郭玉玲卢愿孙立荣仲任李学荣
（青岛大学附属医院血液儿科山东青岛266003）
【摘要】目的：研究左旋门冬酰胺酶对急性T淋巴细胞白血病jurkat细胞株生长的影响。方法：在倒置相差显微镜下观察jurkat细胞经左旋门冬酰胺酶处理前后的生长状态，Gimsa染色观察L-Asp处理前后jurkat细胞的形态变化。通过琼脂糖凝胶电泳检测经不同浓度左旋门冬酰胺酶处理后的jurkat细胞的DNA片段。用流式细胞术检测jurkat细胞经不同浓度门冬酰胺酶处理48小时后的凋亡率及死亡率。结果：终浓度为1IU/ml、2.5IU/ml、5IU/ml、10IU/mlL-Asp均可诱导jurkat细胞发生凋亡和死亡，L-Asp终浓度为2.5IU/ml时jurkat细胞凋亡率最高，死亡率随L-Asp浓度增高而升高；凋亡细胞基因组DNA片段化断裂，凝胶电泳可见梯状条带。结论：左旋门冬酰胺酶可以诱导jurkat细胞发生凋亡，其凋亡细胞DNA发生片段化断裂，凋亡率与左旋门冬酰胺酶浓度有关。
【关键词】左旋门冬酰胺酶；白血病；细胞凋亡；jurkat细胞株
【中图分类号】R392【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）07-0053-04
ThestudyofeffectsofL-asparaginaseon?jurkatCells’proliferationandapoptosis
GuoYuling,LuYuan,SunLirongZhongRen,LiXuerong.DepartmentofPediatricHematology，theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity，Qingdao266003，ShandongProvince，China
【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectsofL-asparaginaseontheproliferationandapoptosisofhumanacuteT-cellleukemiaJurkatcells.MethodThemorphologicalchangeswereobservedunderamicroscopewithGimsastainedcells.DNAfragmentsweredetectedbyAgarosegelelectrophoresis.CellapoptosiswasanalysedbyFlowcytometry.ResultsThejurkatcells,treatedwithL-Aspintheconcentrationof1IU/ml、2.5IU/ml、5IU/ml、10IU/mlfor48h,canbeinducedapoptosisanddeath.Thejurkatcells’apoptosisratewashighestwhentreatedwiththeconcentrationofL-Aspwas2.5IU/ml.Thejurkatcells’mortalityratesincreasedwithL-Aspconcentrationriseing.DNAladdercanbeshowedbyDNAelectrophoresisafterthejurkatcellsweretreatedwith1IU/ml、2.5IU/ml、5IU/ml、10IU/mlL-Asp.ConclusionsTheapoptosisofJurkatcellscanbeinducedbyL-Asp.ApoptoticDNAoccursgragmentation.ApoptosisrateisassociatedwithConcentrationofL-Asp．
【Keywords】L-asparaginase;Leukemia;Apoptosis;Jurkatcells
急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblasticleukemia,All）是儿童最常见的恶性肿瘤，严重威胁着儿童的健康。近年来，以左旋门冬酰胺酶（L-Asp）为主的联合化疗及髓外预防措施的实施使儿童急性淋巴细胞白血病的长期无病生存率达80%[1]，L-Asp已经成为儿童急性淋巴细胞白血病化疗方案中的必要组成部分，其重要性毋庸赘述。关于L-Asp的抗肿瘤作用机制仍未完全明确，目前普遍认为与L-Asp耗竭血液中的门冬酰胺从而阻断肿瘤细胞蛋白质合成有关,但有研究示L-Asp作用后Asn的耗竭程度与细胞的增殖抑制程度不相平行[2]，儿童ALL患儿门冬酰胺合成酶表达水平与其对L-Asp的敏感性无相关性[3]，这就提示，L-Asp抗肿瘤作用可能存在其他机制，近年有文献报道L-Asp可诱导MOLT-4细胞、NK肿瘤细胞发生凋亡[4][5]。而其能否诱导急性T淋巴细胞白血病jurkat细胞株发生凋亡？本研究通过形态学、基因组DNA片段及流式细胞术检测L-Asp对jurkat细胞株生长的影响，进一步探讨L-Asp抗白血病的可能作用机制。
