刘锦波[1]2002年在《大鼠脊髓损伤中游离铁的毒性作用及干预研究》文中指出脊髓原发性损伤的范围常常是有限的，而原发损伤激发的病理机制使得损伤的范围和程度加重，导致继发性损伤。目前有关脊髓继发性损伤相关的学说包括：缺血-再灌注，兴奋性氨基酸毒性，钙离子失衡，细胞凋亡，炎症介质和自由基氧化应激等。由于确切的损伤机制不明确，为针对性治疗带来困难。虽然国内外已经投入巨大的研究力量，但是取得的治疗效果令人失望。 在脊髓继发性损伤的众多机制中，自由基导致的氧化应激机制被认为是最重要的原因之一。近年来脑、心脏和肾脏等组织损伤的研究表明，损伤后组织游离铁的升高激发自由基的产生，导致组织脂质过氧化反应，组织细胞功能受损。而继发性脊髓损伤后游离铁的变化未见报道，游离铁对脊髓损伤脂质过氧化的影响如何?铁整合剂和一些新的抗氧化药物在其它组织损伤的治疗实验中取得一定的效果，应用于脊髓损伤是否有用?为此，我们采用大鼠脊髓中度打击伤模型，对游离铁与脂质过氧化的关系进行研究，并寻求好的药物治疗方法。 本项研究中，雄性SD大鼠被随机分为正常组(不做任何手术)、对照组(仅做椎板切除)、损伤组(椎板切除加脊髓损伤)和治疗组(脊髓损伤加药物治疗)，损伤模型使用改良Allen's打击法(50g·cm或100g·cm)致伤大鼠T_(12)脊髓，进行以下五方面的研究： 一、大鼠脊髓损伤后游离铁及脂质过氧化物的变化 在损伤后1／2h、1h、3h、6h、12h、24h应用生物化学方法测定大鼠伤段脊髓游离铁(Fe~(2+))、脂质过氧化物(MDA)以及其它抗氧化物(GSH、GSH-PX和NOS)的变化，观察游离铁和脂质过氧化物之间的变化关系。结果表明，大鼠伤段脊髓游离铁在损伤后半小时即明显升高，与对照组相比，差异有显 大鼠脊回损伤中游高铁的毒性作用及干预研究 中文摘要 着性，随后回调。到6小时恢复正常：＊＊A在损伤后半小时也 明显升高，损伤3小时最高，随后回调，损伤12 小时恢复正 常；谷肤甘肽在损伤后1小时显着升高，然后逐步回调，损伤3且 小时恢复正常＊ 小时后低于正常；谷耽甘肽过氧化物酶在损伤：后半小时和1小时显着升高，然后降低，损伤12小时后低于正 常；一氧化氮合成酶在损伤后半小时显着降低，然后逐步升 高，损伤 6小时接近正常。在前 3个时间段对照组 F／”和 MOA 之间无相关性，损伤组Feh和MDA之间有正相关性。说明游离 铁与脂质过氧化反应有一定的联系。 二、微注射游离铁对大鼠脊困组织脂质过氧化的影响 采用活体微注射方法在大鼠脊髓T；。注射12nmol的拘械酸亚 铁 0l u l： 对照组同样注射等量的 Ringer氏液，观察 12h和 24h脂质过氧化物的变化和伤后3天形态学改变。结果显示， Fe卜微注射后 12 ’J’时，脊髓组织 MDA 即有迅速的升高 （＊＜0．05），二乏d时略有下降A吕刁时仍高于对照组（P＜0．05）。，形态学改变与重物打击伤相似，有出血，组织结构的破坏，细 胞变性坏死。说明游离铁对正常的脊髓有损害作用。＋d 叁、游离铁对大鼠脊回组织匀浆脂质过氧化的影响 应用正常大鼠脊髓组织匀浆，分别再加入Rin驴r、液、构 椽酸亚铁溶液（l）或去铁胺溶液KHM），使最终容量 为300 p！，在37”C恒温振荡水浴中孵育2小时，测定MDA 的变化。观察不同浓度游离铁和去铁胺对脂质过氧化物变化的 影响。结果显示，脊髓组织匀浆中加入Fey可增加匀浆液的 MDA产生，与对照组相比有显着性意义。