王晓莉[1]2007年在《高压氧治疗促新生大鼠缺氧缺血性脑损伤内源性神经干细胞的增殖、迁移与分化及其机制研究》文中进行了进一步梳理新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指围产期窒息缺氧导致脑的缺氧缺血性损害,而出现的一系列中枢神经异常的表现(新生儿学组,2005),是围产期足月儿脑损伤的最常见原因(Triulzi,2006),常可引起不可逆的组织损伤,从而引起脑瘫、癫痫、智力低下等严重后遗症,给家庭社会带来沉重的负担。虽然目前HIE的发病机制研究取得了很大进展,但临床上仍以对症、支持、综合治疗为主,缺少特异性治疗的方法,因此,寻找一种治疗HIE行之有效的方法是一件十分有意义的事。干细胞治疗与高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)治疗是目前认为比较有效的两种治疗方法。干细胞技术在最近几年取得了重大突破,并已成为国内外生物及医学领域研究中的热点。干细胞治疗又可分为内源性NSCs(Neural stem cells,NSCs)原位激活和外源性干细胞移植两大类,内源性NSCs没有外源性干细胞带来的免疫排斥、伦理学道德问题,更适合于临床运用。内源性NSCs终生存在于侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)和海马齿状回(dentategyrus,DG)等脑内某些特定的区域(Gage,2000),当损伤发生时这些内源性NSCs可被激活,对损伤的脑组织起到修复作用(Maslov,2004)。已有人报道,新生大鼠在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic—ischemic brain damage,HIBD)后脑内源性NSCs有增殖和分化现象(Hayashi,2005)。但大脑自身的这种修复能力毕竟是有限的,如果能够设法扩大机体的这种自身修复能力将为干细胞治疗带来广阔的前景(Felling,2006)。HBO作为目前一种比较有效的治疗方法,用于治疗新生儿疾病,特别是HIE已有多年历史,但由于缺乏科学的理论依据和对毒副作用的误解,在临床应用中有争议。目前多数动物研究认为HBO对HIE治疗有效,可减轻神经元损伤,促进远期功能的恢复(Badr,2001;Calvert,2002;Calvert,2003;Veltkamp,2004);国内大量临床报道也表明HBO可以降低HIE的伤残率和病死率(胡电,2004:盖勇,2005)。我们最近的实验发现(余小河,2006)HBO治疗HIBD新生大鼠时,脑内内源性NSCs有增多的现象,提示HBO的治疗作用可能与激活内源性NSCs的增殖有关,但其增殖的过程、分化为何种神经细胞以及这些增殖的细胞能否迁移到脑损伤部位并真正起到代偿作用等问题,目前尚不清楚。如能弄清楚这些问题将为HBO治疗HIBD提供可靠的理论依据。治疗时间窗是影响HBO疗效的重要因素,人们在HBO治疗成体大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的时间窗方面已做了大量的研究(Lou,2004;Badr,2001),认为脑损伤后6小时内HBO治疗,可有效减轻梗死灶并能改善远期行为学,但是由于新生大鼠处于发育阶段,其研究较为复杂,在HBO治疗新生大鼠HIBD的时间窗方面的研究甚少。根据成年大鼠MCAO模型的研究结果,HBO必须在发病后的6小时内开始治疗才有效(Bard,2001;Yin,2002;Lou,2004;Zhang,2005),然而这6小时的时间窗太短,在临床上很难在起病后的6小时内即开始HBO治疗,因此限制了HBO治疗在新生儿HIE中的广泛应用。故探讨HBO治疗HIBD的时间窗具有重要意义。Wnt信号与神经发生密切相关,Wnt信号的激活可以促进NSCs的增殖与分化(Inoue,2006;Hirabayashi,2005;Inoue,2004;Lie,2005),研究还发现Wnt途径参与脑损伤后损伤组织的修复(Chong,2004),故推测:HBO治疗促进内源性NSCs的增殖是否与Wnt信号有关呢?解决这一问题将为HBO治疗HIBD新生大鼠提供有力的理论依据,并为更好地促进NSCs增殖治疗HIBD指明方向。本实验分为以下叁部分:一、高压氧治疗促进缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞的增殖、迁移与分化目的:探讨HBO治疗对HIBD新生大鼠脑内源性NSCs增殖、迁移及分化的影响,为HBO治疗的临床应用提供理论依据。方法:7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为正常对照(CON)组,缺氧缺血脑损伤组(HIBD)及高压氧组(HBO治疗:压力为2个绝对大气压,稳压1 h,每日一次,连续7天)。采用经典的Rice-Vannucci法制成HIBD模型,HBO组在HIBD后3 h内进行HBO治疗。分别于HIBD后6 h,24 h,3 d,7 d,14 d,采用BrdU/nestin免疫荧光双标法动态检测缺血侧侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)、海马齿状回(dentate gyrus,DG)增殖的内源性NSCs的动态变化。Westem blotting法检测缺血侧大脑半球nestin蛋白的动态变化。BrdU/DCX免疫荧光双标法检测SVZ区增生的未成熟神经元及其脑损伤区的迁移;BrdU/β-tubulin,BrdU/GFAP,BrdU/O_4免疫荧光双标法检测大脑皮层新生的神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞,并计算各新生神经细胞的分化比率。HIBD后28d,采用HE与Nissl染色法检测脑组织的病理变化,并应用免疫组化法检测胼胝体、纹状体髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达。结果:HBO组SVZ区与DG区BrdU~+Nestin~+细胞分别于HIBD后6 h与24 h显着增加,7 d时达所观察时间点的最高水平,并显着多于各对照组(P＜0.01),14 d时,BrdU~+Nestin~+细胞数开始下降,仍多于各对照组(P＜0.01);nestin蛋白的Western Blotting分析发现缺血侧大脑半球nestin蛋白于HIBD后24 h开始增加,HIBD后7 d达最高水平,后下降;HIBD后7 d,HBO组SVZ区BrdU~+ DCX~+细胞表达显着增加且高于CON组与HIBD组(P＜0.05),14 d时SVZ区表达减少,同时在缺血侧大脑皮层发现BrdU~+ DCX~+细胞,占皮层BrdU~+细胞的72.4±6.2%,显着多于对照组(P＜0.01;F=13.11);HIBD后28 d,HBO组缺血侧大脑皮层神经元分化比率与少突胶质细胞分化比率均高于对照组(P＜0.05),星形胶质细胞的分化比率较低,HBO组缺血侧大脑神经元及髓鞘损伤明显减轻。结论:高压氧可以促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖,增殖的NSCs迁移至损伤侧的大脑皮层,并分化成为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞,修复脑损伤。二、高压氧治疗新生大鼠HIBD的时间窗目的:从HBO治疗促进内源性NSCs增殖的角度探讨HBO治疗新生大鼠HIBD的最佳时间窗。方法:采用经典的Rice法制成HIBD模型。7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为正常对照(CON)组,缺氧缺血脑损伤组(HIBD)及高压氧组(HBO,其治疗方法同前),HBO治疗组HBO开始治疗的时间分为5个亚组:1)HBO-3 h组、2)HBO-6h组、3)HBO-12 h组、4)HBO-24 h组、5)HBO-72 h组,每亚组20只。HIBD后10 d,BrdU/nestin免疫荧光双标法检测各组大脑SVZ区内源性NSCs的增殖情况,Western-blotting法检测各组nestin蛋白的表达变化;至22日龄开始对各组动物进行T迷宫试验、放射性迷宫测试、足错误行为学测试;行为学结束后,尼氏染色法检测每马CA1区锥体细胞密度变化。结果:BrdU/nestin免疫荧光双标结果发现:HIBD后24 h内给予HBO治疗,SVZ区有大量的BrdU~+nestin~+细胞,即新增殖的内源性NSCs,以3 h内HBO治疗组增殖最明显(128±16个/mm~2)。与此同时,Western blotting法检测缺血侧(左侧)脑nestin蛋白的表达,发现HIBD后24 h内给予HBO治疗,nestin蛋白表达显着高于HIBD组;T迷宫试验、放射性迷宫测试、足错误测试结果均表明HIBD后12 h内给予HBO治疗组均疗效显着;尼氏染色法显示HIBD后12 h内HBO治疗,海马CA1区神经元丢失较HIBD组显着减少。结论:HBO治疗时间窗延长至HIBD后12 h仍可促进内源性NSCs增殖,减轻神经元损伤;延长至72 h以后,HBO治疗疗效不显着。叁、高压氧治疗通过Wnt信号途径促进HIBD新生大鼠脑内NSCs的增殖目的:检测HBO治疗后HIBD新生大鼠内源性NSCs与Wnt信号途径重要蛋白Wnt-3、β-catenin蛋白的动态变化,并进行其相关性研究,从而探讨HBO促进内源性NSCs增殖的机制。方法:7日龄SD新生大鼠采用经典的Rice法制成缺氧缺血脑损伤(HIBD)模型,结扎左侧颈总动脉,8%O_2缺氧2 h,在HIBD后3 h内给予HBO治疗。免疫荧光双重染色法动态检测HIBD后6h,24 h,3 d,7 d,14 d,新生大鼠缺血侧室管膜下区(Subventriculaurzone,SVZ)nestin/Wnt-3,nestin/β-catenin蛋白的表达,激光共聚焦显微镜分析其荧光强度,并分别行Wnt-3与nestin,β-catenin与nestin荧光强度的相关性分析;western-blotting法检测缺血侧脑组织各时间点nestin,Wnt-3,β-catenin总蛋白及β-catenin核蛋白的表达。结果:免疫荧光双标结果发现:各组SVZ区均可见nestin~+Wnt-3~+及nestin~+β-catenin~+细胞。HIBD后6 h,HBO治疗组NSCs(nestin~+细胞)的细胞膜可见Wnt-3蛋白表达开始增加,HIBD后3d,5 d,7 d Wnt-3蛋白达较高水平,显着高于对照组(P＜0.05),HIBD后14 d,Wnt-3蛋白表达显着减少(P＜0.01);HIBD后24 h,HBO治疗组NSCs(nestin~+细胞)内β-catenin蛋白表达开始增加,主要位于胞浆表达,仅见少量胞核表达,HIBD后3 d,胞质内β-catenin蛋白积聚、活化并开始向细胞核内转移,HIBD后5 d,7 d细胞核内β-catenin蛋白维持较高水平并显着高于对照组(P＜0.01),HIBD后14 d,β-catenin蛋白表达显着减少;HBO治疗组nestin蛋白于HIBD后24 h表达开始增加,HIBD后7 d达较高水平,显着高于对照组(P＜0.05),后下降。HBO治疗组nestin蛋白荧光强度分别与Wnt-3及β-catenin蛋白荧光强度呈直线相关。Western Blotting分析发现HBO治疗组Wnt-3蛋白于HIBD后3 d、5 d与7 d达较高水平,β-catenin蛋白于HIBD后5d、7 d达较高水平,nestin总蛋白分别于7 d达较高水平,β-catenin核蛋白于HIBD后5 d达较高水平,均显着高于对照组(P＜0.05);HIBD后14 d,各蛋白水平开始下降。结论:高压氧治疗促进内源性NSCs增殖的机制与Wnt信号途径中Wnt-3蛋白表达的增加及β-catenin蛋白的活化相关。综上所述,本研究结论如下:1.首次发现HBO治疗可以促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖、迁移并分化成为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞,从而修复脑损伤。2.从HBO治疗促进HIBD新生大鼠内源性NSCs增殖的角度探讨HBO治疗HIBD的时间窗,并发现HBO治疗的时间窗可以延长至HIBD后12 h,大大括宽了治疗时间窗,为HIBD的治疗赢得了时机。3.从Wnt信号途径探讨HBO促进HIBD新生大鼠内源性NSCs增殖的机制,并发现HBO促进内源性NSCs的增殖与Wnt-3蛋白的增加、β-catenin蛋白的活化成直线相关,为HBO治疗HIBD提供了可靠的理论依据,并为更好地促进内源性NSCs的增殖治疗HIBD指明了方向。
