关键词：糖氧剥夺/再灌注; 内质网应激; 中脑星形胶质细胞源性神经营养因子; 右美托咪定; 神经保护;
右美托咪定 (DEX) 是高选择性α2-肾上腺素能受体激动剂, 广泛用于镇痛、抗焦虑和镇静, 临床上作为麻醉剂的佐剂。1999年末, 美国批准DEX作为镇静剂用于重症监护。近年的动物损伤模型研究证明DEX具有神经保护这一特性。迄今, 鲜有研究发现DEX具有药物毒性代谢产物。DEX神经保护作用特性越来越受到广泛关注。本文对有关DEX神经保护作用的现状综述如下, 为基础研究和临床应用提供依据。
1材料与方法
1.1OGD/R模型的构建 参照文献[6]的方法以全反式维甲酸 (ATRA) 与十四烷酰佛波醇乙酯酸 (TPA) 序贯诱导人源性神经母细胞瘤 (SH-SY5Y) 分化为神经细胞, 序贯诱导6d后, 将完成分化的神经细胞均分为六组。根据预实验结果, 选择OGD12h/R12h作为构建OGD/R模型的标准时间。D0、D1、D2、D3、D4、D5组在OGD/R开始即刻分别加入0、0.1、1、10、100、1000μmol/L右美托咪定。参照文献中的方法将需行OGD/R的上述6组细胞以无氧无糖平衡盐溶液完全置换含胎牛血清的DMEM培养基, 继而置于37℃、1%O2浓度和5%CO2浓度的三气培养箱内行OGD实验12h。待OGD结束后将各组细胞取出, 吸弃BSS, 每孔各加入100μl含胎牛血清的DMEM, 再置于37℃、5%CO2空气混合气孵箱再灌注12h。
1.2细胞存活率检测 将接种于96孔板内的神经细胞按照上述OGD/R模型构建步骤处理, 待处理结束后每孔各加入5g/L的四甲基偶氮唑蓝MTT10μl, 避光置于37℃培养箱继续培养4h。4h后吸弃孔内上清, 每孔加入DMSO 100μl, 于37℃水浴摇床上振荡10min。用酶标仪在570nm的吸光值下检测各组各孔的吸光度 (optical density, OD) 。每组实验至少重复3次。1.3细胞存活率的公式为:细胞存活率 (%) =MTT实验组OD值/MTT对照组OD值×100%。
细胞凋亡检测 将接种于6孔板内的神经细胞按照上述OGD/R模型构建步骤处理。待处理结束后吸取6孔板内上清液于10ml EP管, 0.25%胰酶消化收集细胞。PBS洗涤细胞两次, 弃上清, 每管加入400μl 1XAnnexin V结合重悬细胞, 再加入5μl Annexin-FITC, 混匀于2~8℃避光孵育15min。每管再加入10μl PI染色液混匀避光孵育5 min。流式细胞仪检测每组细胞的凋亡情况。
1.4ER应激相关蛋白质含量表达检测 根据上述两步检测结果, 选择效果最佳的右美托咪定浓度。随后选择保护效果确切组, 应用Westernblot法检测ER应激特异性蛋白-中脑星形胶质细胞源性神经营养因子 (mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF) 以及促凋亡蛋白caspase-3和CHOP的表达。于OGD/R结束后立刻收集细胞, 用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液冰上裂解细胞30min, 100℃变性15 min。SDS-PAGE凝胶电泳后湿转至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的PBST封存30min后, 加入适当稀释度的一抗室温孵育2h, PBST洗5min×6次, 加入适当稀释度的二抗室温结合1h, PBST洗5min×6次, ECL显影。计算灰度值, 其值代表蛋白相对表达量。
1.5统计分析 采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析。正态分布计量资料以 (±s) 表示, 细胞存活率与凋亡率的组间显著性检验采用单因素方差分析Dunnetts法;蛋白相对表达量的组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
根据MTT法和流式细胞凋亡检测结果, 本实验选择右美托咪定终浓度为10μM组进一步研究右美托咪定的神经保护作用机制与ER应激、MANF及促凋亡蛋白的关系。Westernblot法检测显示:与D0组比较, 右美托咪定10μM明显上调了MANF的表达 (P<0.01) , 并抑制了促凋亡蛋白caspase-3和CHOP的表达 (P<0.01) (图1) 。
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3讨论
