陈宗艳[1]2008年在《DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用》文中指出鸭乙型肝炎病毒(Duck Hepatitis B Virus,DHBV)与乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus,HBV)同属嗜肝DNA病毒科,这类病毒的特征是有强的嗜肝细胞特性,在病毒形态、基因组结构、复制过程等生物学特性相似。DHBV感染鸭模型是研究HBV的生物学特性、致病机制和抗HBV药物的实验动物模型。本文通过调查四川地区麻鸭自然携带DHBV的情况,分离DHBV毒株,以此毒株为模板,扩增主要抗原基因preS。通过构建DHBV-preS原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化检测人工感染DHBV后在体内的蛋白定位分析与侵染规律,以期系统地了解的入侵方式和复制机理,为阐明DHBV的发病机制提供关键的实验数据。同时建立基于定量检测DHBV的FQ-PCR方法,用于DHBV疾病模型研究,并结合体外模型HepG2.2.15细胞研究抗乙型肝炎新药,结果如下:DHBV毒株的分离及分子特征解析结果表明:四川麻鸭自然携带DHBV 4%,证实四川麻鸭是研究实验性DHBV感染动物模型的良好鸭种;对分离到的其中3株DHBV阳性血清全基因克隆、测序并进行生物信息学分析,发现全基因组均含3006个核苷酸(GenBank登录号EU429324,EU429325,EU429326),具有X-like开放阅读框特征;进一步研究ORF-S还表明该基因编码33个氨基酸,有四个疏水区,无N-糖基化位点,也无豆蔻酰化位点,在1～30aa内有一个明显的信号肽,在19～20aa处有断点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白,抗原位点主要分布于preS区氨基酸序列中。根据DHBV-preS序列,设计一对特异性引物,以分离的DHBV毒株为模板扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将DHBV-preS基因正向插入原核表达载体pET-32a(+)的ApaI和NcoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a(+)/DHBV-preS。重组表达质粒pET32a(+)/DHBV-preS转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,能表达出了大小约为37kD的preS重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a(+)/DHBV-preS的最佳诱导条件为0.8mmol/LIPTG、37℃条件下诱导4h。表达产物用镍柱亲和层析纯化后,将得到的preS重组蛋白做梯度稀释,初步建立ELISA检测DHBsAb的方法(间接法);同时将纯化的重组蛋白与等量弗氏佐剂混合制备preS重组蛋白免疫原,四次免疫家兔,获得的兔抗DHBV-preS高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。建立DHBV-preS基因表达蛋白抗体介导的免疫组化方法;针对DHBV的保守序列设计并合成引物及荧光标记探针,建立实时荧光定量聚合酶链反应(fluorsescencequantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测方法。建立的标准曲线循环阈值(cycle threshold,Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.993,将其检测极限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为5copies/L,未检测到鸭病毒性肝炎、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌,表明FQ-PCR检测DHBV方法灵敏、特异性强。采用鸭乙型肝炎病毒人工方法感染1日龄四川麻鸭,攻毒后于不同时间采血分离血清,采集肝脏、胰腺、肾脏、脾脏等组织或器官,经建立的DHBV-preS基因表达蛋白抗体免疫组化方法和FQ-PCR方法检测DHBV在感染鸭体内侵染过程与定位分布,并结合组织学和血液生化指标对DHBV在感染鸭体模型侵染规律进行系统观察。结果显示:感染后2d可在血清和肝组织中检测出DHBV DNA,血清中DHBV DNA从感染后第10d～30d DHBV DNA的拷贝数保持在1.00E+09以上,肝组织中DHBVDNA的含量从感染后第5d～52d保持在5.00E+09以上;肝脏DHBV DNA第14d达到最高水平,而血清中DHBV DNA第22d达到最高水平。肝脏、胰腺、肾脏、脾脏的损伤程度与DHBV DNA水平成正相关;在感染后3～52d内的不同时间点从肝脏、胰腺、肾脏、脾脏及大脑六种组织器官中检测出DHBsAg,DHBsAg主要分布在细胞浆,少部分分布于细胞核,未能从食道、腺胃、肺、心脏、生殖器和肌肉中检测到DHBsAg,表明DHBV嗜肝的同时具有泛嗜性,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性;在感染后1～3d、52d以后各组织相继不能检出DHBsAg,感染后12～31d病毒在机体内各组织的分布最为广泛,感染后4d肝脏开始出现DHBsAg阳性细胞,感染后6d肾脏、胰腺、脾脏相继开始出现DHBsAg阳性细胞,而脑组织在感染后10d出现阳性细胞;肝脏的检出率最高,持续至52d,大脑的检出率最低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。