黄海燕[1]2002年在《一个新的与生精有关的蛋白的特异性基因的分离、鉴定及功能研究》文中研究表明哺乳动物精子发生是一个复杂的增殖与分化过程，分为叁个主要阶段：A型精原细胞增殖和B型精原细胞分化为初级精母细胞；初级精母细胞通过减数分裂形成圆形精子细胞；精子细胞转变为成熟的精子。此期间多种基因的表达具有严格的时间和空间特异性。体细胞表达的结构性基因静止，而生精细胞特异的基因表达则被激活。分离、克隆不同发育阶段的差异表达基因，有助于深入研究它们在精子发生中的作用，阐明精子发生的机理。 在本课题组以前的工作中，已经采用组织形态学观察与mRNA差异显示逆转录聚合酶链反应(DDRT-PCR)方法相结合，对1、3周龄和成年(8周龄)大鼠睾丸表达的基因进行比较，发现了一个在成年大鼠睾丸特异表达的cDNA片段(CG14)，通过与GenBank数据库进行基因及EST(Expressed Sequence Tag)同源性比较发现，该片段为新的EST(登录号为AF 164432)。原位杂交结果表明，该片段主要在大鼠睾丸的初级精母细胞表达。本文通过Northern杂交，对CG14片段表达的组织特异性进行研究，发现该片段在睾丸组织大量表达，在附睾组织微弱表达，而在心、肝、肾、及脑组织中无表达。 鉴于CG14片段含有一个246bp的完整开放阅读框架，为了研究这个基因的功能，我们成功地构建了重组表达质粒pGEX3X-CG14，并在E．Coli系统高效表达了融合蛋白。利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析的方法纯化融合蛋白，以此为抗原，免疫日本大耳自家兔，制备了高效价的多克隆抗体。融合蛋白经Xa因子酶切获得分子量大约为8kD的CG14靶蛋白，免疫印迹实验表明，抗血清中含有CG14靶蛋白的特异性抗体。 用自行制备的抗体，对成年大鼠睾丸进行了靶蛋白的间接法免疫荧光细胞组织化学定位研究。结果显示CG14靶蛋白特异性存在于初级精母细胞的细胞浆。用Western Blot检查靶蛋白在成年SD大鼠心脏、肝脏、肾脏、脑、睾丸、附睾组织以及一周龄雄性SD大鼠睾丸组织中的分布，结果表明成年SD大鼠睾丸组织中存在的天然靶蛋白的分子量大约为14kD。而成年SD大鼠心脏、肝脏、肾脏、脑、附睾组织以及一周龄雄性SD大鼠睾丸组织中不存在阳性条带。 根据已知的CG14序列，设计3条基因特异性引物(GSPs)。采用5′RACE方法，对成年SD大鼠睾丸的反转录产物进行套式PCR扩增，获得目的基因的5′端序列，长度为715bp，通过与3′端的CG14序列进行拼接，得到全长cDNA
阳建福[2]2006年在《一个新的人类睾丸特异性基因-TDRG1的cDNA克隆及表达分析》文中研究说明越来越多的研究表明，生精障碍是导致男性不育的重要因素之一。精子生成是一个复杂的细胞发育与分化的过程，受一个由多个基因参与的基因网络的高度调控，这些基因可能既存在性染色体上，也存在常染色体上。分离生精相关基因是男性不育研究中的一个重要课题，研究和发现这些基因，对于阐明精子发生的机制具有重要的生理和病理学意义。 本课题运用了一种发现人类新基因的新策略“数据库消减杂交”(Digital Differential Display，DDD)——即通过计算机对不同文库进行比较来发现在统计学意义上存在明显转录差异基因的定量分析方法，结合RT-PCR、Northern杂交等实验验证成功克隆了一个人类睾丸组织特异性表达的新基因，并探讨了其与精子发生的关系。本研究分为2个部分，其主要实验方法及实验结果如下： 第一部分：数据库消减杂交方法克隆人类睾丸组织特异性表达新基因TDRG1 1 新基因的电子克隆 美国NCBI的Unigene数据库中拥有大量的表达序列标签(EST)，它们来源于不同组织、不同细胞、不同病理状态下所构建的cDNA文库，已成为人们寻找新基因的重要标志物。Digital DifferentialDisplay(DDD)是一种利用Unigene数据库中的ESTs进行数种平行材料之间的比较的方法。运用该方法，我们进行了两种平行材料之间的比较：挑选9个人类睾丸组织来源的cDNA序列文库作为检测子，并将之归为pool A；将76个人类其他组织或细胞株来源的cDNA文库序列作为驱赶子，并将之归为pool B；通过pool A：pool B之间的比值来计算倍数差异，并以≥10倍的差异为筛选标准，经数据库杂交筛选获得在统计学意义上存在差异显示的克隆重迭群。 在获得的29个全新克隆重迭群中，Hs.180197是其中一个其差异表达最显着的克隆重迭群，生物信息学分析显示其代表一个新基因，我们将之作为本课题的研究重点。Hs．180197包括3个EST，运用EST拼接工具进行序列匹配、整合，获得了一个新的未知序列contig1。将contig1与EST Human数据库比较，发现该序列包含另
参考文献：
[1]. 一个新的与生精有关的蛋白的特异性基因的分离、鉴定及功能研究[D]. 黄海燕. 中国协和医科大学. 2002
[2]. 一个新的人类睾丸特异性基因-TDRG1的cDNA克隆及表达分析[D]. 阳建福. 中南大学. 2006