胡琳燕[2]2008年在《丹参诱导骨髓间充质干细胞神经性分化治疗新生鼠缺氧缺血性脑损伤》文中指出目的探讨丹参诱导骨随间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)分化为神经样细胞优化方案可行性及分化后的神经样细胞是否具有神经生理功能。方法取4～5代状态好的MSC加入含10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)及10 ng/ml的碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)的培养基预诱导24 h,更换为含60 mg/L丹参液和10 ng/ml bFGF的无血清培养基(诱导液)诱导2 h,加FBS(工作浓度为10%)进行去分化,约24 h后再次更换为诱导液诱导3 h,如此重复4~5次,且每次诱导时间较前延长1 h,诱导后分别进行免疫荧光细胞化学,细胞膜电位(Membrane potential, MP)、细胞内钙流以及神经突触循环功能检测。以50 mmol/L的KCl作为诱发动作电位刺激因子,采用激光共聚焦显微镜(Laser-scanning confocal microscope, LSCM)对DiBAC4(3)、Fluo-3/AM、SynaptoRed C-2进行荧光激发,检测分化神经细胞对细胞外高钾刺激下细胞膜电位变化,胞内钙流变化及细胞突触循环功能。结果加入预诱导液24 h内,MSC形态未见明显改变;更换为诱导液诱导2 h即可见部分MSC开始收缩,伸出突起,向神经性细胞形态转变,5次诱导6小时后,细胞胞体继续缩小,突起拉长交互成复杂网状;免疫荧光细胞化学显示未经处理的MSC神经元巢蛋白(Nestin,神经干细胞特异性表面标志)表达率为(41.6±3.3)% ((x|-)±s, n=3),第1次诱导2 h后,Nestin表达率高达(98.1±1.5)% ((x|-)±s, n=3),但不表达神经微丝蛋白(Neurofilament protein, NF,成熟神经元表面标志)、TUJ-1(成熟神经元表面标志)及突触小泡蛋白(Synaptophysin,成熟神经元表面标志),也不表达胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein, GFAP,星形胶质细胞表面标志);第4次诱导1 h后即突触Synaptophysin,表达率(95.3±1.6) % ((x|-)±s, n=3),5 h后Synaptophysin表达更为广泛。5次诱导6 h后的神经样细胞TUJ-1、NF、Synaptophysin均表达阳性,TUJ-1表达率为(96.6±2.4)% ((x|-)±s, n=3),NF表达率为(96.7±2.8)% ((x|-)±s, n=3),Synaptophysin表达率为(96.2±2.1)% ((x|-)±s, n=3)。膜电位检测显示加入高浓度KCl后,神经样细胞胞内荧光强度瞬时增强,膜电位变化曲线发生瞬时陡升,而MSC未发生任何变化,曲线保持于水平线。钙流检测显示神经样细胞受高钾刺激前,其胞内钙流在小范围内波动,被高钾刺激后,荧光强度瞬时增强,增强幅度远高于刺激前,说明胞内钙流增强。突触循环检测显示神经样细胞首次被高钾激发后细胞被SynaptoRed-C2染色发出红色荧光,当再次被高钾激发后细胞荧光强度降低,细胞在两次高钾刺激后发生胞吞胞吐作用。结论丹参反复多次诱导MSC神经性分化的优化方案可高效快速诱导MSC分化为具有神经电生理的神经样细胞。目的探讨丹参对缺氧缺血性脑损(Hypoxic ischemic brain damage, HIBD)新生鼠内源性神经干细胞(Neural stem cells, NSC)迁移及分化的影响。方法对6日龄新生大鼠腹腔注射5-溴脱氧尿苷嘧啶(5-bromo-2 -deoxyuridine, BrdU)以标记内源性NSC,于7日龄时制备为缺氧缺血性脑病(Hypoxic ischemic encephalopathy, HIE)动物模型,并于当日起连续5天腹腔注射60 mg/kg丹参进行干预,对照组腹腔注射同等剂量的生理盐水。分别于大鼠发生HIBD后3天、2周及4周后处死动物,进行TTC染色、BrdU免疫组织化学检测及BrdU/Nestin、BrdU/GFAP、BrdU/TUJ1免疫荧光双标检测。结果TTC染色可见HIE丹参干预组脑组织坏死程度远小于HIBD生理盐水对照组。假手术组左右大脑半球BrdU阳性细胞数分别为214.86±14.07((x|-)±s, n=8)和215.63±15.98((x|-)±s, n=8),两侧没有显着性差异(P>0.05);HIBD生理盐水对照组左右脑半球BrdU阳性细胞数分别为260.88±18.89((x|-)±s, n=8)和44.38±7.65((x|-)±s, n=8),两侧有明显差异(P<0.05);丹参干预组左右脑半球BrdU+细胞数分别为317.25±22.66((x|-)±s, n=8)和44.38±7.65((x|-)±s, n=8),两侧有显着性差异(P<0.05);叁组间左右脑内BrdU+细胞数均有明显差异(P<0.05),叁组间全脑BrdU+细胞数分别为430.50±25.12((x|-)±s, n=8),335.75±24.12((x|-)±s, n=8),361.63±27.02((x|-)±s, n=8),叁组间均具有显着性差异(P<0.05)。假手术组中左、右脑内BrdU+细胞数占全脑比例分别为0.50±0.02((x|-)±s, n=8)和0.50±0.02((x|-)±s, n=8),无显着性差异(P>0.05);生理盐水对照组中左、右脑内BrdU+细胞数占全脑比例分别为0.22±0.03(±s, n=8)和0.78±0.03((x|-)±s, n=8),具显着性差异(P<0.05);丹参干预组中左、右脑内BrdU+细胞数占全脑比例分别为0.12±0.01((x|-)±s, n=8)和0.88±0.01((x|-)±s, n=8),具显着性差异(P<0.05)。假手术组BrdU+细胞Nestin、GFAP、TUJ-1的表达率分别为(77.75±5.65)%((x|-)±s, n=8),(12.17±3.32)%((x|-)±s, n=8),(4.14±1.36)%((x|-)±s, n=8),HIE生理盐水对照组BrdU阳性细胞Nestin、GFAP、TUJ-1的表达率分别为(63.19±5.37)%((x|-)±s, n=8),(19.75±3.49)%((x|-)±s, n=8),(8.12±2.01)%((x|-)±s, n=8),HIBD丹参干预组BrduU+细胞Nestin、GFAP、TUJ-1的表达率分别为(44.81±5.02)%((x|-)±s, n=8),(23.93±2.88)%((x|-)±s-, n=8),(22.12±2.50)%((x|-)±s, n=8),叁组间叁种蛋白表达率均具显着性差异(P<0.05)。结论丹参可以保护脑组织免遭缺氧缺血的进一步脑损害,并可促进脑内BrdU+细胞迁移至脑坏死区,并提高其神经性分化率。目的探寻骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)移植治疗新生鼠缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic ischemic brain damage, HIBD)的最佳时间点。方法建立新生鼠缺氧缺血性脑病( Hypoxic ischemic encephalopathy, HIE)动物模型,在新生鼠发生HIBD后4个时间点(2 h,24 h,3 d,6 d)处死动物迅速取脑,去除嗅球及小脑部分进行匀浆,酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测匀浆上清液中碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)含量,相应日龄的假手术组大鼠作为对照。选取4～5代状态好的MSC对发生HIBD后2 h、24 h、3 d、6 d的新生鼠进行腹腔注射移植,4周后进行水迷宫行为学检测。结果ELISA检测结果显示HIBD模型组在发生HIBD后2 h、24 h、3 d、6 d 4个时间点脑组织bFGF的含量分别为(pg/ml):66.25±36.13 ((x|-)±s, n=8)、71.25±31.88 ((x|-)±s, n=8)、113.13±31.41 ((x|-)±s, n=8)、105.63±43.28 ((x|-)±s, n=8),各时间点比较无显着性差异(p>0.05),仍呈上升趋势。假手术组对应的时间点脑组织bFGF的含量分别为(pg/ml):214.38±37.03 ((x|-)±s, n=8),131.25±32.50 ((x|-)±s, n=8),99.38±40.47 ((x|-)±s, n=8),96.25±49.06 ((x|-)±s, n=8),呈逐渐下降的趋势,其中对应的2 h组明显高于其他各个时间点(p<0.05)。MSC移植4周后水迷宫检测结果显示:在定位航行实验中HIBD后2 h移植组(A组)、HIBD后24 h移植组(B组)、HIBD后3 d移植组(C组)、HIBD后6 h移植组(D组)、假手术组(E组)、HIBD空白对照组(F组)逃避潜伏时间分别为(s):18.29±3.10 ((x|-)±s, n=8)、46.63±6.48 ((x|-)±s, n=8)、44.28±6.09 ((x|-)±s-, n=8)、22.07±4.39 ((x|-)±s, n=8)、16.22±3.14 ((x|-)±s, n=8)、67.49±4.15 ((x|-)±s, n=8),E组及各移植组逃避潜伏时间均明显低于F组(p<0.05),A组与E组比较无明显差别(p>0.05),且明显低于其它各组(p<0.05),D组逃避潜伏时间明显低于B组、C组(p<0.05),B组与C组无明显差异(p>0.05);在空间探索实验中A组、B组、C组,D组、E组、F组的平台象限泳距占总泳距的比例分别为:0.57±0.04 ((x|-)±s, n=8)、0.43±0.03 ((x|-)±s, n=8)、0.41±0.03 ((x|-)±s, n=8)、0.55±0.03 ((x|-)±s, n=8)、0.60±0.04 ((x|-)±s, n=8)、0.30±0.02 ((x|-)±s, n=8),E组及各移植组的平台象限泳距占总泳距的比例均明显高于F组(p<0.05),A组与E组及D组比较无明显差别(p>0.05),D组明显低于E组(p<0.05),而明显高于B组和C组(p<0.05),B组与C组无明显差异(p>0.05)。