1.材料与方法
1.1主要材料
1.1.1细胞jurkat细胞株为本实验室液氮保存。
1.1.2试剂含1%青霉素、链霉素的RPMI1640购于北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清购自Gibco，AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒购于嘉美生物技术有限公司，细胞凋亡-DNAladder抽提试剂盒购于碧云天。
1.2方法
1.2.1细胞培养Jurkat细胞接种于含15%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，48～72小时换液一次，约4天传代1次。
1.2.2显微镜下观察jurkat细胞经L-Asp处理前后的形态学变化取对数生长期细胞用于实验，将细胞密度调整至8×105/ml接种于6孔培养板，每孔2ml,加入终浓度为5IU/ml的L-Asp,培养48小时后离心收集细胞，洗涤、重悬细胞，取适量细胞悬液涂片，Gimsa染色,显微镜下观察细胞形态变化。
1.2.3基因组DNA片段化检测取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，接种在六孔培养板内，每孔2ml,按照L-Asp终浓度分为：未处理组、L-Asp0.1IU/ml、1IU/ml、2.5IU/ml、5IU/ml、10IU/ml组，处理48小时后，收集细胞，按照试剂盒说明提取细胞总DNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，VDS成像系统分析。
1.2.4AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期细胞，调整细胞浓度至5×105/ml，接种于6孔培养板，每孔3ml，按照终浓度为1.25IU/ml，2.5IU/ml，5IU/ml，10IU/ml的门冬酰胺酶作用于细胞48小时，同时设空白对照组，每组设3个复孔。48小时后收集细胞，按照试剂盒说明加入AnnexinV、PI等试剂，上流式细胞仪检测。所得数据应用FLOWJO7.6软件分析。
1.2.5统计学处理数据采用SPSS17.0分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1细胞形态学变化
自然状态下jurkat细胞呈悬浮生长，细胞膜光滑，轮廓清晰，折光性好，呈单个或聚集成团。5IU/mlL-Asp处理后jurkat细胞仍呈悬浮生长，轮廓模糊，折光性差，大小不一，集落变小且形成减少(如图1)。Gimsa染色显微镜下观察jurkat细胞，未处理组细胞核膜光滑，染色质均匀一致。5IU/mlL-Asp处理48小时后jurkat细胞，可见核膜皱缩，胞核深染，染色质浓缩呈团块状(如图2)。
2.2细胞凋亡DNA片段检测
经终浓度为0.1IU/ml、1IU/ml、2.5IU/ml、5IU/ml、10IU/ml的L-Asp处理48小时后及未经L-Asp处理的jurkat细胞，均提取DNA进行凝胶电泳分离DNA片段，结果示0.1IU/ml及未处理组jurkat细胞未出现凋亡，无DNAladder图谱形成；而经1IU/ml及其以上浓度的L-Asp处理48小时后,jurkat细胞均出现凋亡导致细胞DNA片段化，形成DNA-ladder电泳图谱，但各组间DNAladder宽度及辉度无明显区别（如图3）。
2.3AnnexinV-FITC/PI双染法检测L-Asp对jurkat细胞生长的影响