DHBV感染后第4d,总蛋白和白蛋白含量开始降低,谷丙、谷草转氨酶活性升高(P＜0.01),乳酸脱氢酶活性升高(P＜0.01),肌酐和尿素有变化但无规律,表现为升高趋势,感染后44d开始,各项血液生化指标逐渐趋于正常值,表明DHBV引起肝脏损伤的同时累及肾脏。在建立的抗人类乙型肝炎新药体内药效评价的技术平台和体外模型HepG2.2.15上评价抗乙型肝炎新研制药物-核苷类似物(代号PNA)的作用。在HepG2.2.15细胞系中,PNA有明确的抑制HBV DNA复制作用,抑制HBsAg和HBeAg,在7.8～62.5μg/mL剂量范围内有剂量—时间依赖关系,未见到明显细胞学毒性;在鸭乙肝动物模型中,PNA对DHBV DNA抑制率达50%的最低用药剂量为口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kg PNA对DHBV的抑制率与拉米夫定口服组(50mg/kg)基本一致,可以减轻鸭脏炎症,抑制DHBsAg在肝脏中的表达。
李茹冰[2]2010年在《重组人白介素12治疗慢性乙型肝炎的药理学及机制研究》文中提出白细胞介素12(interleukin-12, IL-12)由P40和P35两个亚基通过多对二硫键构成复杂的异二聚体,是连接先天固有免疫与后天获得性免疫的桥梁,被认为是免疫系统抗病毒的核心调控因子。rhIL-12 (recombinant human interleukin-12)作为传染性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病和哮喘等的治疗药物,国外已进入临床试验,而国内对rhIL-12的研究尚处于临床前阶段。我们的体外初步药效学研究显示,rhIL-12与rHBsAg (recombinant hepatitis B surface antigen)联合应用,通过第3和第1信号共同调节慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者的免疫应答,可能是一个崭新的、有前途的抗HBV (hepatitis B virus)治疗策略。为此,我们对rhIL-12单独及与rHBsAg联合应用治疗CHB进行了系统的药理学研究,期望研发一种治疗CHB的新生物制剂。前期研究将IL-12的P35和P40亚基构建于同一载体中,成功获得稳定、高效表达rhIL-12蛋白的CHO (Chinese hamster ovary)工程细胞株,经过发酵罐连续培养、上清液纯化,得到纯度>95%的rhIL-12。进行了组分含量、理化性质、生物学活性、免疫学性质、纯度和杂质以及污染物的鉴定等全面质量研究,所制备的rhIL-12符合基因工程药物质量标准。本论文包括rhIL-12单独及联合rHBsAg用于CHB治疗的临床前主要药效学及其机制和药代动力学研究。1主要药效学1.1体外药效学以IFN-γ(interferon-gamma)作为评价rhIL-12生物活性的主要指标。健康人PBMCs (peripheral blood mononuclear cells)经0.005、0.01、0.1、0.5、1.0、2.0、10、80 ng/ml浓度rhIL-12刺激后,IFN-γ分泌增加,量-效曲线呈典型的S型,ED50 (effective dose 50)为0.0863±0.0032 ng/ml, R2=0.999。在0.01～1.0 ng/ml范围内,rhIL-12剂量依赖性增加IFN-γ分泌,故rhIL-12的优选剂量为0.01、0.1、1.0ng/ml。以1.0 ng/ml rhIL-12刺激健康人PBMCs,24h、48h、72h、96h和120h等5个时间点IFN-γ测定水平,结果表明,24h即有IFN-γ产生,随着时间的延长,IFN-γ含量增加,72h或96h达到峰值。综合分析并参考文献,优选72h作为IFN-γ的检测点。采用体外PBMCs诱生IFN-γ方法,比较本研究所用rhIL-12-GZ(广州恺泰生物科技有限公司产品)与国际标准品(rhIL-12-IS,购自英国NIBSC)生物活性的差异。在0.005、0.02、0.078、0.313、1.25、5.00、20.00、80.00ng/ml浓度范围内,rhIL-12-GZ与rhIL-12-IS量效曲线均呈典型的S型,且两曲线吻合良好(相关系数R=0.991, P=0.000)。0.005-1.25 ng/ml浓度对数和IFN-γ含量测定吸光度所作量效曲线呈线性,回归方程分别为rhIL-12-GZ:Y=3.016+1.147X; rhIL-12-IS:Y=3.030+1.048X,且两条回归直线也非常吻合(P=0.217)。上述结果说明本品生物活性与国际标准品基本相当。为研究rhIL-12对健康人及CHB患者PBMCs诱生IFN-γ和IL-4作用,取20名健康人和68名CHB患者(免疫耐受期21名、免疫清除期22名、非活动性HBsAg携带期19名)外周血,制备PBMCs,加入rhIL-12孵育72h。设rhIL-12低、中、高(0.01,0.1, 1.0ng/ml)叁个浓度组及生理盐水对照组。