结论MSC移植可明显改善HIBD大鼠的空间学习记忆功能,本研究中在HIBD后2 h进行移植效果较其它时间点移植好。目的探讨丹参是否能提高骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)移植后神经性分化效率,移植分化后的细胞是否具有神经突触循环功能,MSC移植后是否可促进内源性神经干细胞(Neural stem cells, NSC)的分化。方法对6日龄新生大鼠腹腔注射5-溴脱氧尿苷嘧啶(5-bromo-2 -deoxyuridine, BrdU)以标记内源性NSC,于7日龄时制备为缺氧缺血性脑病(Hypoxic ischemic encephalopathy, HIE)动物模型,体外培养MSC,选取4～5代状态好的MSC用DAPI进行标记,于新生鼠发生HIBD后2 h进行腹腔注射移植。移植4周后进行Morris水迷宫学习记忆功能检测,水迷宫检测结束后BrdU/DAPI/Nestin,BrdU/DAPI/TUJ1,BrdU/DAPI/GFAP组织免疫荧光叁标检测BrdU+细胞分化效率以及MSC分化效率,同时对移植分化后的细胞神经突触循环功能进行检测。结果MSC移植4周后Morris水迷宫检测结果显示:在定位航行实验中假手术正常对照组(A组),HIBD后2 h接受MSC移植治疗,并于24h后接受丹参干预组(B组),HIBD后2 h接受MSC移植治疗,并于24h后PBS对照干预组(C组),HIBD后2 h接受丹参干预,并同时接受MSC移植治疗组(D组),HIBD后2h接受丹参干预组(E组),HIE空白对照组(F组)逃避潜伏时间分别为(s):18.16±1.90 ((x|-)±s, n=8)、19.43±2.07、22.84±1.97 ((x|-)±s, n=8)、31.05±4.09 ((x|-)±s, n=8)、33.60±3.30 ((x|-)±s, n=8)、60.63±5.66 ((x|-)±s, n=8),A组逃避潜伏时间明显低于C组、D组、E组、F组,P<0.05,与B组比较无明显差异,P>0.05;B组逃避潜伏时间明显低于D组、E组、F组,P<0.05;C组与A组、D组、E组、F组比较具有显着性差异,P<0.05,与B组无明显差异,P>0.05;D组与A组、B组、C组、F组比较具有显着性差异,P<0.05,与F组无明显差异,P>0.05;E组与A组、B组、C组、F组比较具有显着性差异,P<0.05;F组逃避潜伏时间明显高于其它各组,P<0.05。在空间探索实验中A组、B组、C组,D组、E组、F组的平台象限泳距占总泳距的比例分别为: 0.62±0.03 ((x|-)±s, n=8)、0.63±0.04 ((x|-)±s, n=8)、0.57±0.07 ((x|-)±s, n=8)、0.48±0.03 ((x|-)±s, n=8)、0.45±0.02 ((x|-)±s, n=8)、0.31±0.03 ((x|-)±s, n=8),A组和B组平台象限泳距占总泳距的比例明显高于其他各组,P<0.05,A组与B组间无明显差异,P>0.05;C组平台象限泳距占总泳距的比例明显高于D组和E组,P<0.05;D组与E组间无明显差异,P>0.05,但明显高于F组,P<0.05。脑组织免疫荧光叁标结果显示:A组、B组、C组,D组、E组、F组中BrdU+细胞Nestin表达率分别为(%):78.04±6.03 ((x|-)±s, n=8)、23.43±3.57 ((x|-)±s, n=8)、33.73±3.69 ((x|-)±s, n=8)、43.01±5.45 ((x|-)±s, n=8)、48.59±5.45 ((x|-)±s, n=8)、65.63±7.20 ((x|-)±s, n=8),B组BrdU+细胞Nestin的表达明显低于其他各组,P<0.05;A组与F组明显高于其他各组,P<0.05,F组明显低于A组,P<0.05; C组明显低于A组、D组、E组、F组,P<0.05;D组和E组间无显着性差异,P>0.05;A组、B组、C组,D组、E组、F组中BrdU+细胞GFAP表达率分别为(%):11.71±3.28 ((x|-)±s, n=8)、26.85±3.22 ((x|-)±s, n=8)、24.87±3.17 ((x|-)±s, n=8)、23.62±2.74 ((x|-)±s, n=8)、21.70±3.08 ((x|-)±s, n=8)、18.27±3.86 ((x|-)±s, n=8),B组、C组、D组、E组、F组BrdU+细胞GFAP表达率均较A组明显升高, P<0.05;A组、B组、C组,D组、E组、F组中BrdU+细胞TUJ1表达率分别为(%):4.68±1.67 ((x|-)±s, n=8)、35.04±3.65 ((x|-)±s, n=8)、27.48±4.25 ((x|-)±s, n=8)、22.61±2.74 ((x|-)±s-, n=8)、19.18±1.96 ((x|-)±s, n=8)、7.72±2.10 ((x|-)±s, n=8),各组间BrdU+细胞TUJ1表达率比较均有显着性差异,P<0.05,B组>C组>D组>E组>F组>A组。B组、C组,D组MSC的TUJ1表达率分别为:0.59±0.07 ((x|-)±s, n=8)、0.28±0.07 ((x|-)±s, n=8)、0.23±0.03 ((x|-)±s, n=8),各组间均具有显着性差异,P<0.05,B组>C组>D组,GFAP的表达率分别为:0.12±0.03 ((x|-)±s, n=8)、0.23±0.04 ((x|-)±s, n=8)、0.17±0.03 ((x|-)±s, n=8),各组组间两两比较具有显着性差异,P<0.05,C组>D组>B组,Nestin的表达率分别为:0.12±0.04 ((x|-)±s, n=8)、0.23±0.06 ((x|-)±s, n=8)、0.23±0.04 ((x|-)±s, n=8),B明显低于C组和D组,P<0.05,C组与D组间无明显差,P>0.05。MSC移植入HIBD新生鼠脑内5周后,突触循环检测结果显示:脑组织片第1次受到含10μM SynaptoRed-C2荧光探针的50 mM K+刺激后,细胞发生胞吞作用而发出红色荧光,当再次受50 mM K+刺激后,细胞荧光强度降低。胞具有正常的突触循环功能,MSC的移植还可促进BrdU+细胞神经性分化。
朱登纳[3]2010年在《基因工程神经干细胞NSCs-IGF-1治疗新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的实验研究》文中研究指明研究背景新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因,严重危害新生儿健康,病情重,病死率和致残率高。随着新生儿科抢救水平及生命支持技术的提高,早产儿、严重窒息儿和各种脑损伤儿存活率大大提高,使得新生儿缺氧缺血.性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)的患病率不仅没有减少,反而有升高的趋势,已成为导致儿童残疾的主要疾病之一,严重影响小儿身心发育和生活质量,也给个人、家庭和社会带来了极大的精神痛苦和沉重的经济负担。传统的治疗方法如药物治疗、高压氧治疗等都仅局限于支持治疗,只能在一定程度上缓解症状,难以促进神经再生进而从根本上恢复神经系统的功能。干细胞尤其是神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的发现给HIE患者带来了新的希望。大量的研究已经证实,神经干细胞由于具有自我更新和多向分化的潜能而成为修复神经系统损伤的理想材料。NSCs研究成为目前生物学领域研究的热点,而NSCs移植为治疗神经系统损伤提供了新的方向。目前对NSCs的应用研究主要集中存在以下两个方面：一是将在体外分离培养并大量扩增的NSCs直接移植到神经系统损伤部位,从而起到修复作用；二是将NSCs作为载体,将有治疗作用的特定基因克隆到NSCs而制作基因工程神经干细胞,通过移植达到细胞替代和基因治疗的双重功效。研究表明胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)不仅对大脑生长、发育、髓鞘的形成有重要的作用,而且是潜在的有丝分裂源,能够在体外诱导神经细胞和血管内皮细胞的增殖、分化及调节细胞存活,同时体内外多种创伤模型也显示了其重要的神经营养及神经保护作用。有研究发现,脑损伤后立即给予IGF-1可明显减少神经元死亡,能有效改善脑损伤引起的不良后果。既往的研究显示,单独移植NSCs或IGF-1均能对HIBD动物模型发挥重要的治疗作用,促进神经功能的恢复。但将二者联合,选择IGF-1对NSCs进行基因修饰构造基因工程神经干细胞,通过细胞移植探讨对HIBD的治疗研究还未见报道。本课题旨在寻求新的NSCs来源,构造基因工程修饰神经干细胞NSCs-IGF-1,通过对移植NSCs-IGF-1的HIBD大鼠的观察,来探讨基因工程修饰神经干细胞NSCs-IGF-1治疗HIBD的可行性,为临床应用NSCs-IGF-1治疗HIBD奠定理论基础。目的1.研究人脐带血来源的神经干细胞体外分离、培养、诱导分化及鉴定的方法,观察神经干细胞增殖、传代和分化规律,建立合适的体外稳定培养体系。2.构建IGF-1真核表达载体pcDNA3.1-IGF-1,并转染NSCs以建立基因工程神经干细胞NSCs-IGF-1,为HIBD的治疗打下基础。3.探讨基因工程神经干细胞NSCs-IGF-1移植对HIBD新生鼠脑部结构和功能重建的影响,为临床应用基因工程神经干细胞移植治疗HIBD提供理论支持。方法1.无菌条件下取健康育龄产妇正常足月分娩胎儿脐带血,肝素抗凝,等体积磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后,密度梯度离心法分离其中单个核细胞。台盼蓝拒染法计数活细胞,以1×106/mL密度将脐血单个核细胞接种到培养瓶,加入含有B27、EGF和bFGF的无血清DMEM/F12培养基,37℃、5%CO2条件下培养细胞,3天后半量换液。待细胞培养至第7天,离心收集神经球,使用胰蛋白酶消化法和机械法相结合的方法进行传代,以5×105/mL将传代后的神经干细胞接种于新培养瓶,置37℃、5%CO2条件下继续培养。P3代神经干细胞加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,进行诱导分化。倒置显微镜动态观察细胞生长状况。2.加入5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU) 20μmol/L对P3代脐血神经干细胞进行标记。在37℃、5%CO2条件下培养3天后行免疫荧光化学染色检测BrdU阳性细胞,对细胞的增殖能力进行鉴定。同时对分化前后的P3代神经干细胞分别进行免疫细胞化学染色检测Nestin、NSE、GFAP和MBP的表达,对神经干细胞及其分化细胞进行鉴定。另外,对分化前的P3代脐血神经干细胞进行G418最佳筛选浓度的测定。3.从胎肝抽提总RNA,利用RT-PCR获得目的基因IGF-1。将目的基因于1%琼脂糖凝胶中进行电泳,割胶回收目的基因片段。将该目的基因与质粒pcDNA3.1进行连接构建IGF-1的真核表达重组质粒pcDNA3.1-IGF-1。