【中图分类号】Ｒ５４１．４【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７２－３７８３（２０１５）０７－０３８７－０２【摘要】目的观察大鼠骨骼肌缺血预适应对心肌缺血／再灌注后炎症因子ＭＣＰ．１的影响。方法间断阻断股动脉建立骨骼肌缺血预适应模型，２４ｈ后开胸结扎冠状动脉建立心肌Ｉ／Ｒ模型。实验大鼠随机分为正常对照组（Ｃ）、缺血／再灌注组（Ｉ／Ｒ）、缺血预适应组（ＩＰＣ＋Ｉ／Ｒ）。观察各组炎症细胞浸润程度、心肌细胞凋亡指数及ＭＣＰ．１的表达水平。结果与缺血／再灌注组比较，缺血预适应组炎症细胞浸润减少（４５．４３±５．９８ｖｓ１１５．８０±１２．７４），心肌细胞凋亡减少（２１．４８％ ±１．８６％ｖｓ３１．１５％ ±３．８４％），ＭＣＰ．１表达减少（１２．２３％ ±３．００％ｖｓ２８．６３％ ±５．１７％），差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）；细胞凋亡与心肌炎症细胞浸润、ＭＣＰ．１表达相关（ｒ＝０．８７，Ｐ＜０．０１；ｒ＝０．７７，Ｐ＜０．０１），炎症细胞浸润与ＭＣＰ．１表达水平呈高度正相关（ｒ＝０．８４，Ｐ＜０．０１）。结论骨骼肌缺血预适应通过减少炎症细胞浸润、ＭＣＰ．１表达，保护心肌。
【关键词】缺血再灌注损伤；骨骼肌缺血预适应；单核细胞趋化蛋白．１心肌缺血／再灌注损伤的机制尚未完全阐明，微循环无复流［１］、能量代谢障碍、炎症细胞浸润、氧自由基的过度释放、最终导致细胞坏死或凋亡，炎症细胞激活和血管内皮受损作为缺血／再灌注损伤机制的启动因素，在缺血／再灌注损伤机制中起重要作用。单核细胞趋化蛋白．１（ＭＣＰ．１）是近几年发现的细胞因子，可趋化单核细胞聚集于受损内膜下，介导血管炎症反应，在动脉硬化、急性冠脉综合征、急性心肌梗死的发生、发展起重要作用。关于骨骼肌缺血预适应与炎症因子ＭＣＰ．１的关系，目前尚无相关研究。
一．材料与方法（一）材料与试剂ＴＵＮＥＬ细胞凋亡检测试剂盒购于凯基生物公司，ＳＰＭｏｕｓｅＨＲＰＫｉｔ试剂盒购于北京康为世纪生物技术有限公司，ＭＣＰ．１小鼠抗大鼠多克隆抗体购于Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ公司，ＨＸ．３００动物呼吸机，ＩＭＦ２．２１倒置显微镜均由哈尔滨医科大学附属第二医院实验室提供。
（二）动物与分组健康Ｗｉｓｔｅｒ青年大鼠２４只，１５０．２００ｇ，购自哈尔滨医科大学附属第二医院。
随机分为３组，每组８只。Ｃ组：左下肢股动脉只实施穿线，不提拉，２４ｈ后冠脉前降支只实施穿线，不结扎；Ｉ／Ｒ组：左下肢股动脉只实施穿线，不提拉，２４ｈ后冠脉前降支实施缺血３０ｍｉｎ／再灌注１２０ｍｉｎ［ＩＰＣ＋Ｉ／Ｒ组：左下肢股动脉实施３次缺血５ｍｉｎ／再灌注１０ｍｉｎ，２４ｈ后冠脉冠脉前降支实施缺血３０ｍｉｎ／再灌注１２０ｍｉｎ。
（三）方法１．大鼠骨骼肌缺血预适应和心肌Ｉ／Ｒ模型的制备大鼠以１０％水合氯醛（３．５ｍｌ／ｋｇ）腹腔麻醉，分离左下肢血管、神经，缝合线从股动脉、股静脉下穿过，向上提拉为缺血，放松为再灌注。
２４ｈ后大鼠再次麻醉，连接多道生物信号采集处理系统，连续监测标准Ⅱ导联心电图，气管插管。开胸，连接动物呼吸机，划开心包膜，以６／０无损伤缝线在动脉圆锥与左心耳交界下约３．４ｍｍ处结扎冠状动脉前降支，心电Ⅱ导联示ＳＴ段持续性抬高为结扎成功标志，剪开结扎线为再灌注。