结果显示,rhIL-12剂量依赖性地提高健康人和CHB患者PBMCs产生的IFN-γ水平,且对CHB患者作用更强,不同分型的CHB患者IFN-γ水平基本无显著差异,各组IL-4均检测不到。这表明rhIL-12可增强不同临床分型的CHB患者Th1 (T Helper1 cell)细胞免疫功能,为rhIL-12作为免疫调节剂治疗CHB提供了依据。rhIL-12与rHBsAg联合应用的增强作用：制备9名健康人和15名CHB患者的外周血PBMCs,分别与rhIL-12 (0.01,0.1, 1.0ng/ml)、rHBsAg (0.5μg/ml)或rhIL-12 (0.01,0.1, 1.0ng/ml)联合rHBsAg (0.5μg/ml)孵育72 h。结果发现联合组诱生的IFN-γ明显高于单用rhIL-12或rHBsAg组,这提示rhIL-12联合rHBsAg有增加特异性细胞免疫应答作用。1.2体内药效学在BALB/c、C57BL/6J、HBV转基因小鼠和食蟹猴四种动物模型上进行。BALB/c小鼠皮下注射低、中、高剂量rmIL-12 (recombinant mouse interleukin-12,0.05,0.15,0.45μg/10g),并设生理盐水对照,3天给药1次,共2次。分别于给药前,给药后24h,给药后72h以及第2次给药后24h眼眶采血,检测血清IFN-γ的浓度。结果显示,rmIL-12第一次给药后小鼠血清中IFN-γ的浓度在24h达到高峰,且具有明显的剂量依赖性。72h时血清中的IFN-γ基本恢复到给药前水平。此时再给药1次,虽然仍有明显的量效关系,但给药后24h产生的IFN-γ浓度比第1次给药明显降低。本研究结果表明,rmIL-12在BALB/c小鼠体内能剂量依赖性诱生IFN-γ,增强细胞免疫作用,且rmIL-12诱生IFN-γ作用存在预处理效应。C57BL/6J小鼠皮下注射低、中、高剂量rmIL-12 (0.05,0.15,0.45μg/10g),并设生理盐水对照,3天给药1次,连续3次。给药前、第1次给药后24h和第3次给药后24h眼眶采血。结果显示,C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠血清中IFN-γ的分泌规律相似,即24小时达到高峰,rmIL-12低、中、高3剂量组与生理盐水组比较,IFN-γ含量剂量依赖性地显著升高(P均<0.001)。结果证明rmIL-12具有增强C57BL/6J小鼠细胞免疫的功能。HBV转基因小鼠腹腔注射低、中、高剂量rmIL-12(0.05,0.25,0.75μg/10g),并设生理盐水对照组,每周给药2次,共4周。给药前、第8次给药后检测血清HBV DNA。结果显示,rmIL-12第8次给药后,各剂量组DNA载量与NS组比较均无显着差异(P>0.05),但叁个剂量组HBV DNA均较给药前下降,只有低剂量组有统计意义(P<0.05)。本实验初步表明rmIL-12具有降低HBV转基因小鼠血清HBV DNA载量作用。食蟹猴分别皮下注射0.5,5.0,40.0μg/kg rhIL-12及0.5,40.0μg/kg rhIL-12联合rHBsAg。rhIL-12每周给药3次,共40次。疫苗的给药剂量为20μg/kg,每4周给药一次,共给药4次。检测外周血IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-α含量、rhIL-12中和抗体及T细胞亚群分布。对照组及单用rHBsAg组各时间点IFN-γ含量均测不出。rhIL-12的叁个剂量组及rHBsAg与rhIL-12联用组于首次给药后6h仅高剂量rhIL-12组IFN-γ含量可测,且显着高于对照组(P<0.001)；24h中高剂量rhIL-12组检测到IFN-γ且显著高于对照组(P<0.001)；至首次药后48h,与24h类似,IFN-γ进一步升高,rhIL-12高剂量联合组IFN-γ较单用组有升高趋势,但无统计意义。第二次药后24小时和第4次药后24小时,上述rhIL-12给药组所有动物均检测到IFN-γ,浓度达到峰值,与对照组比较均有非常显着意义(P<0.001),并且有一定的剂量关系。第7次和13次给药后24小时,仅部分检测到IFN-γ,并且浓度大幅下降,至第38次给药后24小时,几乎检测不到IFN-γ。40.0μg/kg rhIL-12与rHBsAg联用组在首次药后6、24、48h、IFN-γ产生量明显升高,和40.0μg/kg rhIL-12组比较,显示了一定的增强刺激作用。rhIL-12给药3周,rHBsAg疫苗给予4周后,所有动物均产生了抗IL-12的中和抗体。rhIL-12明显升高CD3及CD8细胞的百分率,明显降低CD4百分率及CD4/CD8比值。而单用rHBsAg对上述指标无明显影响,与rhIL-12联合显示了一定的增强作用。各实验组动物同时检测IL-2、IL-4、TNF-α水平,给药前后均无明显变化。提示rhIL-12可以诱生IFN-γ,而对IL-2、IL-4、TNF-α无影响,即Thl型细胞免疫反应占优势。2作用机制研究rhIL-12具有抗HBV作用是由于其能够诱生内源性IFN-γ,抑制HBV DNA复制。因此,我们探讨了IFN-γ的细胞来源及rhIL-12作用的信号转导途径。(1)8名健康人PBMCs分别与rhIL-12 (1ng/ml)、rHBsAg (0.5μg/ml)和lng/ml rhIL-12+0.5μg/ml rHBsAg体外孵育24h,采用流式细胞术检测CD4+IFN-γ+T细胞、CD8+IFN-γ+T细胞及CD56+IFN-γ+NK细胞百分比。