显增多,但未达到完全正常,4例患者在复发时TCR Vβ亚家族表达数量明显下降。11例患者中有9例在初诊时外周血有一至两个TCR Vβ亚家族T细胞的克隆性增殖,缓解期克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞有增加趋势,在多数病例观察到部分Vβ亚家族T细胞在初发、缓解、体外诱导扩增以及复发时仍维持克隆性增殖状态。AML白血病患者初发时及5例复发患者的T细胞CDR3复杂性明显降低,呈现偏态分布,而疾病缓解时T细胞复杂性有所改善。结论:AML白血病患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族呈限制性表达,在大多数病例中,无论是疾病初发抑或缓解及体外诱导,甚至在疾病复发时均可观察到克隆性T细胞的存在,在部分病例中,某些Vβ亚家族的在上述不同疾病状态下始终维持克隆性增殖状态,部分Vβ亚家族的克隆性增殖同白血病细胞的存在相关,提示可能为白血病细胞特异性的克隆性增殖。在疾病状态下,AML白血病患者外周血T细胞的复杂性有所降低,而疾病缓解后可部分恢复。
毛建平, 陈立军[7]2013年在《临床肿瘤免疫治疗研究进展》文中提出人类免疫功能低下易导致肿瘤发生,而免疫监视和免疫逃逸机制为肿瘤免疫生物治疗提供了细胞学基础。从免疫系统中T淋巴细胞角度来看,需要从提高免疫功能、有效识别肿瘤细胞和消除抑制性因素三个方面入手,提高细胞毒性T淋巴细胞攻击肿瘤细胞的作用。本文通过分析临床治疗案例,从上述三个方面对细胞因子和免疫修饰治疗、瘤细胞裂解物接种(瘤苗接种)、T细胞基因修饰回输及结合化疗等多种生物治疗的Ⅰ～Ⅲ期临床应用情况进行了总结。并对消除T细胞抑制的信号通路、靶向肿瘤微环境和肿瘤免疫基因治疗进行了分析,以期对肿瘤生物治疗和免疫治疗提供参考和指导。
郭晓玲[8]2008年在《G-CSF诱导T淋巴细胞向TH2分化的机制研究》文中指出目的:G-CSF目前被广泛地应用于外周血造血干细胞移植,尽管在采集物的细胞中CD3+的细胞数增加了十倍,但是严重的急性GVHD的发生率并没有增加。G-CSF目前被称为具有T细胞免疫耐受作用的免疫调节因子(Mediator of T Cell Tolerance),目前对G-CSF诱导免疫耐受机制的研究主要有以下几个方面:对T细胞影响,rhG-CSF动员使Th细胞向Th2发生极化,CD4+Th细胞激活后分化为功能不同的Th1和Th2效应细胞。Th1细胞分泌IL—2、IFN—γ、TNF—β等,介导细胞免疫应答、在BMT中介导aGVHD的发生。Th2细胞产生IL—4、IL—5、IL—6、IL—9、IL—10、IL—13等细胞因子,介导体液免疫应答,在BMT中和减少aGVHD的发生有关。此外对T细胞增殖、分化、凋亡均有影响。目前仍需阐明的问题G-CSF的作用是直接作用于T细胞还是通过其他细胞因子间接的作用? G-CSF作用下,影响T细胞向TH2分化的原因有哪些? G-CSF诱导T细胞向TH2分化是受何种转录因子调控?以上问题的解决将为今天通过干预T细胞向TH2分化,降低aGVHD的发生奠定理论基础。方法:本研究采取G-CSF体内和体外刺激两种方式:体外刺激方式时,抽取健康志愿者外周血,分离单个核细胞。CD4细胞免疫磁珠分离、CD4+T淋巴细胞,在体外应用不同浓度G-CSF刺激,观测体外G-CSF对T淋巴细胞的直接作用。体内研究选取临床上进行骨髓或外周血造血干细胞移植的供者,在G-CSF动员前后采取标本,纯化CD4+T淋巴细胞,观测G-CSF体内刺激对T细胞的作用。主要的研究内容包括MTT方法检测G-CSF对T淋巴细胞增殖和抗原反应性的影响,混合淋巴细胞反应(MLR)检测T细胞的抗原反应性。FCM方法检测TH1/TH2比率。Real—time PCR检测G-CSF刺激淋巴细胞分化相关基因表达的变化。包括G-CSF受体基因(G-CSFR)、CD4+淋巴细胞分泌细胞因子的基因(IL-4、IFN-γ)一些分化调控及转录因子基因(CD28、CTLA-4、ICOS、GATA3、T-bet、FOXP3)。