（四）观察指标１．心肌形态学及炎症细胞浸润各组于再灌注结束末，取左心室组织，甲醛固定，石蜡包埋，ＨＥ染色，观察心肌细胞形态学变化；随机选取５个非重叠高倍镜视野（×４００），计数炎症细胞个数，取平均值，评价炎症细胞浸润程度２．ＴＵＮＥＬ细胞凋亡检测细胞凋亡检测采用ＤＮＡ原位末端标记法，按试剂盒说明书操作。光镜下正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核为深浅不一的棕黄色颗粒，随机各取５个非重叠高倍镜视野（×４００），计数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，计算心肌细胞凋亡率（ＡＩ）。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆ＡＩ＝凋亡心肌细胞数／心肌细胞总数。
３．ＳＰ法检测心肌ＭＣＰ．１表达心肌ＭＣＰ．１表达采用ＳＰ法染色，严格ＳＰＭｏｕｓｅＨＲＰＫｉｔ鼠Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ．ＨＲＰ试剂盒说明书操作。光镜下阳性细胞核、胞浆呈棕黄色，每张切片随机选择５个高倍镜视野（４００×），根据每张切片染色细胞百分率进行分析评定。
４．统计学方法以ＳＰＳＳ１１．０软件进行统计学分析，资料以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示。采用单因素方差分析，Ｐ ＜０．０５为差异有统计学意义，Ｐ ＜０．０１为差异有显著统计学意义。
二结果（一）光镜下心肌病理变化正常对照组心肌细胞结构完整，肌原纤维排列整齐；缺血再灌注组见多层心肌细胞变性、坏死较重，肌原纤维排列紊乱、断裂、分解，间质血管扩张充血；单纯预适应组见局灶性的心外膜下变性，点状坏死灶，或变性与坏死交替分布，大部分肌原纤维排列规整。
（二）光镜下炎症细胞浸润程度显微镜下，正常对照组心肌间质、血管周围未见明显炎症细胞浸润；与正常对照组（３１．６５±５．０２）比较，缺血再灌注组（１１５．８０±１２．７４）、缺血预适应组（４５．４３±５．９８）炎细胞浸润增加，差异有显著统计学意义（Ｐ＜０．０１），缺血预适应组见弥漫散在的炎细胞浸润，较缺血再灌注组炎症细胞浸润减少，差异有显著统计学意义（Ｐ＜０．０１）。
（三）光镜下心肌细胞凋亡与正常对照组（７．２０％ ±１．９５％）比较，缺血／再灌注组（３１．１５％ ±３．８４％）、缺血预适应组（２１．４８％ ±１．８６％）心肌细胞凋亡增加，结果有显著统计学差异（Ｐ＜０．０１），单纯预适应组较缺血／再灌注组心肌凋亡细胞减少，结果有显著统计学差异（Ｐ＜０．０５）。
（四）免疫组化心肌ＭＣＰ．１表达正常对照组细胞核及胞浆内基本无棕黄色颗粒沉着，与正常对照组（６．７８％ ±３．８％）比较，缺血／再灌注组（２８．６３％ ±５．１７％）、缺血预适应组（１２．２３％ ±３．００％）细胞核、胞浆呈棕黄色，ＭＣＰ．１表达有统计学差异（Ｐ＜０．０５）；缺血预适应组见散在棕黄色颗粒，与缺血／再灌注组比较ＭＣＰ．１表达减少，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。