结果显示,rhIL-12组CD8+IFN-γ+T细胞及CD56+IFN-γ+NK细胞百分比与对照组比较均有明显升高,且有统计学意义(P<0.05); rHBsAg组各细胞百分率升高不如rhIL-12组,与对照组比较无显着差异(P>0.05); rhIL-12与rHBsAg联合组CD8+IFN-γ+T细胞及CD56+IFN-γ+NK细胞百分比均较对照组明显升高,且有非常显着差异(P<0.01),其中CD56+IFN-γ+NK细胞与rHBsAg组比较均有显着差异(P<0.05)该结果提示rhIL-12诱生的IFN-γ主要来自CD56+ NK细胞、CD8+T细胞,其次是CD4+T细胞,rhIL-12与rHBsAg联合具有增强作用。(2)IL-12的生物学活性具有专一性,必须由高亲合力的IL-12R(interleukin-receptor)来介导。为进一步研究rhIL-12对IL-12R表达的影响,制备7名健康人PBMCs,分别与rhIL-12 (1ng/ml)、rHBsAg (0.5μg/ml)和1ng/ml IL-12+0.5μg/ml rHBsAg孵育72h,采用流式细胞术测定表达IL-12Rβ1、IL-12Rβ2的CD4+、CD8+、CD56+细胞数。结果表明：rhIL-12组表达p1和p2受体的各细胞亚群均有不同程度升高,且CD8+IL-12Rβ2和CD56+IL-12Rβ1上调幅度尤其明显,与对照组比较均有非常显着差异(P<0.01)。rHBsAg组受体阳性细胞增加幅度大于rhIL-12组,其中CD56+IL-12Rβ1升高较之有非常显着意义(P<0.01)。与对照组比较,CD4+IL-12Rβ1和CD8+IL-12Rβ1 P<0.05;-CD56+ IL-12Rβ1 P<0.001; CD4+IL-12Rβ2和CD56+IL-12Rβ2 P<0.05; CD8+IL-12Rβ2 P<0.01。rhIL-12与rHBsAg联合组表达IL-12Rβ1、IL-12Rβ2的CD4+、CD8+、CD56+细胞数增加,与对照组比较均有显着差异(P<0.01或P<0.001),但CD4+IL-12Rβ2除外。联合组增加幅度大多明显高于单用rhIL-12或rHBsAg组,其中CD8+IL-12Rβ1和CD56+IL-12Rβ1与单用rhIL-12或rHBsAg组比较均有显着差异(P<0.05和P<0.01)。这表明rhIL-12和rHBsAg单独均能上调健康人PBMCs表面IL-12R的表达,且rhIL-12联合rHBsAg有增强作用。3 rhIL-12在食蟹猴体内的药代动力学3.1125I-rhIL-12的分布及代谢动力学采用Na125I标记结合叁氯醋酸(trichloroacetic acid, TCA)沉淀蛋白的方法,研究了rhIL-12在食蟹猴体内的分布、动力学、排泄及血浆蛋白结合等。125I-rhIL-12的放化纯度为95.6±1.9(%),平均比活度为197.72 Bq/ng,生物活性与未标记对照品效价无显着性差异,检测的定量下限LOQ (limit of quantitation)为0.02 ng-当量／g(ml)。酸沉淀方法学确证表明,本方法基本满足分布试验要求。食蟹猴皮下注射125I-rhIL-12后,TCA沉淀放射性AUC (area under curve)和总放射性AUC排序均为肠内容>血>肾脏>>肌肉>脑,这表明该药主要分布在肠、血及肾脏,药物不易透过血脑屏障。总放射性AUC排序尿、胆汁高于肠内容,与尿、胆汁中含有大量降解的水分子放射性有关。给药后血清TCA沉淀放射性和总放射性AUC(o-t)分别为158.77±16.00和216.07±28.18 ng-当量·h/ml; Cmax (maximum concentration)分别为6.62±0.57和7.91±0.39 ng-当量/ml, Tmax(peak time)均为5.33±1.15 h; MRT(mean resistance time)分别为21.82±1.21和22.96±2.02 h；CL(s) (clearance)分别为11.30±1.25和8.36±1.36 ml/kg/h; Vd(distribution volume)分别为0.35±0.02和0.26±0.01 L／kg；消除相半衰期分别为21.82±1.02和22.19±3.47 h。168 h尿、粪分别累计排出注入放射性量的84.4±6.0(%)和0.96±0.17(%),尿、粪合计排出注入放射性量的85.33±5.82(%)。这说明rhIL-12主要经尿排泄,少量经粪、胆汁中排出。尿中主要排泄代谢物,无原形,而胆汁中代谢物与原形并存。体外血浆蛋白结合试验表明,125I-rhIL-12无血浆蛋白结合现象。3.2 rhIL-12的药代动力学及药效动力学为研究rhIL-12在食蟹猴体内的PK (Pharmacokinetics)及PD(Pharmacodynamics),设rhIL-12低、中、高(0.15,0.30,1.50μg/kg)皮下注射组,rhIL-12(0.60μg/kg)静脉给药组及rhIL-12与合用rHBsAg组(0.30μg/kgrhIL-12 SC+20μg/kg rHBsAg IM),上述组动物单次给药。低剂量组兼做连续给药组,每4天给药一次,连续给药5次代谢动力学样品采集单次皮下给药组(低、中、高、合用rHBsAg组)：于给药前、药后2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h、120h及168h各取全血约1ml。