结果:经过CD4免疫磁珠的分离,得到的CD4+T淋巴细胞纯度在95%以上,经过G-CSF的刺激,增殖指数呈时间依赖性增高。在G-CSF处理之前最低,在G-CS处理后的4—8个小时,增殖指数开始上升,在24—48小时,增殖指数达到高峰,超过72小时,增殖指数下降。从LTT的数值和抑制率的分析中,可以表明G-CSF的刺激可以抑制T细胞对PHA的反应能力,对于应用G-CSF刺激后的CD4+T淋巴细胞,细胞的LTT值呈下降趋势,抑制率呈上升趋势。G-CSF在体内和体外刺激同样抑制T淋巴细胞的抗原反应能力,两组没有显著性差异。通过对体内、体外两组刺激方式下的CD4+T淋巴细胞的TH1/TH2分析,结果显示经过G-CSF动员,CD4+T淋巴细胞中分泌IFN-γ的TH1细胞减少,而分泌IL—4的TH2细胞增加,动员后的TH1/TH2比值显著降低。在体内的刺激还是在体外培养的细胞进行G-CSF刺激,对T细胞亚群分化的调节是没有差异的。在体外培养的G-CSF刺激下,平均表达水平升高达到统计学显著性差异的基因有IL-4、CTLA-4、GATA3;平均表达水平降低具有统计学意义的基因是IFN-γ和T-bet。TFN-γ和T-bet基因分别存在显著相关性;IL-4和GATA-3基因也存在相关性。结论:体外G-CSF的刺激可以直接作用于CD4+淋巴细胞,并使之增殖,但是对抗原反应性降低。体外G-CSF的刺激使TH1/TH2比值降低,比值的降低与转录因子GATA3表达水平的增高、T-bet基因表达水平的降低有关,以上结果表明,通过对T淋巴细胞的直接作用,G-CSF可以调节转录因子的水平,从而使T细胞向TH2方向极化,这有可能是G-CSF诱导T细胞免疫耐受的机制之一。目的:随着细胞免疫学和分子生物学的发展,细胞免疫治疗已在临床实验中开展,并取得一定的疗效。树突状细胞(简称DC)是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞(APC),细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killercells,简称CIK)作为一种新型免疫效应细胞,已经用于多种恶性肿瘤的过继免疫治疗中。DC与CIK是肿瘤免疫治疗的两个重要部分,前者识别病原、激活获得性免疫系统,后者通过发挥自身细胞毒性与分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞,二者联合抗肿瘤免疫反应的完成。本研究旨在优化现有的DC-CIK培养体系,并选择新的细胞因子诱导DC细胞向不同亚群分化。研究报道,FLT3配体(FLT3-L)作为一种细胞因子,可以成功诱导DC的生长,并对DC细胞亚群的分化有作用,它可以诱导浆细胞样DC(IPCs)的生长,增加DC的数量,增强DC的特异性。本研究旨在探讨其在诱导DC中不同亚群分化的作用,以及不同的DC-CIK共培养方式诱导的成熟CIK细胞的特异性免疫表型表达以及对肿瘤细胞杀伤活性的差异。从而为临床DC-CIK治疗提供参考。方法:实验的第一部分:应用FLT3-L刺激移植供者IPCs细胞研究细胞取自正常人外周血单个核细胞。使用FLT3-L诱导DCs成熟作为实验组,GM-CSF作为对照组,进行体外培养,并按计划分别于培养过程中行流式细胞学检查和免疫荧光定量分析,分析不同的细胞因子诱导DC的免疫表型的差异。第二部分:DC-CIK培养体系的建立和优化细胞来源有两种:EBV感染所致的噬血细胞综合症患者的外周血单个核细胞、AML-M4缓解期患者的外周血单个核细胞。EBV感染噬血细胞综合症患者DC培养过程中加入EBV抗原肽后与ClK共培养,比较是否可以培养出克隆性增强的CIK,从而提高CIK的抗瘤活性。AML-M4缓解期患者分别使用FLT3-L/GM-CSF两种细胞因子诱导培养成熟DC,同时进行DC-CIK共培养。培养前后DC分别进行细胞记数、行流式细胞学检查;培养前后ClK分别进行细胞记数、流式细胞学检查、基因扫描图谱分析、杀伤实验。