（五）炎症细胞浸润、ＭＣＰ．１表达、细胞凋亡相关性分析炎症细胞浸润与细胞凋亡呈高度正相关（ｒ＝０．８７，Ｐ＜０．０１），免疫组化ＭＣＰ．１蛋白表达水平与细胞凋亡呈显著正相关（ｒ＝０．７７，Ｐ＜０．０１），炎症细胞浸润与免疫组化ＭＣＰ．１蛋白表达水平呈高度正相关（ｒ＝０．８４，Ｐ＜０．０１）。
讨论心肌缺血／再灌注损伤指心肌组织缺血一段时间，当血流重新恢复后，心肌组织的损伤程度较缺血时进一步加重，出现梗死范围扩大、血压骤降、心功能不全、心律失常甚至猝死等现象。内皮功能障碍及炎症细胞浸润被认为是心肌缺血再灌注损坏的启动因素，有研究在心肌缺血／再灌注模型中发现，再灌注５分钟，心内膜中性粒细胞就增加２５％，５小时后，心肌缺血区内白细胞聚集增加１０倍，血小板聚集增加２倍。单核细胞趋化蛋白．１（ＭＣＰ．１）属于趋化蛋白家族成员之一，Ｆｒａｎｇｏｇｉａｎｎｉｓ研究提示，在心肌梗死再灌注后５ｈ内，ＭＣＰ．１是招募单个核细胞进入梗死心肌的主要因素之一。临床观察发现急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、急性冠脉综合症患者血ＭＣＰ．１水平升高［２．３］，且与ｈｓ．ＣＲＰ水平一致［４．５］，ＭＣＰ．１可以作为继ｈｓ．ＣＲＰ后反映心血管疾病炎症细胞活化状态及冠状动脉斑块易损程度的可靠指标。实验中心肌缺血／再灌注组心肌细胞炎症浸润明显，ＭＣＰ．１表达量多，心肌细胞凋亡明显，且三者之间存在正相关，ＭＣＰ．１提示炎症细胞浸润程度，间接反应心肌缺血／再灌注损伤程度。而缺血预适应组炎症细胞浸润减少，ＭＣＰ．１表达减少，细胞凋亡减少，提示骨骼肌缺血预适应可以能减轻炎症反应，而ＭＣＰ．１有可能是潜在的治疗靶点。
参考文献［１］丁尚伟，李燕，吕清．心肌血流灌注定量分析的研究现状［Ｊ］．临床心血管病杂志，２００８，２４（６）：４０７．４１１．［２］ＷａｎｇＪＨ，ＺｈａｎｇＳＺ，ＪｉｎｙＰ，ｅｔａｌ．Ｅｌｅｖａｔｅｄｌｅｖｅｌｓｏｆｐｌａｔｅｌｅｔ．ｍｏｎｏｃｙｔｅａｇｇｒｅｇａｔｅｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｃｕｔｅｃｏｒｏｎａｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．ＩｎｔＪＣａｒｄｉｏｌ，２００７，１１５：３６１．３３６．［３］邓争荣，李尚俭，朱宏海，等．急性冠状动脉综合征患者血清单核细胞趋化蛋白．１和干细胞因子的变化［Ｊ］．临床心血管病志．２０１１，２７（７）：５１０．５１３．［４］彭杰成，严卫国．不稳定型心绞痛患者血浆超敏悦反应蛋白和单核细胞趋化蛋白．１的变化及临床意义［Ｊ］．广东医学，２０１１，３２（２４）：３２４３．３２４５．［５］郑玉云，郭晓华，马江伟，等．阿托伐他汀对冠状动脉介入治疗术后血清单核细胞趋化蛋白．１、白细胞介素．６和高敏Ｃ反应蛋白的影响．临床心血管病杂志，２００９，２５（７）：４９１．４９３．［６］温州医科大学附属台州医院老年干部科［７］哈尔滨医科大学附属第二医院老年医学科
论文作者:王月平１（通讯作者） 何双英１ 武小薇２ 张一娜２
论文发表刊物:《健康必读》2015年第7期供稿
论文发表时间:2015/8/17
标签：心肌论文; 细胞论文; 炎症论文; 凋亡论文; 骨骼肌论文; 统计学论文; 蛋白论文; 《健康必读》2015年第7期供稿论文;