静脉给药组：于给药前、药后1min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h、120h及168h各取全血约lml。连续给药组：于首次药前、药后2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h；第2、3、4次药前、药后8h；第5次药前、药后2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h、120h及168h各取全血约1ml。药效动力学样品采集连续给药组动物于给药前、首次药后8、24、48、72h,第2、3、4次药前、药后8、24、72h,及第5次药前、药后8、24、48、72h采集取全血约1ml。rhIL-12高剂量组动物于给药前、首次药后8、24、48、72h采集取全血约lml。用ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)方法测定血清中rhIL-12浓度,求算PK参数,方法的定量下限为0.05 ng/ml。同时采用ELISA方法检测连续给药组及高剂量组动物血清中IFN-γ的含量,研究rhIL-12药效动力学。低、中、高剂量组的AUC(0-t)分别为9.03±2.85、25.34±7.20和186.65±67.32h·ng/ml; AUC(0-∞)分别为10.52±3.26、26.43±8.25和190.66±70.55 h·ng/ml; Cmax分别为.0.50±0.14、0.95±0.33和8.14±3.21 ng/ml; Tmax分别为6.50±1.91、7.00±1.15和6.00±2.31 h; MRT分别为11.69±2.73、27.67±14.50和23.74±7.21 h；T1/2分别为10.04±4.82、22.91±15.52和19.75±10.06 h；CL分别为15.88±7.00、12.25±3.85和8.89±3.85 ml/h/kg; Vd分别为213.92±85.72、341.88±147.37和287.53±273.27 ml/kg;绝对生物利用度F分别为65.16%,54.57%,78.72%,平均为66.15±12.11(%)。低、中、高剂量组间的剂量比为1:2:10; Cmax之比为1：1.91：16.31；AUC(0-t)之比为1：2.81：20.68。该结果表明rhIL-12单次皮下注射的PK基本呈现线性动力学特征。合用rHBsAg组的动力学参数与等剂量的rhIL-12组相比,无统计差异,即rHBsAg对rhIL-12的代谢行为无影响。连续皮下注射给药5次后,因出现抗rhIL-12抗体,血清中的rhIL-12基本检测不到,无法计算rhIL-12连续给药后的动力学参数。连续给药组动物IFN-γ产生率较低,大部分时间点的样本无法检测到IFN-γ或数值低于最低可靠定量限(lowest limit of quantitation, LLOQ)。首次仅有1只动物血清可检测到IFN-γ，72h时浓度最高,较血清rhIL-12达峰时间(4-8h)推后。高剂量组动物血清全部能检测到IFN-γ, rhIL-12在体内的药效反应与给药剂量成正相关,其数值明显高于同期连续给药组(低剂量组)。血清中IFN-γ的达峰时间在24h～72h之间,较血清rhIL-12达峰时间(4-8h)推后。
罗秀[3]2013年在《六月青多糖及其皂苷对鸭乙型肝炎的治疗作用及分子作用机制研究》文中指出目的：观察六月青多糖(LYQP)及其皂苷(LYQS)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)及体内抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用。方法：(1)体外抗HBV作用：采用MTT法检测LYQP及LYQS对转染HBV DNA全基因组的HepG2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)及最大无毒浓度(TCo)；采用直接加药法观察在TCo条件下不同浓度的药物对HepG2.2.15细胞的作用,分别在第72h和第144h收集细胞培养上清液,采用ELISA法检测上清液中HBsAg和HBeAg的滴度,采用荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测上清液中HBV DNA的含量。(2)体内抗DHBV作用：用1日龄广西麻鸭感染DHBV,7d后用普通PCR法筛选出DHBV感染强阳性鸭。随机分成8组：LYQP高、中、低剂量组；LYQS高、中、低剂量组；模型组和阿昔洛韦(ACV)阳性对照组。每组10只,每组雏鸭均连续灌胃14d。分别于用药前(To)、用药后7d(T7)、14d(T14)及停药3d(P3)后采血,采用ELISA法检测血清中DHBsAg和DHBeAg的滴度,用FQ-PCR法检测血清中DHBV DNA的含量。同时检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,HE染色观察鸭肝脏组织的病理学变化。结果：(1)体外抗HBV作用：①LYQP及LYQS对HepG2.2.15细胞的毒性较低,TC50分别为111.77mg/mL;90.46mg/L; TC0分别为11.88mg/mL;1.59mg/L。②无毒浓度下不同浓度的含药培养液在HepG2.2.15细胞的培养中可有效的抑制HBsAg及HBeAg的分泌和HBV DNA的合成,抑制作用有明显的时效及量效关系。③TI都大于2,是高效低毒的抗HBV药物。(2)体内抗DHBV作用：给药后,与模型组比较,LYQP及LYQS各剂量组鸭血清中DHBV DNA的含量显着降低(P<0.∞或P<0.01),停药3d后,中、低剂量组及ACV组血清中DHBV DNA的含量有回升现象,高剂量组DHBV DNA的回升现象不明显。与模型组比较,LYQP及LYQS各剂量组能降低鸭血清中AST及ALT的活性,给药前后血清中DHBsAg及DHBeAg的OD值变化与DNA的含量改变相似；药物的抗病毒效果与剂量大小及时间有一定关系。此外,鸭肝脏组织病理学检查发现LYQP及LYQS对DHBV引起的肝损伤有明显的保护作用。结论：LYQP及LYQS体内外均有显着的抗HBV作用,同时能减轻DHBV所致的鸭肝损伤,改善肝功能。