用氯化钙法制备DH5a大肠杆菌感受态细胞,将连接液加入细胞进行转化,次日挑取氨苄青霉素抗性菌落进行扩增,小量制备重组质粒DNA。BamHⅠ与HindⅢ双酶切对重组质粒进行鉴定,同时将酶切正确的菌液进行测序鉴定。4.摇菌扩增含有目的基因的重组质粒,用SDS裂解法进行大量抽提。应用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1-IGF-1转染P3代脐血神经干细胞,同时设立空质粒组和未转染对照组。G418筛选抗药性克隆进行扩大培养。并用RT-PCR检测IGF-1基因在基因转染神经干细胞中的表达,将产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。免疫荧光细胞化学法检测转染细胞内IGF-1与Nestin的表达,对转染效果进行鉴定。以含20%胎牛血清的新鲜DMEM/F12培养基诱导后,免疫荧光细胞化学法检测NSE, GFAP和MBP在转染细胞中的表达,对转基因神经干细胞的分化能力进行鉴定。5.将80只SD大鼠通过结扎左颈总动脉,低氧箱中缺氧处理的方法,构建新生大鼠HIBD模型,将造模后存活的75只大鼠随机分成叁组：模型对照组,NSCs移植组和NSCs-IGF-1移植组,每组25只。每组再进一步随机分为1d组、7d组、14d组、21d组及肢体运动功能检测组,每组5只。移植前3d,将基因工程神经干细胞NSCs-IGF-1和未转染神经干细胞进行BrdU标记(终浓度1μmol/L)。动物模型制备24h后按1.0mL/100g体重(细胞浓度为1×106/mL)行尾静脉注入法进行细胞移植。取25只正常SD大鼠作为正常对照组,不进行模型制作,不移植任何细胞；NSCs-IGF-1移植组为HIBD模型大鼠经尾静脉移植基因工程神经干细胞NSCs-IGF-1; NSCs移植组于相同部位注入等量神经干细胞；模型对照组为HIBD大鼠注入等量生理盐水。6.各组动物每组5只分别在移植术后1d、7d、14d、21d处死,免疫荧光检测BrdU表达情况,对移植细胞在脑内的存活情况进行检测。通过Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色观察神经干细胞增殖、分化及在大鼠脑内分布情况,并通过Y-迷宫试验和运动功能检测对大鼠脑功能恢复情况进行观察研究。结果1.原代培养的NSCs在无血清培养基中培养7d左右可形成大量悬浮的神经球,用胰蛋白酶消化法和机械法相结合的方法传代后,细胞呈散在悬浮状态,37℃5%CO2条件下培养3-5d后,又可见中等大小神经球出现在培养基中。随着传代的次数增加,细胞增殖速度逐渐减慢。P3代神经干细胞经过20%胎牛血清诱导培养1d后可见培养细胞开始贴壁,边缘出现细的突起；诱导分化第3d,贴壁细胞可见突起生长；诱导分化第7d,可以观察到神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。2.P3代脐血神经干细胞进行BrdU标记后,荧光显微镜下可观察到大量BrdU表达阳性细胞。免疫细胞化学检测显示,原代及传代培养的神经干细胞Nestin表达呈阳性,而经过20%胎牛血清诱导培养7d后未见Nestin表达阳性的细胞,可见NSE, GFAP和MBP阳性细胞。同时,G418对P3代脐血神经干细胞最佳筛选浓度为400ug/mL。3.胎肝总RNA经RT-PCR后产物电泳显示在462bp处出现目的条带,目的基因IGF-1与质粒pcDNA3.1连接产物pcDNA3.1-IGF-1经HindⅢ与BamH I双酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳显示在5428bp处和462bp处各有一条亮带,空质粒组只在5428bp处有一条亮带,结果与质粒载体及目的基因大小相符,证明所构建的真核表达载体pcDNA3.1-IGF-1大小及方向正确。对该重组体进行测序发现目的基因符合genebank序列(Nmol/L-000618),表明真核表达载体pcDNA3.1-IGF-1成功构建。4.重组质粒pcDNA3.1-IGF-1转染神经干细胞后,加入含400ug/mL G418的筛选液筛选两天后细胞开始死亡,一周后死亡细胞达高峰,之后细胞死亡渐渐减少,并且开始分裂增殖,2周后逐渐出现抗G418的阳性克隆,但未转染细胞逐渐在含G418的筛选液中全部死亡。初步证明IGF-1基因转染神经干细胞成功。收集抗药性克隆,经过RT-PCR检测可得到一条约462bp的条带,长度与目的基因相符,证明成功构建了基因工程神经干细胞NSCs-IGF-1。对此细胞行Nestin和IGF-1免疫荧光化学染色,均显示阳性,表明IGF-1在转染后的细胞中成功表达,且神经干细胞的未分化状态未因IGF-1的表达而改变。经含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导7天后,可见基因转染神经干细胞克隆分化为典型的神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,免疫荧光细胞化学法检测其NSE、GFAP和MBP染色阳性。5.对SD大鼠通过结扎左颈总动脉和低氧处理后,发现大鼠出现右侧肢体瘫痪,证明大鼠HIBD模型建立成功。6.基因工程神经干细胞NSCs-IGF-1移植HIBD动物模型后,用免疫荧光对BrdU示踪结果显示,NSCs移植组和NSCs-IGF-1移植组均可见到BrdU阳性细胞,且在观察时间内随着细胞移植时间延长阳性细胞不断增多。静脉移植的BrdU阳性细胞可迁移至HIBD大鼠脑内并进一步趋化至左侧室管膜前下区(anterior subventricular zone, SVZa)存活下来。移植7d后,NSCs移植组和NSCs-IGF-1移植组间进行比较,BrdU阳性率差异显着(p<0.05)。7.经过HE染色,Nestin、NSE、GFAP免疫组化等方法显示移植细胞可趋化至模型动物左侧SVZa区存活并进行分化。在观测时间点内,NSCs-IGF-1移植组Nestin阳性细胞表达量早期升高,移植后14d达峰,后逐渐下降,NSE阳性细胞表达量逐渐升高。而模型对照组在移植7d后Nestin及NSE阳性细胞表达量逐渐降低,两组差异有统计学意义。各组SVZa区GFAP染色阳性细胞表达量总体逐渐升高,其中模型组表达最高,与NSCs-IGF-1移植组及正常对照组相比均有显着性差异(P＜0.05), NSCs- IGF-1移植组与正常对照组无统计学差异(p>0.05)。大鼠学习记忆功能检测及运动功能检测结果均显示NSCs-IGF-1移植组明显优于模型对照组,二者差异具有统计学意义。结论1.人脐血可以诱导培养出神经干细胞。2.脂质体介导的转染方法能够安全有效地将IGF-1转染神经干细胞。3.成功构建基因工程神经干细胞NSCs-IGF-1,并且细胞的自我更新及多向分化潜能未因IGF-1基因的转入而改变。4.基因工程神经干细胞NSCs-IGF-1移植后,细胞可以在HIBD大鼠脑内存活、增殖与分化,并对大鼠神经系统功能的恢复发挥一定作用。因此基因工程神经干细胞NSCs-IGF-1有望在HIBD的治疗中发挥作用。
关亦兵[4]2007年在《小儿脑损伤与干细胞移植治疗》文中提出学术背景:小儿脑损伤后多采用高压氧、神经营养药物、细胞因子、中药及针灸等方法来治疗,但对于已经完全损伤的神经细胞,治疗效果很差。近年来随着干细胞移植的研究不断深入,为治疗此类疾病带来了希望。目的:介绍干细胞的生物学特性及移植的研究现状,展望其在小儿脑损伤治疗领域潜在的发展方向。检索策略:由作者应用计算机检索Proquest和Elsevier数据1992-01/2007-04相关文献,检索词为"alstemcells transplan",限定语言种类为"English";同时检索维普中文期刊数据库、万方数据库1992-01/2007-06相关文献,检索词为"干细胞移植",限定语言种类为中文。纳入标准:内容与神经干细胞、间充质干细胞移植有关并发表早权威杂志。排除标准:较陈旧及重复文献,与小儿脑损伤及干细胞移植无关的文献。文献评价:共收集到56篇相关文献,排除26篇,30篇文献符合标准,其中13篇是综述和述评类文献,其余17篇为基础研究。30篇中11篇介绍干细胞的基本生物学特性,4篇与干细胞移植途径相关,15篇关于干细胞移植与缺氧缺血性脑损伤有关的文献。资料综合:①神经干细胞可分成内源性和外源性,利用两者的互动效应及神经干细胞多潜能分化的特点,神经干细胞移植可能作为挽救性治疗手段,修复与防治小儿脑损伤。②间充质干细胞一定条件下可分化出具有生理功能的神经细胞,异体移植无免疫排斥反应,可通过血脑屏障。目前对胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞移植研究较多。结论:干细胞移植已经在动物实验上取得了令人鼓舞的进展,但仍有一些问题需要解决。随着分子生物学、发育生物学、临床学科等学科的相互协作和研究方法的进一步完善,干细胞移植将对于小儿脑损伤的治疗具有重要意义。
万凤[5]2017年在《基于干细胞巢调控的人参皂苷对缺血/再灌注神经干细胞增殖、分化的作用及其机制》文中研究表明目的研究人参皂苷通过作用于神经干细胞巢(NSCs niche)内的神经干细胞(NSCs)、星形胶质细胞(AC)和脑微血管内皮细胞(EC),对缺血/再灌注(OGD/R)后的NSCs增殖、分化的影响以及HIF-1α-VEGF信号通路的调节机制。方法1孕15-17d的SD大鼠,体外分离培养胎鼠海马NSCs,采用免疫荧光染色法对NSCs特异性标志物Nestin进行鉴定,NSCs增殖标记物BrdU进行增殖鉴定,神经元祖细胞特异性标记物Tuj-1及星形胶质细胞的祖细胞特异性标记物Vimentin对NSCs进行分化鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养星形胶质细胞,采用免疫荧光染色法对星形胶质细胞的特异性标志物GFAP进行鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养脑微血管内皮细胞,采用免疫荧光染色法对脑微血管内皮细胞的特异性标志物Factor Ⅷ进行鉴定。2 MTS法测定人参皂苷促进NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量及最佳给药时间点。3携带GFP基因的慢病毒转染NSCs,观察GPF的阳性表达率来确定NSCs的转染率,筛选出慢病毒转染NSCs的最佳转染指数MOI值及最佳转染时间。按照课题组先前的造模方法,采用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型模拟脑缺血/再灌注损伤,以缺氧缺糖4h为NSCs损伤的最高时间点。Western Blot检测慢病毒转染后NSCs核内HIF-1α蛋白表达,观察转染后HIF-1α蛋白表达情况,并计算出HIF-1α蛋白沉默率;免疫荧光及细胞核染色检测HIF-1α基因在NSCs的表达位置情况;免疫荧光染色法对转染后NSCs进行鉴定,并且检测转染后NSCs的增殖、分化情况。4实验分为6组,设立NSCs正常组、NSCs模型组、NSCs人参皂苷组(1.OOμg/ml)、慢病毒转染的NSCs(LV-NSCs)正常组、LV-NSCs模型组、LV-NSCs人参皂苷组(1.OOμg/mL),OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs和培养液,免疫荧光染色技术分析NSCs的增殖、分化情况,Western Blot分析NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测培养液VEGF含量。