通过一系列的实验分析,选择DC-CIK的最佳培养方案。结果:1关于两种细胞因子对DC诱导培养的影响实验组与对照组细胞数均随细胞培养过程逐渐减少,无明显差异。流式细胞学分析,培养前后,CD14~+细胞、CD83~+、CD80~+细胞、CD86~+细胞、CD4~+CD123~+细胞的数目都明显增多;FLT3-L培养后CD4+CD123~+细胞增加明显;比较两种细胞因子诱导培养的DC表型有显著差异,其中GM-CSF组诱导的成熟DC百分比较FLT3-L组高。2 EBV感染患者DC-CIK的培养效果的比较研究细胞生长状态及细胞记数:DC细胞培养3天后细胞数目无发生明显变化。培养第2天于倒置显微镜下可见部分细胞出现毛刺状突起,呈现半贴壁状态。CIK细胞于加入MabCD3和MabCD28后,总生长天数的第4天起出现增殖,倒置显微镜下可见细胞呈现集落样生长,DC-CIK共培养组细胞与CIK组细胞增殖速度无显著性差异,培养14天后,DC-CIK细胞数目和CIK细胞数目分别为培养前6.3倍及5.8倍。培养期内细胞存活率都在95%以上。流式细胞术细胞免疫表型分析:培养前后DC细胞表达HLA-DR+CD86+、CD83+、CD80+均明显增加;经过DC-CIK共培养,CD3+CD8+、CD3+CD56的比例均明显增加,应用空载DC-CIK和负载肽DC-CIK两种培养方式相比较,CD3+、CD8+、CD3+CD56+细胞的比例两者没有显著性差异。培养前后基因谱型图分析:分析培养前后TCRβ24个家族,除培养后负载肽DC-CIK组细胞在TCRβ5.2家族出现克隆性增强的单克隆峰外,培养后空载DC-CIK/负载肽DC-CIK组细胞在其余TCRβ24个家族谱型图中均出现高斯分布现象。杀伤实验结果(IFN-γ分泌值):表明按不同的效靶比混合后,负载肽DC-CIK组IFN-y分泌量为空载组的1.4~1.9倍左右,培养后负载肽组CIK对DC的杀伤活性明显强于空载组。3 AML-M4缓解期患者DC-CIK的培养方法比较研究应用AML-M4缓解期患者细胞,应用FLT3-L诱导DC-CIK组细胞数目和GM-CSF诱导DC-CIK组细胞数目无显著性差异,培养14天后分别为培养前6.6倍及6.2倍。流式细胞术细胞免疫表型分析:FLT3-L和GM-CSF两种细胞因子诱导产生成熟DC数目均有所增加,FLT3-L组CD4+CD123~+细胞增加高于GM-CSF组。但GM-CSF组CD3+CD56+细胞水平较FLT3-L组增高。培养前后基因谱型图分析:分析培养前后TCRβ24个家族,培养后各家族均出现高斯分布现象,比较培养后两组基因谱型图,未见明显差异。IFN-γ分泌值:培养后IFN-γ分泌值均较培养前明显增高,FLT3-L诱导DC-CIK组IFN-γ分泌值较GM-CSF诱导DC-CIK组增高33.3%。结论:1通过实验摸索,我们用缩短培养时间的14天DC-CIK共培养方法,成功培养出树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞,建立并优化了DC-CIK的培养体系。2对EB病毒感染相关性噬血细胞综合征忠者进行CIK治疗是可行的,可以作为临床辅助治疗方式,在DC的培养中加入EB病毒相关的抗原肽可以刺激T淋巴细胞产生克隆性增强的生长。3 AML患者进行DC-CIK治疗是可行的,可以作为AML缓解期病人的一种辅助性治疗方式,减少微小残留病变。4 FLT3-L与GM-CSF相比,在对DC的体外诱导培养中,也显示出了一些优越性,尤其是对IPCs的影响,