沈海容[4]2014年在《红背叶根提取物抗乙肝病毒和抗肝损伤的药效学研究》文中进行了进一步梳理研究背景：乙肝是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的,以肝脏损害为主的一种严重危害人类健康的传染性疾病,具有传染性强,流行面广和发病率高等特点。HBV感染呈世界性分布,流行区域包括亚洲、南太平洋、澳大利亚、新西兰、南美、中东、亚撒哈拉非洲和北极圈的土着。全世界大约有20亿乙型肝炎病毒感染者,每年由于急慢性HBV感染而死亡的人数高达100万,至2004年全球HBV慢性感染者已达4亿,我国有1.3亿HBV携带者,占世界乙肝感染者的30%。研究发现,“无症状乙肝病毒携带者”中60%-70%肝活检病理报告为慢性迁延性肝炎或慢性活动性肝炎,长期的乙肝病毒感染可发展为肝硬化,甚至肝癌。因此抗乙肝病毒治疗,阻止疾病的进一步发展是关键,而研究开发抗病毒效果好、副作用低的新药是势在必行。目前抗乙肝病毒药物的筛选主要通过体内动物和体外细胞模型实验进行。体内动物模型用得最多的是鸭乙型肝炎病毒(DHBV)模型。因家鸭易于喂养,因此该动物模型已广泛应用。该动物模型分为先天感染模型和后天感染模型两种,国外多采用前者,而国内则多采用后者。DHBV模型主要用于病毒复制试验、免疫学试验以及抗病毒药物的试验等叁方面。在抗乙肝病毒药效学的研究中,DHBV模型一直是较为公认的动物模型。体外实验模型主要是HepG2.2.15细胞。HepG2.2.15细胞株系由美国The Mount Sinai Medical Center于1986年建立,并且已成功地应用于抗HBV药物的筛选,作为抗HBV作用的指标,被中国卫生部收载于治疗肝炎的中药新药药效学研究指南。此模型对中药成分抗病毒研究比较合适,已成功的对叶下株、水芹、大黄等数十种成分进行了实验研究。肝损伤是肝病的病理基础。肝损伤的发生机制颇为复杂,可分为化学性和免疫性。化学机制主要通过细胞色素P450及结合反应产生的中间代谢产物产生损伤,如改变质膜的完整性、线粒体功能失调细胞内离子浓度变化、降解酶的活性和自由基的作用等；免疫机制则通过细胞因子、一氧化氮、补体及免疫变态反应等产生损伤。肝炎病毒是最为常见的致肝损伤原因。目前,多数学者认为乙型肝炎病毒感染引起的肝损伤主要与机体免疫应答有关。同时自身免疫性刺激、病毒或寄生虫感染也是肝损伤特别是肝炎的主要的原因。四氯化碳、D-氨基半乳糖或硫代乙酰胺诱导的急性化学肝损伤,以及慢性模型所造成肝损伤已广泛应用于筛选保肝药。然而,这些损伤显然是外部化学因素而不是由人类的宿主防御而诱导的肝炎,因此不适用于评价肝免疫调节剂。研究肝损伤的发病机制和保肝药物的作用原理需要建立合适的实验性肝损伤动物模型。因此,在抗肝炎药物研究中可采取损伤机制不同的多个模型上观察药物的保护作用,以综合判断药物疗效和作用机制。Con-A诱导肝损伤模型是近年来发展起来的由T淋巴细胞介导肝损伤模型。刀豆蛋白a(Concanavalin-A, Con-A)是一种在体内对肝细胞具有特异性毒性作用的植物凝集素,它进入循环后,引起CD4+T淋巴细胞为主的炎症细胞浸润肝细胞实质,继而激活TNF-a和白介素等细胞因子,引发炎症反应,通过肝细胞凋亡等多种途径损害肝细胞,造成免疫性肝损伤。该模型只需一次性尾静脉注射Con-A,最主要特点是发病迅速,肝脏损害明显。其病理生理过程,与人类慢性乙型肝炎中T淋巴细胞介导的肝细胞损伤极为相似,具有肝脏依赖性、剂量依赖性等特点。这一实验模型很好地模拟了人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病,是筛选急性肝损伤和暴发性肝衰竭治疗药物比较理想的动物模型。我国是乙肝发生率较高的国家之一,寻找和研究既具有抗病毒又具有保肝作用的有效天然药物,一直是中医药科研工作的重要方向。西医用于肝炎的治疗多见于抗病毒药、免疫调节药及护肝降酶类等药物。临床治疗结果表明,这些药物多具有良好的抑制病毒复制,恢复正常肝功能,保护肝细胞等作用,并且疗效迅速,不足之处为远期疗效不稳定,易反复,HBsAg转阴率低,有些药品价格昂贵和表现一定的副作用。另一方面,现代医学在干预肝损伤的治疗方面并无特异性药物,多采用休息加强营养补充维生素和对症治疗等,严重者甚至被迫终止用药。中医中药运用整体观念,辨证论治的特色,发挥中药的多途径、多层次、多靶点,价格低廉、副作用少的优势,在抗乙肝病毒和抗肝损伤治疗中取得了不错的疗效,越来越为广大医务工作者所重视。红背叶根是岭南地区常用的中草药之一,为双子叶植物药大戟科植物红背山麻杆Alchornea trewioides(Benth.)Muell.-Arg.的根。功效清热解毒,祛风除湿,散瘀止血,平喘,杀虫止痒。在民间保肝应用历史悠久,疗效确切。本课题组的前期研究结果首次表明红背叶根具有保肝、降酶、抗肝纤维化的作用,并申请了专利保护。