5采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与星形胶质细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组、NSCs/AC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组、LV-NSCs/AC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs、星形胶质细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析星形胶质细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。6采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与脑微血管内皮细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组、NSCs/EC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/EC 正常组、LV-NSCs/EC 模型组、LV-NSCs/EC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs、脑微血管内皮细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析脑微血管内皮细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。结果1 胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞的分离培养和鉴定体外成功分离培养胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞,经鉴定,其纯度达95%以上。2人参皂苷促进NSCs、胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量和最佳给药时间点①人参皂苷促进NSCs增殖的最佳剂量为1.00μg/mL,促进NSCs增殖的最佳给药时间点为24h。②人参皂苷促进星形胶质细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进星形胶质细胞增殖的最佳给药时间点为72h。③人参皂苷促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳给药时间点为24h。3慢病毒转染NSCs筛选最佳MOI值及最佳转染时间成功采用慢病毒转染NSCs,慢病毒转染NSCs的最佳MOI值为10,最佳转染时间为144h。与对照组相比,NSCs转染率为90.47%(P<0.01)。4 Western Blot检测OGD后慢病毒转染NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况与NSCs正常组和转染阴性对照组相比,NSCs转染组HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.01)。经计算,HIF-1α 沉默率为 88.5%。5免疫荧光及细胞核染色检测OGD后HIF-1α在NSCs内的表达情况在缺氧条件下,NSCs正常组显示HIF-1α能够在NSCs核内表达;NSCs转染组显示GFP绿色荧光能够在细胞核内表达,并且HIF-1α不表达,表明慢病毒能够成功转染NSCs,并使HIF-1α表达沉默。6免疫荧光染色鉴定慢病毒转染NSCs后的Nestin及NSCs增殖、分化情况慢病毒转染后的NSCs均表达Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性,慢病毒转染后的NSCs仍能够增殖,并且分化为神经元的祖细胞和星形胶质细胞的祖细胞,但其增殖、分化能力明显降低。7免疫荧光染色技术检测OGD后NSCs增殖和分化情况①NSCs各组:NSCs正常组、NSCs模型组和NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与NSCs正常组相比,NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs模型组比较,NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组、LV-NSCs模型组和LV-NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs模型组比较,LV-NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数少量增加,差异无统计学意义。8 Western Blot检测OGD后各组NSCs核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs各组:NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白少量表达或几乎不表达;与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞核中的HIF-1α蛋白表达明显减少(P<0.01)。9 ELISA检测OGD后各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs各组:NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量很低;与N LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显减少(P<0.01)。10 MTS检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。11免疫荧光双标染色检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组和NSCs/AC人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/AC 正常组相比,NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/AC 各组:LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组和 LV-NSCs/AC 人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。12 Western Blot检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组星形胶质细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。②LV-NSCs/AC:LV-NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。13 ELISA检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/AC各组:LV-NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。14 MTS检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。15免疫荧光双标染色检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组和NSCs/EC人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin 阳性表达;分别复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/EC 正常组相比,NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:正常组、模型组和人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性表达;分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。16 Western Blot检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组脑微血管内皮细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与 LV-NSCs/EC 模型组相比,LV-NSCs/EC 人参皂苷组 HIF-1α 蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。17 ELISA检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组相比,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。结论人参皂苷通过调节NSCs niche内的NSCs、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞,通过调控HIF-1α-VEGF信号通路,以自分泌和旁分泌的共同方式,促进缺血/再灌注后NSCs增殖,并且诱导NSCs分化为神经元和星形胶质细胞的祖细胞。
王春梅[6]2011年在《头皮位点药物注射对HIBD新生大鼠内源性神经干细胞增殖分化及Nogo-A mRNA的影响》文中研究指明缺氧缺血性脑损伤(hypoxia—ischemicbrain damage, HIBD)在新生儿期是引起新生儿死亡和神经系统损伤最常见的原因。据统计每1000例新生儿中约有1、2例由于围产期窒息引起HIBD,HIBD患儿中大约有15-20%在新生儿期死亡,约25%幸存患儿会遗留神经系统损伤,如脑性瘫痪、智力障碍、癫痫等。目前对HIBD以对症支持治疗为主,亚低温和高压氧疗法已经得到广泛的认可,亚低温疗法对中度HIBD效果显着,可明显预防和减轻患儿后遗症的发生,提高生存质量。20年前人们普遍认为与其它器官的再生能力相比,大脑组织在发育完全后,几乎无再生成神经细胞的能力,但是近年来的研究发现,在大脑的特殊区域存在着神经干细胞(NSCs),脑组织具有神经再生的能力。神经干细胞是在胚胎和成体神经组织中存在的具有自我更新和多向分化潜能的细胞,能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,参与神经发育和神经损伤的修复。另外,近几年的研究表明中枢神经存在许多抑制因子,成年哺乳动物周围神经轴突损伤后能够广泛再生,而中枢神经轴突的再生能力有限,其原因除了与损伤点生长促进分子缺乏、损伤神经元内在的生长能力差和胶质斑痕的物理屏障作用外,微环境中抑制因子的存在起着重要作用,如Nogo-A,它是一个重要的中枢轴突生长抑制因子,它对中枢神经损伤的抑制作用已被体内外实验证实。脑损伤患儿早期脑的可塑性比较大,因此最大限度的激发内源性神经干细胞的产生,促进其增殖与分化成为近几年来研究的热点。