同时随着Fe卜浓度的 增加，MDA不断增加；当 Fe卜浓度为入0 11M时，MDA浓度 最高。Fe卜和脊髓匀浆液中加入DFO，可明显减少MDA的产 生，与相同 Fe＊浓度组比较，差别有显着性意义（p＜0刀1）； 同时随着DFO浓度的增加，MDA不断减少；当DFO浓度为 1．OVM时，MDA浓度较低。上述结果说明游离铁对损伤脊髓 的进一步损害有促进作用。 且且 大鼠脊臼损伤中游离铁的毒性作用及干预研究 中文摘要 四、大员脊阮损伤后血红素氧化酶1的mRNA和蛋白的表达 应用原位杂交和免疫组化技术观察脊髓损伤后24小时血红素 氧化酶＊和HSP70的蛋白和mRNA的表达。结果显示正常脊 髓组织在中央灰质处可见少量的神经无表达阳性，而损伤后灰 质和白质均有明显的表达，主要在星形胶质细胞和小胶质细胞 或巨噬细胞，并围绕在血肿的周围。神经元阳性以中央灰质和 后角为主，侧方白质少量胶质细胞阳性。HSP70在正常脊髓组 织在前角运动神经元有少许的表达，胶质细胞无表达。损伤后 与HOI 的表达基
郝剑[2]2017年在《铁死亡在脊髓损伤中的作用及SRS 16-86的干预》文中进行了进一步梳理目的:脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是临床上常见的一种严重的疾病,具有很高的发生率并且脊髓损伤一旦发生就会导致非常高的致残率,脊髓损伤后的神经和功能恢复一直是世界性难题。因为现在还没有有效的治疗和康复方法,目前仅有不到1%的脊髓损伤患者达到所有神经功能的恢复。当前,脊髓损伤治疗的瓶颈在于如何控制继发性脊髓损伤中的大量神经及其它细胞的死亡。因此,SCI后减小继发性损伤的程度,减少残存神经细胞的死亡,这可能是脊髓损伤的治疗和促进其恢复的的关键所在。目前对继发性脊髓损伤的机制仍不清楚,但是脊髓损伤后的活性氧簇(ROS)的生成和脂质过氧化是继发性脊髓损伤的一个非常重要的因素。并且研究还发现在脊髓损伤后损伤区域的细胞内铁过载,这大大增加了脊髓损伤后的氧化应激压力。最近研究表明,组织损伤后局部铁离子浓度升高,促进了氧自由基的产生,氧自由基又能够促进脂质过氧化,导致了周围组织和细胞的损伤。先前研究表明,铁螯合剂和一些抗氧化药物在脊髓损伤修复中具有一定的保护作用。然而,其机制并不清楚,制约了在临床治疗脊髓损伤的应用。根据现有继发脊髓损伤阶段的研究,近年发现的一种新的程序性死亡机制-铁死亡(Ferroptosis)可能在脊髓损伤中存在,并且铁死亡抑制剂可能能够保护脊髓损伤并且促进其修复。铁死亡在缺血再灌注型组织损伤中普遍存在,铁死亡抑制剂可以显着修复组织损伤。由于脊髓损伤中铁的超载,以及脂质过氧化,提示可能存在铁死亡途径。本课题聚焦铁死亡在脊髓损伤中的作用和机制,试图通过铁死亡抑制剂干预铁死亡,从而修复脊髓损伤。本研究的核心问题是:铁死亡在继发性脊髓损伤中的作用,阻断这一死亡途径是否可以实现脊髓损伤的修复。因此,本课题设计如下:(1)验证脊髓损伤中是否存在铁死亡;(2)铁死亡特异性抑制剂是否对脊髓损伤和神经元细胞损伤具有保护作用及其机制。方法:体内实验证明铁死亡存在于大鼠脊髓损伤中且可被铁死亡抑制剂干预。建立Wistar大鼠脊髓损伤挫伤模型,并对损伤大鼠一次性给与铁死亡抑制剂SRS16-86,BBB评分评价铁死亡抑制剂对大鼠脊髓损伤后运动功能的保护作用,免疫组织化学染色观察神经元细胞存活数量、胶质瘢痕和脊髓空洞面积,从而评价铁死亡抑制剂对脊髓损伤的保护作用。