为进一步探讨筛选红背叶根抗病毒及保肝作用的有效部位,我们提取了4种红背叶根提取物,然后对它们进行实验研究,为其抗病毒、保肝作用提供确切的依据。研究目的：通过使用HepG2.2.15细胞模型,先天感染DHBV的鸭乙肝模型和Con-A致小鼠肝损伤模型,对红背叶根水提物(WE),石油醚提取物(PE),乙酸乙酯提取物(EE),正丁醇提取物(BE)等4种提取物进行抗乙肝病毒(HBV)和抗急性免疫性肝损伤及其免疫调节机制的实验研究,探讨其抗病毒和抗免疫性肝损伤及免疫调节的作用机制,为红背叶根的进一步开发利用奠定实验基础。研究方法：第一部分红背叶根4种提取物抗乙肝病毒的实验研究实验一：红背叶根不同提取物体外抑制HBsAg和IBeAg的实验研究方法：通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察红背叶根不同提取物对HepG2.2.15细胞的影响,采用ELISA法检测分析红背叶根不同提取物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用。实验二：红背叶根提取物体外对乙肝病毒复制的影响方法：采用荧光定量PCR-探针法检测分析红背叶根4种提取物对HepG2.2.15细胞分泌HBV-DNA的抑制作用。实验叁：红背叶根提取物体内抗鸭乙肝病毒的实验研究方法：常规PCR法筛选先天性感染的DHBV雏鸭。将筛选出的先天感染鸭随机分组。给药组每天一次性灌胃,共灌胃14d。对照组未做任何处理。每组动物分别于给药前1d、给药后7d、给药后14d、停药后5d自胫静脉采血,离心后收集血清。运用斑点杂交法对鸭血清进行DHBV-DNA检测。第二部分红背叶根4种提取物对Con-A致小鼠急性肝损伤的保护作用研究实验四：红背叶根提取物对Con-A致小鼠急性肝损伤的转氨酶和肝组织形态学的影响方法：随机分组后,模型组和正常对照组每天灌胃同体积生理盐水；各给药组连续给药3d,末次给药1h后,模型组及各给药组尾静脉注射Con-A溶液,诱导小鼠急性免疫性肝损伤,正常对照组注射等量的无菌生理盐水,禁食,不禁水,8h后摘眼球采血,处死小鼠后取肝脏同一部位,10%福尔马林固定。所采集的血液经离心后收集血清,待测血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶；固定好的肝组织进行病理学检查,经HE染色后,观察小鼠肝脏组织结构变化情况。实验五：红背叶根提取物对Con-A致小鼠急性肝损伤的免疫调节作用研究方法：采用WST-1法检测肝组织SOD活力；TBA法检测肝组织MDA含量,比色法测定肝组织GSH-PX活力；ELISA法检测血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ;流式细胞术检测脾巨噬细胞上TLR4、Tim-4表达百分比。统计处理以上各实验结果用均数±标准差(mean±SD)表示,多个样本比较用one-way ANOVA进行分析处理；重复测量数据采用重复测量方差分析,多组等级／频数表资料用非参数检验中的K Independent Samples Tests进行数据处理。两个变量之间的相关关系采用双变量相关分析(Bivariate)。采用统计软件SPSS13.0进行分析,以P<0.05定为差异有统计学意义。结果1、BE在无毒浓度下对HepG2.2.15分泌的HBsAg、HBeAg的抑制率分别达65.2%、94.4%,治疗指数分别为>9.8和>67.1；EE对HBeAg抑制率达53.4%,治疗指数>2,而对HBsAg的无抑制作用；其他两种提取物种对HBsAg、HBeAg则无抑制效果。2、结果显示,F=9.479,P=-0.000。与细胞对照组相比,WE、PE、EE以及BE对HepG2.2.15分泌的HBV-DNA的病毒载量均有明显的抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05)。3、结果显示,总体上,不同时间点DHBV-DNA变化无显着性差异(F=2.296,P=0.110)；各组间DHBV-DNA却存在显着差异(F=12.416,P=0.000)；时间与分组间存在交互效应(F=6.393,P=0.000)。红背叶根4种提取物只有PE高剂量组在治疗14d后血清DHBV-DNA有下降趋势,差异有统计学意义(P<0.01),停药5天后仍保持下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05),其他组无抑制血清DHBV-DNA的作用。4、结果显示,ALT方面,F=34.616,P=0.000；AST方面,F=37.658,P=0.000。肝细胞变性方面,X2=57.935,P=0.000；肝细胞坏死方面,X2=41.751,P=0.000；表明各组疗效存在显着性差异。红背叶根4种提取物都可显着降低血清中谷丙转氨酯、谷草转氨酶,差异有统计学意义(P<0.01)。在肝脏组织形态学方面,与正常组相比较,模型组肝脏变性及坏死等病理变化特别显着(P<0.05/14),动物模型建立成功。在肝细胞变性方面,各给药组改善肝脏变性的效果无显着差异。在肝细胞坏死方面,PE的中剂量组,EE的高剂量组、BE的低、中剂量组以及甘利欣组减轻肝细胞坏死的效果差异显着(P<0.05/14)；镜下观察结果见表4-2和图4-(1-15)(HE染色×200)。5、结果显示,SOD的F=34.961,P＝0.000:MDA的F=23.613,P=0.000；GSH-PX的F=37.089,P=0.000。