目的本实验制作缺氧缺血性脑损伤大鼠动物模型,运用头皮位点药物注射对其治疗,研究头皮位点药物注射对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠内源性神经干细胞增殖分化及对神经再生抑制因子Nogo-A mRNA表达的影响。方法缺氧缺血性脑损伤大鼠模型制备：新生7日龄SD大鼠,随机分成四组：对照组,模型组,位点注射生理盐水治疗组,位点注射VitB1、B12治疗组。采用结扎左侧颈总动脉并吸人2小时氮氧混合气,制作新生大鼠HIBD模型。位点注射生理盐水治疗组和位点注射VitB1、B12治疗组在模型建立后第14天,分别在大鼠的左侧额顶叶皮下注射等量的生理盐水和VitB1、VitB12的混合稀释液,1次/天,共20天,假手术组和模型组不予处理。各组予干预后7天后处死动物：用40g/L多聚甲醛心脏灌注后断头取脑组织,分别做连续冠状切片。用HE染色做病理学分析,用免疫荧光方法测定各组大鼠海马神经干细胞标志物巢蛋白(Nestin)表达情况,免疫组织化学方法检测海马胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,用原位杂交方法测定海马神经再生抑制因子Nogo-A mRNA的表达情况。统计学处理应用SPSS16.0统计软件进行分析,数据以X士S表示,多组均数比较用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,以a=0.05为检验水准,P<0.05差异有统计学意义。结果1.HE染色显示：位点注射可减轻海马神经细胞的变性坏死,促进其修复,其中注射VitB1、B12治疗组修复作用更为明显。2.位点注射可增加海马Nestin的表达,以注射VitB1、B12治疗组表达最高,对照组组表达最少。3.海马NSE免疫组化显示：对照组和和位点注射VitB1、B12治疗组表达较多,二者差别较小,而模型组海马表达最少(P<0.005)。海马GFAP免疫组织化学显示对照组表达最少,模型组最多,位点注射生理盐水和位点注射VitB1、B12可抑制GFAP的表达,其中以位点注射VitB1、B12治疗组的抑制作用最为明显(P<0.005)。4.原位杂交显示：对照组的Nogo-A mRNA表达最少,而模型组表达与其相反,位点注射生理盐水治疗组和位点注射VitB1、B12治疗组的表达水平均低于模型组,其中位点注射VitB1、B12治疗组更为明显(P<0.005)结论运用头皮位点药物注射治疗大鼠外观形态脑瘫表现好转,神经损伤减轻；运用位点药物注射治疗组Nestin及NSE增多,但是GFAP及Nogo-A mRNA的表达减少。从而得出结论：头皮位点注射治疗可促进内源性神经干细胞的增殖与分化,抑制Nogo-A mRNA的表达,促进神经的再生与修复,位点注射时联合运用药物,能增强这种治疗效果。
华骏[7]2017年在《白果内酯对缺血性脑损伤的神经保护作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理脑卒中是当前全球第叁大致死类疾病,仅次于心血管疾病和癌症,而在我国,脑卒中已成为最主要的致死因素,也是导致重度、慢性成人残疾的主要原因,严重危害人类的生命与健康。根据其临床发病特点不同,可以将脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两大类。据统计,全球范围内缺血性脑卒中患者约占所有卒中患者的70%,而我国缺血性脑卒中约占所有卒中病例的85%,死亡率高达50%,存活的缺血性脑卒中患者中约有3/4不同程度地丧失劳动能力或遗留有瘫痪,失语等严重的后遗症。近年来人们致力于研究缺血性脑损伤急性期的神经损伤性级联反应,并在动物模型上已发现很多具有神经保护作用的化合物,但转化后的临床疗效均不太理想。因此,阐明缺血性脑损伤的确切病理机制,提出新的卒中后神经保护策略,研发疗效确切并能让更多患者受益的治疗药物仍然是当前脑卒中治疗亟待解决的问题。此外,由于各种条件限制,能够在缺血性脑损伤"黄金3小时"内接受治疗的患者很少,多数患者在急性期接受保守治疗,损伤后期主要依靠神经营养和神经修复,通过促进机体内在的修复能力尽可能恢复患者的意识、感觉、认知和运动功能,并且这已经成为卒中后护理和治疗的关键所在。因此,发现促进卒中后期神经修复的关键机制和分子靶标,研发理想的恢复期治疗药物也已经成为脑卒中研究领域的热点。细胞自噬与凋亡是目前卒中机制研究比较重要的热门领域。缺血性脑损伤后脑组织主要因供血、供氧不足会发生神经细胞的坏死与凋亡。其中,缺血半影区脑组织主要发生细胞凋亡,一种受多基因严格控制的死亡方式。细胞自噬是机体内在调整稳态的有效机制,缺血缺氧引起的细胞内错误折迭或者不折迭的蛋白、受损的细胞器均需要通过自噬途径被运送至溶酶体降解,不能够及时被清除的病理因素会导致细胞凋亡或死亡。神经细胞在缺血、缺氧情况下激活保护性细胞自噬减少凋亡相关蛋白向线粒体内的聚集,通过减少细胞色素C或Caspase-3的活化从而抑制细胞凋亡。因此,研发可以靶向调节神经细胞保护性自噬并抑制细胞凋亡的药物,能够在缺血性脑损伤早期减少神经细胞死亡,减轻神经功能损伤。银杏是一种有着较早文献记载并具有重要药用价值的天然植物,在我国作为药用已有五千多年的历史,长期应用于防治心血管疾病,抗老防衰,抗癌和提高自身免疫力等方面。研究表明,银杏叶和银杏果中含有多种药用成分可用于多种疾病的防治,成分主要是银杏内酯A、B、C、J、M和白果内酯(bilobalide,BB)。其中白果内酯是从银杏叶中提取出的唯一一种倍半萜内酯,具有抗兴奋性毒性、抑制氧化应激损伤、抗炎以及抗血小板聚集等作用,主要以与其他银杏叶提取物联合制剂的形式应用于脑血管相关疾病的临床治疗。目前白果内酯含量较高的制剂是用于脑部、周围血流循环障碍的银杏叶提取物注射液金纳多(白果内酯含量约占标准提取物的2.9%);另有金阁莱(?)银杏内酯注射液,其中白果内酯含量高达48%,主要用于缺血性脑卒中恢复期脑梗死适应症的治疗。然而,尽管临床应用表明含白果内酯的混合制剂对脑卒中具有较好的疗效,但其具体有效成分不明,白果内酯单体对缺血性脑卒中急性期和恢复期的疗效和确切机制也不清楚,因此也限制了其在缺血性脑损伤及适应症治疗中的应用。本课题在前期研究发现含有白果内酯的银杏内酯注射液能够减轻缺血性脑卒中急性期损伤的基础上,进一步研究白果内酯对小鼠大脑中动脉阻塞(transient Middle Cerebral Artery Occlusion,tMCAO)形成的局灶性缺血性脑损伤急性期和恢复期神经损伤及其神经功能恢复的治疗作用,并阐明其相关机制。第一部分白果内酯对缺血性脑损伤急性期神经保护作用及其与自噬的相关性目的:建立小鼠缺血性脑损伤再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)模型,研究白果内酯对急性期神经损伤的保护作用,及对神经元自噬和凋亡的调节,为深入阐明白果内酯的作用机制并拓展其临床应用积累学术基础。方法:(1)参考Longa法制备小鼠tMCAO模型,于缺血1h、血流再灌注6h后分组给予金纳多(10 mg/kg),3.5 mg/kg,7 mg/kg和14 mg/kg白果内酯(BB,i.p.,bid)治疗。血流再灌注72h后神经功能评分,处死取材TTC染色,脑含水量测定。(2)制备小鼠tMCAO模型,并选取最小有效剂量7 mg/kg BB于血流再灌注6h后给药,再灌注72h后处死分别取组织脑片和缺血半影区脑组织,利用免疫组织化学方法标记缺血半影区NeuN+神经元,免疫荧光测定自噬相关蛋白LC3和凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase 3与神经元的共标情况,Western Blot法分别对缺血半影区组织LC3,p62,Beclin1,BcL-2,Bax和Cleaved-Caspase 3等指标进行检测。(3)离体培养神经元细胞株N2a经离体氧糖剥夺模型(oxygen glucose deprivation,OGD)3h后,分别复糖复氧(Reoxygenation)0、3、6、12 和 24h,Western Blot 法分别检测胞内 LC3、p62、Beclin1、BcL-2、Bax和Cleaved Caspase-3等蛋白水平,观察复糖复氧后不同时间点自噬和凋亡的水平,并选择合适复糖复氧时间。(4)N2a细胞OGD3h后,用含不同浓度BB(0.01、0.1、1、10、25和50 μM)的完全培养基复糖复氧24h,MTT法评价药物对细胞活力的影响。(5)N2a细胞OGD 3h后,用含有1μM BB的完全培养基复糖复氧24h,利用Western Blot法分别进行自噬相关蛋白LC3、p62和凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3等指标进行检测。(6)N2a细胞OGD 3h后,同时给予细胞含2.5 mM自噬抑制剂3MA和1μM BB的完全培养基复糖复氧24h,利用流式细胞仪和Western Blot法检测细胞凋亡。结果:(1)BB(7,14mg/kg)能够减少小鼠脑梗死体积,降低神经功能评分和脑含水量。(2)7 mg/kg BB能够减少tMCAO模型后小鼠缺血半影区神经元的丢失。(3)7 mg/kg BB能够升高模型72h后小鼠缺血半影区脑组织LC3荧光表达并抑制Cleaved Caspase-3荧光表达,其中LC3与Cleaved Caspase-3荧光都与神经元细胞有部分共标。(4)7 mg/kg BB治疗能够降低小鼠缺血半影区脑组织凋亡相关蛋白Bax,Cleaved Caspase-3,自噬底物蛋白p-62蛋白的表达,并升高BcL-2、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达。(5)N2a细胞OGD/R后3h自噬水平较对照组升高,并随着时间推移细胞自噬水平下降,而细胞凋亡水平上升。(6)WB结果显示,BB促进复糖复氧24h后N2a细胞BcL-2、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达,并降低Bax,Cleaved-Caspase 3,自噬底物蛋白p-62蛋白表达。(7)自噬抑制剂3MA能够部分取消BB对Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达的抑制作用;流式细胞术结果显示白果内酯能够减少处于早期凋亡和晚期凋亡及坏死的细胞数目,而3MA部分取消BB对N2a细胞凋亡的抑制作用。结论:自噬参与白果内酯对缺血性脑损伤急性期的神经保护作用。第二部分白果内酯对缺血性脑损伤恢复期神经再生的调节及其机制目的:研究BB对缺血性脑损伤恢复期神经再生的调节作用,阐明其对成体神经干细胞增殖、分化等功能的影响与机制,为揭示其脑卒中恢复期用药的促神经修复功能提供直接的实验依据。方法:参考Longa法制备小鼠I/R损伤模型,缺血1h、血流再灌注24h后利用神经功能评分进行模型筛选,将模型成功小鼠随机分为模型对照组(Vehicle组),白果内酯3.5 mg/kg、7mg/kg和 14mg/kg给药组(BB 3.5 mg/kg,7 mg/kg,14 mg/kg,i.p.,bid),给药14天和42天分别进行内源神经干细胞增殖和分化相关实验:(1)统计术后各组小鼠死亡率和体重,并分别于术后1、3、7、14、28和42天进行神经功能评分,3、7、14、28和42天进行踏空测试,于术后14和28天进行转角和转棒测试,分别记录小鼠足失误次数、右转率和从转棒滑落时间,评价BB对I/R损伤恢复期小鼠神经感知、运动功能的影响。(2)术后38-42天对小鼠进行Morris水迷宫测试,评价BB对小鼠空间学习与记忆能力的影响。