检测铁死亡标志物,证明脊髓损伤中存在铁死亡。本实验应用大鼠脊髓挫伤模型,随机分为SRS 16-86处理组、对照组、假手术组,并且在不同的时间点进行大鼠后肢功能评定(BBB评分),评价铁死亡抑制剂(SRS 16-86)对大鼠脊髓损伤的保护作用。检测ROS代谢产物4HNE的含量以及GPX4的表达。检测脊髓中铁离子含量,评价铁离子和脊髓损伤严重程度相关性。免疫荧光染色观察损伤脊髓中星型胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。结果:成功建立大鼠脊髓损伤挫伤模型,并通过组织病理学和功能学评分进行验证;成功自行合成了铁死亡的抑制剂SRS 16-86,并通过质谱分析验证有效;使用SRS 16-86干预脊髓损伤能够减少ROS代谢产物4HNE的含量,增加损伤区域的总谷胱甘肽,减少了损伤区域的铁离子含量,并且使用SRS 16-86干预后改善脊髓损伤大鼠的行为学评分,以及改善组织病理学变化,抑制星形胶质细胞的增生,增加神经元标志物的表达,增加CNPase阳性区域的面积;并且SRS16-86还能够减少脊髓损伤区域TNF-α、IL-1β和ICAM-1的表达,抑制脊髓损伤后的炎症反应。结论:本研究初步证实在脊髓损伤中存在铁死亡这种程序性细胞死亡方式;SRS16-86能够抑制铁死亡,并且显着改善脊髓损伤后的后肢运动功能,改善组织病理学变化,保护了残存的神经细胞和保护少突胶质细胞,减少了后期星形胶质细胞的增生以及胶质瘢痕的形成。
陈志[3]2014年在《铁离子在实验性脑室出血后脑损伤中的作用机制及干预研究》文中进行了进一步梳理脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是常见的卒中亚型，发病率高居卒中第二位。脑出血发病急骤，病情往往十分凶险，发病后1月内病死率可高达50％，且幸存者多有严重的神经功能障碍。然而，脑出血后脑损伤的机理仍不够清楚，亦缺乏经严格验证有效的治疗措施。在脑出血患者中，合并脑室出血(intraventricular hemorrhage，IVH)的发生率高达50%以上，脑室出血以及继发形成的脑积水将进一步加重脑损伤，是临床脑出血患者预后不良的独立危险因素，近年来逐步受到关注。因此，脑室出血及继发性脑积水的防治研究已成为脑出血领域关注的新方向，明确IVH后脑损伤机制及探索有效的干预措施对提高临床脑出血患者的治疗效果具有重大意义。目前，脑室出血后脑损伤及继发脑积水的确切病因及机理还不是很清楚，也缺乏有效的药物治疗措施1。IVH后病理损伤机制可能包括：早期梗阻性脑积水导致颅内压增高、脑室内血肿的占位效应、血液代谢产物的毒性作用和继发慢性脑积水等2。然而，IVH后血液代谢产物与脑损伤和慢性脑积水之间的关系尚缺乏研究。近年来，血肿及其代谢产物的毒性效应作为脑出血后脑损伤的重要研究方向取得了较大进展。ICH后数日内血块开始融解，铁离子作为血红蛋白的主要降解产物过量集聚导致组织铁超载和氧化损伤，造成血脑屏障受损、脑水肿及神经元死亡等。相应的，铁螯合剂去铁敏干预措施在多种ICH动物模型研究中均被证实具有神经保护效应，因此研究ICH后铁超载相关损伤及治疗措施意义重大。