IL-6的F=74.279,P,=0.000:TNF-α的F=28.023,P=0.000；IFN-γ的F＝374.800,P＝0.000.TLR4的F=4.552,P=0.015:Tim-4的F=6.763,P=0.003。红背叶根4种提取物不仅都可以显着降低肝脏MDA含量(P<0.01),而且还可以显着提高肝脏SOD活力,差异均有统计学意义(P<0.01)；至于GSH-PX,除了EE之外,其他叁种提取物都可以显着提高肝脏GSH-PX活力,差异均有统计学意义(P<0.05)。同时,红背叶根4种提取物既可显着抑制炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ,差异有统计学意义(P<0.05)；又可提高脾巨噬细胞上的TLR4和Tim-4的表达百分率,差异有统计学意义(P<0.05),提示4种提取物可上调脾巨噬细胞上的TLR4和Tim-4的水平。TLR4和Tim-4呈正相关关系(r=0.538,P=0.021)(P<0.05)。结论在乙肝病毒方面,体外研究结果显示只有EE和BE可以抑制HBV抗原,而BE的效果较EE好；4种红背叶根提取物都可以抑制HBV-DNA；体内研究结果显示只有PE高剂量组在治疗14d后血清DHBV-DNA有下降趋势,停药5天后仍保持下降趋势,其他组无抑制血清DHBV-DNA的作用。由此可见HBV抗原和HBV-DNA是红背叶根抗HBV的两个作用靶点。研究结果表明,红背叶根4种提取物中正丁醇提取物既可以抑制HBV两个抗原,又可抑带HBVDNA,因此红背叶根正丁醇提取物抗乙肝病毒效果最好的。在急性肝损伤方面,红背叶根提取物可以降低转氨酶,改善肝脏组织变性坏死形态,还可以降低肝脏MDA含量,提高肝脏SOD和GSH-PX活力。同时,红背叶根4种提取物不仅都可显着抑制炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ,而且还上调了脾巨噬细胞上TLR4和Tim-4的表达水平,TLR4和Tim-4呈显着正相关关系,由此可见降低转氨酶,改善肝脏组织形态,抑制脂质过氧化反应,抑制炎性细胞因子,上调TLR4和Tim-4的表达是红背叶根4种提取物保肝的几种可能机制；另外,TLR4和Tim-4在免疫调节方面发挥着重要的作用,我们发现两者存在正相关关系,可推断脾巨噬细胞上的TLR4和Tim-4表达的上调可能与抗乙肝病毒和抗肝损伤有关。可见,红背叶根对急性肝损伤具有较好的免疫调节作用。4种红背叶根提取物中,以BE抗乙肝病毒和抗肝损伤的作用最好,我们推测BE通过免疫调控作用,上调了TLR4和Tim-4水平,一方面,BE可能做为TLR4的激动剂,进而抑制HBsAg、HBeAg和HBVDNA,从而起到抗乙肝病毒的作用,另一方面,Tim-4水平的上调,抑制了脂质过氧化反应和炎性细胞因子,进而降低转氨酶,改善肝脏组织变性坏死形态,从而起到抗肝损伤的作用。
梅德盛[5]2005年在《核苷类抗乙肝病毒药物的合成》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒感染,是造成肝硬化和肝癌,最后导致死亡的主要因素之一。据报导现在全世界有3.5亿乙肝病毒携带者,每年有一到两百万的乙型肝炎病人因病情恶化而死亡。虽然当前可以获得安全有效的乙肝疫苗,但是全世界乙肝蔓延的趋势并没有下降。目前,全世界多数国家用于治疗乙肝的药物为抗干扰素,但是其低的有效率(30-40%)和昂贵的治疗费用及副作用限制了其应用。1999年Glaxo Wellcome公司上市的拉米夫定是第一个治疗乙肝的口服药物,虽然它可以有效的抑制HBV-DNA复制,但治疗一年后,只有少数的病人发生Hbe抗原血清转化,且存在停药后易反弹及耐药性的问题。因此,迫切需要寻找新的高效抗病毒药物。 阿德福韦酯(Adefovir Dipivoxil)已于2002年被FDA批准用于治疗慢性乙型肝炎。临床研究显示它有良好的抗病毒效果,且没有发现有耐药性,这预示着它有很好的应用前景。 PMPA籼PMPDAP是阿德福韦的类似物,它们的合成及PMPA前药的制备在国外最近几年已经起步。研究显示它们有良好的抑制HBV的效果和比阿德福韦更强的细胞毒性。国内目前还没有PMPA、PMPDAP的合成及它们前药的研究。特别是PMPDAP的前药的制备,经过全面的文献检索,目前在世界范围内还没有PMPDAP的前药的报道。 本论文的最主要工作是:(1)合成PMPA,PMPDAP,并改进其部分工艺;(2)以PMPA,PMPDAP为原药合成前药。 经过近两年的实验:(1)打通了PMPA,PMPDAP的合成路线(总共12步),并改进了其部分工艺:(2)合成了7个前药(其中6个是新化合物):PMEA前药1个:PMPA前药3个;PMPDAP前药3个。目前正在申请专利。 由于需要还合成了阿德福韦酯(Adefovir Dipivoxil)。
参考文献：
[1]. DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用[D]. 陈宗艳. 四川农业大学. 2008
[2]. 重组人白介素12治疗慢性乙型肝炎的药理学及机制研究[D]. 李茹冰. 南方医科大学. 2010
[3]. 六月青多糖及其皂苷对鸭乙型肝炎的治疗作用及分子作用机制研究[D]. 罗秀. 广西医科大学. 2013
[4]. 红背叶根提取物抗乙肝病毒和抗肝损伤的药效学研究[D]. 沈海容. 南方医科大学. 2014
[5]. 核苷类抗乙肝病毒药物的合成[D]. 梅德盛. 江西师范大学. 2005