(3)利用小动物MRI-T2加权成像技术在术后24h、7d、14d和42d在体观察模型及14mg/kgBB治疗组小鼠脑组织损伤情况。(4)术后12-13天给予小鼠腹腔注射 BrdU(5-Bromo-2-deoxy Uridine,Sigma;50 mg/kg,连续给药4次,给药间隔为12h)标记S期增殖细胞,术后14天用于研究干细胞增殖的小鼠灌注取脑,完成BrdU免疫组化,评价干细胞增殖情况;用于研究干细胞分化的小鼠于术后42天灌注取脑,完成BrdU/NeuN免疫荧光,评价干细胞向神经元定向分化的情况;同时,为探讨药物对神经再生调节的机制,离体实验培养成体神经干细胞研究药物对干细胞存活、增殖和分化的影响,并初步探讨其作用机制。(5)离体培养成体神经干细胞(Adult neural stem cells,ANSCs),利用MTT和细胞计数法分别观察OGD/R和不同浓度BB(0.01、0.1、1、10和50 μM)给药对神经干细胞细胞活力和自我更新的影响。(6)利用BrdU免疫荧光标记法和流式细胞术评价BB对干细胞增殖和细胞周期的影响。(7)利用免疫荧光标记法观察OGD/R7天后神经干细胞向神经元(Tuj-1)和星形胶质细胞(GFAP)分化的比率以及不同浓度BB(0.1、1和10 μpM)对干细胞定向分化能力的影响。(8)检测OGD/R24h后,Western Blot法检测不同浓度BB(0.1,1和10 μM)对细胞p-Akt,p-p38和p-JNK水平的变化影响。(9)利用JNK激动剂茴香霉素(Anisomycin,Anis)预处理干细胞24h后,OGD2h后复糖复氧给予BB和Anis干预7天,免疫荧光法观察OGD/R 7天后BB对神经干细胞向Tuj-1神经元分化的影响。结果:(1)BB(7,14mg/kg)治疗小鼠长期存活率高于I/R模型小鼠,并且BB可以缓解I/R损伤导致的小鼠体重降低。(2)与模型对照组小鼠相比,7和14mg/kgBB治疗组小鼠神功功能显着改善,转角测试中右转率降低,转棒测试中棒上停留时间延长,同时,在踏空测试中踏空率显着降低。(3)Morris水迷宫定位航行测试中,BB能够降低小鼠找到水下平台的时间,同时在空间探索测试中BB能够增加小鼠穿越平台次数,增加小鼠在平台象限穿越的时间及次数。(4)MRI观察到术后24h模型小鼠损伤侧脑组织存在大面积高亮度信号,7天后信号变弱并出现脑组织缺损,14天时组织缺损边缘出现高密度信号,42天组织梗死导致的缺损体积相对固定,而给予14 mg/kgBB治疗能够延迟脑组织缺损的出现并减少梗死导致的脑组织缺损。(5)7mg/kg和14mg/kgBB增加术后14天小鼠SVZ和SGZ神经干细胞的数目和分布范围。(6)7mg/kg和14mg/kg BB增加术后42天小鼠SVZ和SGZ区BrdU+/NeuN+细胞数目。(7)0.1、1、10和50 μM BB能够增加OGD/R后ANSCs细胞活力且能够增加生长7天后神经球直径和个数。(8)BB增加OGD/R后BrdU+的ANSCs数目,并且能够增加处于S期的细胞数目。(9)BB促进OGD/R 7天后ANSCs向Tuj-1+神经元的分化。(10)BB抑制OGD/R后ANSCs内p38和JNK的磷酸化水平的升高,同时升高Akt的磷酸化水平。(11)10 μM JNK激动剂茴香霉素取消BB促进ANSCs向神经元分化的作用。结论:BB促进缺血性脑损伤恢复期神经再生,增强神经功能修复。综上所述,本文工作的主要创新之处在于:1.发现白果内酯在I/R模型小鼠急性期的抗凋亡作用与调节自噬相关通过对I/R经典动物模型研究发现,白果内酯对缺血性脑损伤的急性期损伤包括神经运动障碍、脑梗死和脑水肿均具有显着改善作用,并且白果内酯可以促进神经元自噬并抑制神经元凋亡;同时,离体研究证实白果内酯通过促进神经细胞自噬并抑制神经元凋亡。研究为揭示白果内酯在缺血性脑损伤急性期的神经保护作用提供了直接的实验证据,为拓展其在缺血性脑损伤急性期的临床应用积累了重要学术基础。2.发现白果内酯在小鼠缺血性脑损伤恢复期发挥促神经再生作用研究发现白果内酯能改善缺血性脑损伤恢复期神经运动功能,并且能促进内源性神经再生。同时,离体实验确证白果内酯能够促进成体神经干细胞存活、自我更新、增殖和向神经元的分化,并且其对分化的积极作用与其对神经干细胞JNK MAPK通路的抑制作用相关。研究深化了对白果内酯应用于缺血性脑损伤临床恢复期的作用机制的认识,并为推广白果内酯联合制剂和单体制剂在防治缺血性脑损伤中的临床应用提供重要的理论依据。
高健[8]2018年在《人参皂苷对神经干细胞的作用及HIF-1a-VEGF通路的调控机制》文中研究说明目的从中医“祛瘀生新”的角度出发,基于神经干细胞的生物学特点,从在体神经干细胞发生和异体神经干细胞移植两个方面,探讨神经干细胞在缺血损伤修复过程中发挥的作用及机制。方法1孕15-17 d的SD大鼠,体外分离培养胎鼠海马NSCs,采用免疫荧光染色法对NSCs特异性标志物Nestin进行鉴定,NSCs增殖标记物BrdU进行增殖鉴定,神经元祖细胞特异性标记物Tuj-1及星形胶质细胞的祖细胞特异性标记物Vimentin对NSCs进行分化鉴定。2 SD雄性大鼠随机分为5组(n=7):正常对照组(Sham group)、模型组(Model group)、人参皂苷治疗组(Gin group)、NSCs移植治疗组(NSCs group)和人参皂苷治疗同时神经干细胞移植治疗组(Gin+NSCs group)。SD大鼠建立局灶性脑缺血模型,NSCs移植治疗组对建立缺血模型后大鼠缺血侧进行NSCs移植治疗,对缺血7 d后大鼠神经功能改善及脑组织梗死情况进行评估。3基于上述实验分组,收集缺血7 d后大鼠全血及脑组织,制备血清及脑组织匀浆液。采用酶联免疫分析ELISA方法测定在血清和组织匀浆液中的炎性介质,包括炎性细胞因子(IL-lβ,IL-6,TNF-α),趋化因子(CXCL-1,MCP-1),粘附分子(ICAM-1)及一些抗炎细胞因子(IL-4,IL-10)等,为神经干细胞移植治疗缺血性脑中风的作用机制提供有效证据,并进一步探讨了人参皂苷的抗脑中风机制。4携带GFP基因的慢病毒转染NSCs,确定慢病毒转染NSCs的最佳转染复数MOI值及最佳转染时间。实验分为4组,设立正常对照组(Shamgroup)、模型组(Model group)、NSCs移植治疗组(NSCs group)和慢病毒转染后HIF-1α基因沉默表达的NSCs移植治疗组(LV-NSCs group)。建立大鼠脑缺血模型后,NSCs移植治疗组(NSCs group)和HIF-1α基因沉默的NSCs移植治疗组(LV-NSCs group)分别在缺血侧侧脑室移植正常NSCs和HIF-1αα基因沉默的NSCs。缺血7 d后,收集血清及脑匀浆液用于测定其炎性相关因子,探讨HIF-1α在侧脑室移植NSCs进行脑损伤修复过程中可能发挥的作用,及其与炎症调节之间的关联。5新生小鼠随机分为4个组:空白对照组(Sham),缺血缺氧模型组(HI),2ME2组(2ME2)和DMOG组(DMOG)。小鼠右侧颈总动脉永久结扎,并进行30min低氧处理,建立缺血缺氧模型。选择2ME2作为HIF-1a蛋白表达抑制剂,DMOG作为PHD的活性抑制剂,即HIF-1a激活剂。通过缺氧/缺血后腹腔内注射后2ME2和DMOG进行干预,采用western bloting技术测定缺血缺氧后新生小鼠脑组织HIF-1a及VEGF表达量。采用western blotting方法测定缺血缺氧后脑组织中caspase 3表达量,研究HIF-1a及VEGF水平对缺血缺氧后新生小鼠大脑皮层凋亡的影响。6采用NSCs的特异性标志物巢蛋白Nestin及增殖细胞核抗原PCNA抗体对缺血缺氧大脑SVZ区内的NSCs进行鉴定和增殖标记。基于上述实验分组,采用免疫荧光双标方法检测缺血缺氧后对新生小鼠大脑SVZ区神经干细胞增殖情况,并研究HIF-1α和VEGF蛋白水平对SVZ区神经干细胞增殖的影响。7.采用DCX抗体评价神经前体细胞迁移活性,神经元特异性核抗原(NeuN)抗体可标记成熟的神经元。采用免疫荧光双标方法检测缺血缺氧后对新生小鼠大脑SVZ区及皮层神经干细胞分化情况,评价缺血缺氧后,HIF-1α和VEGF蛋白水平对新生小鼠大脑室管膜下区及皮层神经干细胞分化的影响。结果1胎鼠海马NSCs分离培养和鉴定体外成功分离培养胎鼠海马NSCs,经鉴定,其纯度达95%以上。2各实验组缺血7 d后大鼠神经功能改善、脑组织水肿及梗死情况(1)Model组神经行为评分显着高于Sham组(p<0.05),说明造模成功。人参皂苷治疗组和侧脑室移植NSCs治疗组能显着改善动物局灶性脑缺血后7天的神经损伤症状(p<0.05)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同改善大鼠脑缺血后神经损伤效果更明显。(2)缺血损伤后,model组大鼠脑组织出现明显白色缺血区域。人参皂苷和移植神经干细胞均可显着缩小脑缺血面积,减少梗死体积(p<0.01)。人参皂苷和移植NSCs共同进行治疗时,二者有很好的交互作用,协同改善缺血后脑梗塞体积。(3)脑缺血7 d,model组脑水肿率明显大于Sham组(p<0.05),而人参皂苷和移植神经干细胞均可明显改善脑缺血7 d后大鼠的脑水肿情况(p<0.05)。3 ELISA方法测定在血清和组织匀浆液中的炎性相关细胞因子(1)脑组织匀浆液中炎性因子水平缺血缺氧7 d,model组大鼠脑组织匀浆液中的炎性细胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-α)均有显着的提高(p<0.01)。IL-1β水平在侧脑室NSCs移植治疗组,人参皂苷治疗组及侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组IL-1β水平均显著降低(p<0.01)。IL-6水平在侧脑室NSCs移植治疗组、人参皂苷治疗组及侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组均有所降低,但差异无显着性意义(p>0.05)。TNF-αα水平在侧脑室NSCs移植治疗组,人参皂苷治疗组及侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组TNF-α水平均显著降低(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同降低大鼠脑缺血损伤验证级联反应中TNF-α水平。(2)脑组织匀浆液中抗炎细胞因子水平缺血缺氧7 d,model组鼠脑组织匀浆液中的抗炎细胞因子(IL-4,IL-10)均有显着的提高(p<0.05)。IL-4在各个治疗组水平均显着升高(p<0.05)。IL-10水平在侧脑室NSCs移植治疗组、人参皂苷治疗组、侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组均有所升高,差异有统计学意义(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同升高大鼠脑缺血损伤验证级联反应中IL-10水平。(3)大鼠血清中粘附分子水平缺血缺氧7d,model组大鼠血清中的趋化因子(ICAM-1)显着升高(p<0.01)。ICAM-1水平在各个治疗组均降低,差异有统计学意义(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同降低大鼠脑缺血损伤验证级联反应中粘附分子ICAM-1水平。(4)脑组织匀浆液及血清中趋化因子的水平缺血缺氧7 d,model组大鼠脑组织匀浆液中的MCP-1及血清中CXCL-1均显着提高(p<0.01)。