近些年来关于右美托咪定的神经保护作用报道很多, 但具体的细胞水平的作用机制仍不明确。本研究根据以往的研究方法, 通过ATRA与TPA序贯成功诱导SH-SY5Y分化为成熟神经元细胞表型, 继而以细胞实验先期剥夺糖氧, 后期再灌注复氧的OGD/R模型模拟临床缺血-再灌注损伤。前期预实验结果显示OGD12h/R12h细胞存活率接近50%, 其细胞凋亡程度可供右美托咪定行药物实验保护干预, 这与其他的研究结果基本一致。因此选择OGD12h/R12h作为构建OGD/R模型的标准, 为在细胞水平上研究右美托咪定对缺血-再灌注损伤的神经保护机制奠定了实验基础。
有研究证实, 反复使用咪唑安定后可明显引起新生小鼠的神经细胞凋亡数目增加, Bcl-2/Bax的比值降低[2]。反复使用右美托咪定后新生小鼠神经细胞凋亡数目虽有增加但不明显, 且Bcl-2/Bax的比值与对照组相比无明显差异。所以右美托咪定是否能减轻苯二氮?类药物的神经毒性仍需进一步研究。丙泊酚起效迅速, 作用时间具有可控性, 被广泛的应用在全麻术中维持过程中, 特别是在无痛人流、无痛胃肠镜的应用中拥有独特的地位, 因此在临床麻醉上广泛应用。Dan Han等[3]研究者发现, 反复给予小剂量的丙泊酚对出生后7天的大鼠可能是安全的, 而反复中/高剂量的丙泊酚将对大鼠的认知功能产生影响, 并引起海马神经元凋亡。近年来多项研究表明七氟烷对发育期大鼠具有中枢神经系统可以造成不同程度的损伤, 可以使凋亡信号分子半胱天冬酶3 (caspase-3) 增加。实验观察到出生6 d的小鼠经七氟烷麻醉后, 大脑内caspase通路和凋亡程序被激活, β淀粉样蛋白水平升高。右美托咪定减轻吸入七氟烷所致的新生SD大鼠海马区神经元损伤可能是通过降低p-p38MAPK的表达来实现的同时胶质细胞在中枢神经系统中起支持和营养神经元的作用, 还参与局部突触信号传递的调控过程。氯胺酮主要使用在小儿手术的麻醉。目前关于单次给于氯胺酮是否会引起神经损害仍存在争议, 这可能与物种差异有关。氯胺酮对啮齿类动物的神经毒性已有大量的研究证实, 均认为这种神经毒性表现为一种长期作用。作为非竞争性NMDA受体拮抗剂, 可使大鼠脑内NMDA受体上调;但当氯胺酮消退后, 上调的NMDA受体使细胞钙离子内流增加, 当超过自身调节能力时引起一系列病理生理变化如线粒体功能损伤、促进活性氧生成等, 最终导致细胞死亡。腹腔注射右美托咪定可有效改善利多卡因导致脊髓背角细胞凋亡, 目前认为与激活NF-κB有关。但也需关注使用NF-κB抑制剂PDTC后, 右美托咪定能影响神经病理性疼痛大鼠脊髓NF-κB蛋白表达, 减轻神经元凋亡, 仍需说明的是利多卡因毒性是多通道综合作用的结果, NF-κB仅减轻利多卡因毒性的通路之一, 仍有未知机制需继续探讨。右美托咪定在局麻药使用之前预先给药对于预防局麻药中毒是安全有效的。
参考文献
[1] YU J, SHAN S, NIE Y.Impact of local administration of various doses of dexmedetomidine on ropivacaine-induced lumbar plexussciatic nerve block[J].Exp Ther Med, 2018, 16 (2) :711-717.
[2] CORREA-SALES C, RABIN BC, MAZE M.A hypnotic response to dexmedetomidine, an alpha 2agonist, is mediated in the locus coeruleus in rats[J].Anesthesiology, 1992, 76 (6) :948-952.
[3] HUNTER JC, FONTANA DJ, HEDLEY LR, et al.Assessment of the role of alpha2-adrenoceptor subtypes in the antinociceptive, sedative and hypothermic action of dexmedetomidine in transgenic mice[J].Br J Pharmacol, 1997, 122 (7) :1339-1344.
论文作者:唐莹 陈华永 马丹丹 王雪 张华朋 刘堃
论文发表刊物:《中国医学人文》2020年4期
论文发表时间:2020/4/10
标签：细胞论文; 凋亡论文; 神经细胞论文; 存活率论文; 神经论文; 蛋白论文; 作用论文; 《中国医学人文》2020年4期论文;