郭雪玲[9]2014年在《EGFRvⅢ多肽致敏的DC-CTL对EGFRvⅢ~+胶质瘤细胞的体外杀伤作用》文中进行了进一步梳理背景:随着肿瘤学、免疫学的迅速发展，肿瘤的免疫治疗以其副作用小、耐受性好越来越受到人们的重视，成为继手术、放疗、化疗之后治疗肿瘤的又一种方法。树突状细胞（DC）是目前已知体内抗原递呈能力最强的APC,它可以通过多种途径介导免疫反应发挥抗肿瘤的作用，以DC为基础的肿瘤免疫治疗成为目前研究的重心。表皮生长因子受体III型突变体（EGFRvIII）是表皮生长因子（EGFR）最常见的突变体，在脑胶质瘤、胃癌、乳腺癌等恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。EGFRvIII具有配体非依赖性激活下游信号传导系统以及只在恶性肿瘤细胞中表达的特性，成为肿瘤靶向治疗良好的靶点。本研究体外制备DC，负载EGFRvIII多肽后，与T淋巴细胞共培养，刺激其增殖分化为细胞毒性的T淋巴细胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL），实现CTL特异性识别EGFRvIII阳性的脑胶质瘤细胞，体外验证其靶向性杀伤作用，探索胶质瘤等恶性肿瘤免疫治疗的新方法。目的:检测人外周血中的单个核细胞体外培养分化为树突状细胞并负载EGFRvIII多肽后，诱导T淋巴细胞成为抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的能力，并验证CTL对EGFRvIII+U87胶质瘤细胞的特异性杀伤作用。方法:抽取健康志愿者的外周血，利用Ficoll淋巴细胞分离液、密度梯度离心法分离出单个核细胞（PBMC），加入细胞因子IL-4、GM-CSF诱导其分化为不成熟的DC。在培养基中加入EGFRvIII多肽，不成熟的DC摄取抗原后发育为成熟的DC，流式细胞仪测定其表型变化。从外周血获得T淋巴细胞，加入细胞因子IL-2刺激其增殖，并与成熟的DC混合培养，使T淋巴细胞不断增殖、活化为CTL。将EGFRvIII+U87细胞、U87细胞这2种胶质瘤细胞作为靶细胞加入96孔培养板中培养24小时，然后按效靶比20:1加入2种效应细胞，即用EGFRvIII活化的CTL和单加IL-2培养的T淋巴细胞，同时设置3个对照组，细胞毒试验组和对照组均设置3个复孔，培养12h后加入MTT，再继续培养4h，酶标仪测毎孔的OD值，测量波长490nm，计算杀伤率。结果：从外周血分离获得的单个核细胞培养3h后，倒置显微镜下观察，大多数细胞呈圆形、成簇排列，贴壁生长。取少量细胞计数，健康人1ml静脉血可获得1.4×106个单核细胞，吸出悬浮细胞，并加入含10%FBS、50ng/ml IL-4、500ng/mlrhGM-CSF的RPMI1640培养液。培养24h后，贴壁细胞减少，悬浮细胞增多，倒置显微镜下观察可见部分细胞聚集成团；培养48h后，细胞的形态开始变得不规则，悬浮细胞逐渐增多；3d时细胞表面伸出许多短小的毛刺样突起，体积增大，簇状生长，呈小集落样；至5、6d时DC表面的毛刺样突起较前增长、增粗，体积增大，悬浮细胞增多；培养至7d，细胞体积增大，形态各异，大小不等，有的粗短，有的细长，大部分呈悬浮生长，分布比较均匀，出现典型的树突状突起。DC的表型检测结果显示，DC的成熟性标志CD83的表达率仅为2.36%，DC的MHC-II类分子HLA-DR的表达率为54.38%，CD80的表达率为9.27%，可见此时的DC处于未成熟状态。负载EGFRvIII多肽后再检测DC的表型，结果表明DC高表达CD83、HLA-DR及共刺激分子CD80，可见未成熟的DC经EGFRvIII多肽冲击后分化为成熟的DC。成熟的DC与T淋巴细胞混合培养后，刺激T淋巴细胞不断增殖，可使CD3+CD8+T细胞比率由5.4%提高到12.7%。负载EGFRvIII多肽的DC诱导的CTL对EGFRvIII+U87胶质瘤细胞的杀伤率（45.214.53）%明显高于单加IL-2培养的T细胞的杀伤率（12.302.15）%，差异较显著有统计学意义（P<0.01）；负载EGFRvIII多肽的DC诱导的CTL对U87细胞的杀伤率为（14.483.50）%，与单加IL-2培养的T细胞的杀伤率（18.104.16）%相比差异不显著（P>0.05）。结论：负载EGFRvIII多肽的DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL），具有特异性识别和杀伤EGFRvIII+U87胶质瘤细胞的功能，为胶质瘤的免疫治疗奠定了一定的实验基础。