终浓度为1IU/ml、2.5IU/ml、5IU/ml、10IU/ml的L-Asp处理48小时后，通过AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪对jurkat细胞凋亡率及死亡率进行流式检测，结果显示：不同浓度L-Asp处理组，jurkat细胞均示有凋亡发生，且各组间的凋亡率存在差异，在统计学上有显著性（F=47.52，P＜0.01）（见表1、图4）。不同浓度L-Asp处理48小时后组jurkat细胞凋亡率及死亡率进行两两比较结果见表2，L-Asp1IU/ml、2.5IU/ml、5IU/ml浓度组凋亡率均显著高于L-Asp10IU/ml浓度组凋亡率；L-Asp2.5IU/ml浓度组凋亡率较L-Asp5IU/ml浓度组高，差别具有显著性；L-Asp1IU/ml和2.5IU/ml浓度组凋亡率比较差异无统计学意义。不同浓度L-Asp处理组之间jurkat细胞死亡率具有显著差异（F=155.36，P＜0.01），各浓度组死亡率两两比较结果见表3，任意两组死亡率比较均具有显著性，随L-Asp浓度增高，死亡率增加。对各组间凋亡率与死亡率之和进行比较，结果示不同浓度L-Asp处理组之间jurkat细胞凋亡率与死亡率之和存在差异，在统计学上有显著性（F59.91，P＜0.01）；组间比较结果见表4，L-Asp5IU/ml和10IU/ml浓度组凋亡率与死亡率之和比较差异无统计学意义，其余任意两组之间均有显著差异。流式细胞术典型结果参见图6。
3.讨论
不同的抗肿瘤药物的作用机制不尽相同，主要有诱导凋亡、引起细胞坏死和诱导机体抗肿瘤免疫反应等途径，本实验从细胞形态学到分子生物学水平均证明左旋门冬酰胺酶可以诱导急性T淋巴细胞白血病jurkat细胞株发生凋亡并促进其死亡。从流式细胞术结果可见L-Asp浓度越高细胞死亡率越高，而凋亡率与L-Asp浓度的关系则相对复杂，比较L-Asp2.5IU/ml、5IU/ml、10IU/ml组凋亡率，可见一定范围内L-Asp浓度越低细胞凋亡率反而越高，这也提示L-Asp的抗白血病作用并非仅仅通过分解门冬酰胺这条途径实现，说明啥。比较L-Asp1IU/ml组与2.5IU/ml组凋亡率无显著差异又提示当L-Asp浓度低到一定程度后继续降低药物浓度凋亡率变化不显著，但结合DNA片段化检测结果示当L-Asp浓度降低至0.1IU/ml时，未见DNAladder，即无明显细胞凋亡发生，提示随着L-Asp浓度的继续降低，细胞凋亡率下降，甚至无凋亡诱导作用。综上述两点我们推测左旋门冬酰胺酶诱导jurkat细胞发生凋亡可能存在最佳浓度，然而关于L-Asp浓度与细胞凋亡率之间的具体相关性需要进一步增加L-Asp浓度梯度进行探究。
在临床治疗中肿瘤细胞的凋亡和死亡均为治疗有效，进一步分析本实验各浓度组凋亡率加死亡率（结果中是否可以加上这部分），可见各组间差异具有显著性，且有效率随L-Asp浓度增加呈升高趋势，这与Dana-Farber协作组的一项研究相符，即L-Asp的治疗强度和临床治疗效果之间存在直接相关性[6]。但比较终浓度为5IU/ml组与10IU/ml组总有效率即凋亡率加死亡率，差异不显著，而其中死亡部分所占比例则存在显著差异，这可能与临床应用大剂量L-Asp时不良反应的发生率高有关。
因此L-Asp应用临床时，我们期望达到理想治疗效果的情况下尽可能提高其中细胞凋亡所占比例，这就需要我们对L-Asp诱导细胞凋亡的作用机制进行深入探讨。目前关于抗肿瘤药物诱导细胞发生凋亡的机制主要有三方面，死亡受体介导的细胞凋亡途径[7]，包括Fas/FsaL途径和DR4、DR5/TRAIL途；部分基因的表达及调控异常[8]，如p53、bcl-2、c-myc等；caspase的活化，尤其是caspase3是引发细胞凋亡蛋白酶级联反应的核心蛋白，活化后的caspase3降解其特异性底物，破坏核纤层，激活核酸内切酶，染色体DNA在核小体单位之间断裂，形成180-200bp整数倍的寡核苷酸片段[9][10]。L-Asp可以耗竭Asn,并分解环境中的谷氨酰胺，从而导致一系列氨基酸反应，而当细胞微环境中缺乏一种或多种氨基酸时，细胞内未携带氨基酸的tRNA增多，进而与非抑制性蛋白2结合并使其活化，并通过下游磷酸化反应使细胞内转录激活因子4(ATF4)翻译增加，而ATF4可特异性的激活一些凋亡相关基因异常表达，如生长阻滞DNA损伤诱导基因153即CHOP基因表达增加[11]，且有研究报道L-Asp作用与MOLT-4细胞后CHOPmRNA维持处于较高水平[12]。但L-Asp处理后细胞究竟通过何种途径发生细胞凋亡尚待进一步研究证实，后期我们将继续该项研究，以期窥探左旋门冬酰胺酶治疗白血病机制的冰山一角。
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论文作者:郭玉玲卢愿孙立荣仲任李学荣
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第7期供稿
论文发表时间:2015/7/2
标签：细胞论文; 浓度论文; 凋亡论文; 死亡率论文; 酰胺论文; 诱导论文; 白血病论文; 《医药前沿》2015年第7期供稿论文;