MCP-1水平在侧脑室NSCs移植治疗组及人参皂苷治疗组有所降低,但无显着性差异(p>0.05),侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组MCP-1水平显着降低(p<0.01)。趋化因子CXCL-1水平在侧脑室NSCs移植治疗组、人参皂苷治疗组、侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组均有所降低,差异有统计学意义(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同降低大鼠脑缺血损伤验证级联反应中趋化因子CXCL-1的水平。4 HIF-1α在侧脑室移植NSCs进行脑损伤修复过程中发挥的作用(1)慢病毒转染NSCs的最佳MOI值为10,最佳转染时间为转染后144 h。(2)神经功能学评分:侧脑室NSCs移植治疗组能显着改善大鼠局灶性脑缺血后7天的神经损伤症状(p<0.01),LV-NSCs移植治疗组神经行为评分情况与模型组相比,差异无统计学意义(p>0.05),其对缺血后大鼠神经功能改善作用不明显。(3)NSCs侧脑室移植对脑组织匀浆液及血清中炎性相关因子的影响①炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平在LV-NSCs移植组有降低趋势,但差异无统计学意义(p>0.05)。②抗炎细胞因子IL-4在LV-NSCs移植组有所升高,但差异无统计学意义(p>0.05);IL-10水平在LV-NSCs移植组降低,差异有统计学意义(p<0.01)。③趋化因子MCP-1水平在侧脑室LV-NSCs移植组有所降低,但无显着性差异(p>0.05),CXCL-1水平在LV-NSCs移植组降低,差异有统计学意义(p<0.01)。④趋化因子ICAM-1水平在LV-NSCs移植组降低,差异有统计学意义(p<0.01)。5 Western Blot检测新生小鼠皮层中HIF-1α和VEGF蛋白表达量在缺血缺氧条件下,HIF-1α和VEGF蛋白表达量上调。DMOG显着上调缺血缺氧后新生小鼠脑皮层HIF-1α和VEGF蛋白表达量,而2ME2下调HIF-1α和VEGF蛋白表达量。6 DMOG及2ME2对缺血缺氧后新生小鼠大脑皮层凋亡的影响正常状态下,凋亡因子caspase3低表达;缺血缺氧早期,caspase3表达量有所增加,缺血缺氧24 h,caspase 3表达量显着增加,大脑皮层HIF-1α大量表达可能诱导细胞凋亡。7缺血缺氧后HIF-1α和VEGF蛋白水平对新生小鼠大脑室管膜下区NSCs增殖的影响缺血缺氧后大脑SVZ区HIF-1α/Nestin、VEGF/Nestin双标的阳性细胞数目显着增多,2ME2有效降低了 HIF-1α/Nestin、VEGF/Nestin阳性标记细胞数量,DMOG使缺血缺氧后HIF-1α/Nestin、VEGF/Nestin阳性标记细胞数量显着增加。8缺血缺氧后HIF-1α和VEGF蛋白水平对新生小鼠大脑室管膜下区及皮层NSCs分化的影响正常状态下,DCX/PCNA,NeuN/PCNA低表达,缺血缺氧早期,DCX/PCNA表达量有所增加,给予2ME2干预后,缺血缺氧4 h及24 h DCX/PCNA表达量下调,DMOG干预组DCX/PCNA阳性表达细胞明显增多。缺血缺氧2 w,NeuN/PCN表达量显着增加,给予2ME2干预后,NeuN/PCN表达量下调,DMOG干预组NeuN/PCN阳性表达细胞明显增多。结论基于炎症系统,异体移植神经干细胞通过调节炎性相关因子水平发挥了抗脑缺血作用,中药人参皂苷发挥了协同增效的作用。HIF-1α和VEGF蛋白高表达促进了缺血缺氧损伤后脑内神经干细胞的增殖以及分化,促进了神经发生,修复了脑损伤。
王霞[9]2003年在《神经干细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤》文中指出尽管当今围产期监测、孕期和新生儿监护等方面的医疗技术取得了长足的发展，但近十年来，新生儿缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)的发生率却无明显降低，平均每1000个活产足月儿中，就有3～4个婴儿发病，早产儿的发病率更高，其中10％～60％在新生儿期死亡，25％以上的患儿遗留永久的神经心理缺陷，如脑瘫、精神发育迟滞、学习困难和癫痫。而且，目前的治疗仅局限于支持疗法，而没有直接阻止脑损伤进程或促进损伤神经再生的措施。神经组织或细胞移植为恢复损伤的神经系统功能提供了有希望的新途径。在最开始的移植研究中，研究者多采用胎脑组织或细胞作为移植的供体，胎脑组织具有抗原性低和能够无氧代谢等特点，移植后易于存活，并能与宿主脑整合，可产生较好的治疗效果。但胎脑组织移植要求“点对点”移植，不同的移植部位需要来源于相对应部位的脑组织，否则就不能形成正常的纤维投射，————而且胎脑组织来源有限，还面临着医学伦理学的问题，临床应用受限，因此近年来人们致力于寻找其他的供体。癌细胞系和永生化的细胞系移植治疗缺血性脑损伤也取得了良好的疗效，但由于细胞类型单一而且存在致癌危险性也限制了它的使用；骨髓基质细胞出one marrowsromal cells，BMSCs）移植可明显改善脑损伤后的神经功能缺陷，由于其分化为神经细胞的比例低，其治疗机制认为主要与其分泌的多种细胞因子有关。BMSCS移植后能否分化为有功能的神经元，目前尚无定论，而且移植后会在脑内遗留许多非神经系统的细胞，作为移植的供体，其利弊还需进一步斟酌。神经干细胞（neural stem cells，NSCS）可在体外传代、长期培养、大量增殖，也可低温保存而维持其末分化、未成熟、多潜能的特性不变，经体外诱导可以分化为各种成熟的神经细胞表型，如神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞等；NSCS脑内移植后，不仅可以在脑内发育、分化、成熟形成有功能的神经元，而且还能长期存活，接受局部的信号分化为相应的神经元，与宿主脑建立起复杂的神经联系。至今为止，尚未见NSCS脑内移植形成肿瘤的报道。NSCS作为脑移植的供体，克服了上述供体细胞的局限性，不难看出，NSCS在脑损伤的治疗上具有广阔的应用前景。 目前，在使用 NSCS移植治疗缺血性脑损伤的动物实验和临床实验中，均己取得了一定的疗效，但是这些研究结果大多来自于成年动物和成年人，治疗新生动物模型少见。由于成年期动物宿主对移植物的反应与新生期动物是不同的，因此，NSCS移植对治疗 HIE是否有效尚需进一步研究。 1二一 本研究旨在观察NSCs移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（hypoxic－ische加c brain damage，HIBD）模型神经行为和脑组织病理学的影响，以期为NSCs移植治疗新生儿HIE提供实验与理论依据；同时对脂质体介导外源性基因导入NSCs的条件进行优化，为NSCs作为基因治疗载体提供实验依据。 研究包括以下叁部分。一、大鼠胚胎神经于细胞的分离培养及鉴定 目的 建立胎鼠神经干细胞的分离、培养及分化鉴定技术；观察NSCs 的生长、增殖及分化的特点。方法 分离胎龄 14 d的Sprague－Dawlcy侣D）大鼠胚胎前脑皮质，经消化及机械吹打后采用无血清悬浮培养的方法获得细胞克隆。应用间接免疫荧光方法，鉴定NSCs和分化的神经细胞。结果 从SD大鼠胚胎前脑皮质分离的组织经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力。原代和传代细胞抗原nestin呈阳性。分化后的细胞可表达神经元和星形胶质细胞的特异性抗原NF七00和GFAP。结论 胎鼠NSCs具有自我更新和分化潜能，有很强的增殖能力，经体外培养能够分化成为神经元及星形胶质细胞。二、绿色荧光蛋白转染胚鼠神经干细胞 目的 探索脂质体介导目的基因转染NSCs的最佳条件，为NSCs移植研究提供追踪的方法，为NSCs作为基因治疗的载体提供实验依据。方法 分离培养胚胎大鼠NSCS，使用pEGFP（。作为报道基因，5脂质体Lipofectamne 2000一起转染NSCs，观察脂质体 ill 扛 一 转染后绿色荧光蛋白的表达的量效与时相关系；筛选稳定表达绿色荧 光蛋白（reen luorescent protein，GFP）的细胞克隆，观察其生长特 性：将筛选出的细胞克隆用立体定位仪植入新生＊D大鼠侧脑室内， 观察绿色荧光蛋白的表达。结果 使用脂质体Lipofectalnine 2000 介导绿色荧光蛋白质粒转染NSCs，转染时间在5～8小时左右，脂 质体（卜1）／＊＊A（卜9比值在1二与1：2之间，＊FP表达高峰在 转染48小时左右；转染GFP基因的NSCS的生长特性无明显改变， 诱导分化后仍然能有效表达GFP，移植到新生SD大鼠侧脑室后，在 体内也可有效表达GF
王桂芬, 栾佐, 高宝勤, 尹国才, 白洁[10]2008年在《人神经干细胞移植到缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的存活及分布》文中研究说明目的:新生儿缺氧缺血性脑病是导致脑性瘫痪的重要原因,至今缺乏有效疗法。将体外培养的人神经干细胞经脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生鼠,观察植入细胞在宿主脑内的存活、迁移及分化。方法:实验于2005-01/09在解放军海军总医院儿科实验室完成。①对象:神经干细胞来源于孕12周流产的人胎儿脑组织,孕妇签署知情同意书,符合医院伦理委员会规定。清洁级SD新生鼠80只,随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组,40只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:取人胚胎脑组织,机械分散法分离单个核细胞,接种于添加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中,获取生长旺盛的人神经干细胞球,制成单细胞悬液,浓度约为5.0×1011L-1,培养6d后行PKH标记用于植入后示踪。两组新生鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型,造模后3d,细胞移植组损伤侧脑室缓慢注入5μL人神经干细胞悬液,模型对照组于相同部位注入等量生理盐水。③实验评估:取未经PKH标记的细胞球,通过免疫细胞化学染色鉴定巢蛋白的表达及其向神经元、星形胶质细胞的分化情况。分别于细胞移植后1,2,4周及3个月,常规取脑组织,行免疫组织化学和荧光分析,观察植入后细胞存活及分布情况。结果:在造模及细胞移植过程中,因麻醉、出血细胞移植组新生鼠死亡5只,模型对照组死亡7只,存活率85%~90%。①神经干细胞的鉴定及分化:80%活细胞巢蛋白呈阳性表达,并可分化为神经元、星形胶质细胞。②神经干细胞植入后存活及分布情况:植入后1周,神经丝蛋白阳性细胞多位于损伤侧皮质及海马处,纹状体、脑干、小脑、嗅球也有少量分布。植入后2周,海马和皮质可见神经丝蛋白阳性细胞,胞体伸出的神经微丝更长,细胞数量与1周时基本相似。植入后4周及3个月时PKH阳性细胞数量明显减少。结论:在含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中形成的人神经干细胞球,具有良好的增殖能力,可分化为神经元,移植至缺血缺氧新生鼠脑中能够向损伤区迁移,分布范围广。
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