郭含梦[10]2018年在《MDS、AML患者T淋巴细胞和相关细胞因子表达水平的初步探讨》文中研究说明目的:通过检测骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓系白血病(AML)患者的外周血T淋巴细胞以及其分泌的相关细胞因子表达水平的变化,研究此两种疾病免疫状态的区别并指导治疗。方法:采用流式细胞微球芯片捕获术(CBA)及流式细胞术检测20例骨髓增生异常综合征患者[MDS组,难治性贫血(RA)与难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)各10例]、15例急性髓系白血病患者(AML组)和10名健康体检者(正常对照组)外周血中调节性T细胞(Treg)、白介素-2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-17(IL-17)的表达水平,间接评价各组T淋巴细胞免疫状态,并作比较。结果:与正常对照组相比,RA组TNF、IL-17、IL-2、IFN-γ的表达水平较正常对照组高且差异有统计学意义(P<0.05),IL-10的表达水平较正常对照组低且差异有统计学意义(P<0.05),Treg、IL-6、IL-4的表达水平较正常对照组差异无统计学意义;RAEB组与AML组Treg、IL-10、IL-6、IL-4的表达水平较正常对照组高且差异有统计学意义(P<0.05),TNF的表达水平较正常对照组低且差异有统计学意义(P<0.05),IL-17、IL-2、IFN-γ的表达水平较正常对照组差异无统计学意义。与MDS-RA组比较,MDS-RAEB组和AML组TNF、IL-17、IL-2、IFN-γ的表达水平均较低(P均<0.05),而Treg、IL-10、IL-6、IL-4的表达水平均较高(P均<0.05)。结论:不同时期的MDS和AML病患者其免疫状态并不相同,低风险MDS因负性调节因子过多导致细胞凋亡引起骨髓的造血功能出现衰竭,而高风险MDS及AML则是免疫抑制以及免疫逃逸增加,肿瘤细胞不断积聚导致正常造血功能障碍。因此,骨髓增生异常综合征的发生发展中存在免疫系统的参与,我们需要重视免疫调节疗法的价值。
参考文献：
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[2]. 急性髓系白血病细胞体外衍生的树突状细胞诱导抗自身白血病特异性T细胞反应[D]. 严匡华. 中国协和医科大学. 2002
[3]. 慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因克隆、表达及其免疫诱导特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）杀伤功能的实验研究[D]. 刘楠. 第四军医大学. 2000
[4]. 白血病来源LSCs和CD4~+T淋巴细胞对BM-MSCs生物学特性的影响及其机制研究[D]. 于臻. 山东大学. 2016
[5]. 脐血源性T淋巴细胞对红白血病小鼠治疗的实验研究[D]. 耿微. 潍坊医学院. 2008
[6]. 急性髓细胞白血病患者外周血T细胞TCRVβ亚家族表达及克隆性增殖分析[D]. 罗畅如. 广州医学院. 2009
[7]. 临床肿瘤免疫治疗研究进展[J]. 毛建平, 陈立军. 国际药学研究杂志. 2013
[8]. G-CSF诱导T淋巴细胞向TH2分化的机制研究[D]. 郭晓玲. 中国人民解放军军医进修学院. 2008
[9]. EGFRvⅢ多肽致敏的DC-CTL对EGFRvⅢ~+胶质瘤细胞的体外杀伤作用[D]. 郭雪玲. 河南大学. 2014
[10]. MDS、AML患者T淋巴细胞和相关细胞因子表达水平的初步探讨[D]. 郭含梦. 安徽医科大学. 2018
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