脑室出血后铁代谢紊乱及其在继发脑损伤中的作用尚不清楚，我们分析IVH后溶血产物可广泛播撒至全脑室系统及蛛网膜下腔，与脑室壁及脑组织接触面更为广泛，铁超载及相关损伤可能在IVH后脑损伤及脑积水发生中同样具有重要作用。因此，我们推测：IVH后脑室内积血逐步代谢后有大量铁离子释放，可能导致显着的脑铁超载，并引起脑室壁室管膜纤毛上皮、脑室旁组织等氧化应激损伤，从而参与IVH后脑损伤及慢性脑积水的发生发展。本课题以IVH后铁超载及氧化损伤为主要切入点，观察大鼠实验性IVH后脑损伤、脑积水和铁代谢特征，并分别采用去铁敏、米诺环素和依达拉奉进行干预，观察在铁超载和氧化损伤两个关键环节的干预效应，分叁部分研究验证上述推测：第一部分采用不同血液制品行大鼠单侧脑室注射建立IVH损伤模型，明确IVH后脑损伤、脑积水和铁代谢相关特征，观察铁螯合剂去铁敏干预是否能减轻IVH后脑损伤；第二部分采用脑室内铁离子注射模型，观察铁离子在脑室内的直接脑损伤效应，以及米诺环素对脑室内铁损伤的保护效应，进一步证明铁离子可能参与了IVH后继发损伤及脑积水形成；第叁部分采用实验性大鼠IVH模型，观察自由基清除剂依达拉奉对IVH后氧化应激损伤及脑积水的干预效应，验证氧化损伤参与IVH后室管膜损伤及脑积水发生的推测。一、铁离子在大鼠实验性脑室出血后脑损伤中作用及去铁敏的干预研究目的通过侧脑室注射自体全血、抗凝血或红细胞建立大鼠脑室出血模型，动态观察出血后脑损伤、脑积水、脑铁沉积和铁代谢相关蛋白表达变化，以及铁螯合剂去铁敏的干预效应，从而评估铁离子超载在脑室出血后脑损伤中的作用及铁螯合治疗的意义。方法实验分为3部分，第一部分将实验动物分成生理盐水对照组(Saline)、自体血组(Bloodor IVH)及抗凝血组(Heparinied blood)，分别将200μl生理盐水、自体血及自体抗凝血注入大鼠右侧脑室，分别于1天、3天、7天、14天和28天行MRI扫描，并于上述时象点留取脑标本行组织学、免疫组化和Western blot检测；第二部分实验观察红细胞脑室内注射的效应，将动物分为浓缩红细胞组(Packed RBC)和融解红细胞组(Lysed RBC)，分别将50μl浓缩红细胞和融解红细胞注入大鼠右侧脑室，于24小时行MRI扫描并留取标本供组织学检测；第叁部分观察去铁敏的干预效应，实验动物分为去铁敏干预组(IVH+DFX)和溶剂干预组(IVH+Veh)，分别给予右侧脑室内注入200μl自体全血，再于血液注射后2小时、6小时分别给予去铁敏(DFX，100mg/kg)或溶剂，肌肉注射，然后每12小时注射一次，共7天疗程。所有动物分别于1天、3天、7天、14天和28天行MRI扫描，扫描结束后留取标本行组织学检查。结果1.单侧脑室注血法成功建立大鼠实验性IVH模型，自体血及自体抗凝血注射均导致明显脑积水，至28天脑室仍显着扩张，但抗凝血组脑积水轻于非抗凝血组；IVH引起大鼠脑铁蓄积和HO-1、Ferritin表达升高，以及后期海马萎缩、海马神经元缺失和脑室壁胶质增生。2.脑室内注射融解红细胞导致急性脑室扩张、脑水肿，明显重于浓缩红细胞组，脑组织HO-1及OX-42免疫阳性反应均强于浓缩红细胞组。3.去铁敏可减轻IVH后脑室扩张和铁蓄积，Ferritin表达水平也相应降低，去铁敏干预组于IVH后28天海马萎缩、海马神经元缺失均较溶剂对照组减轻。结论大鼠IVH导致持续脑室扩张，并伴有明显的脑铁蓄积和铁代谢相关蛋白表达上调，相应地给予铁螯合剂去铁敏治疗可减轻IVH后脑积水、海马损伤及铁蓄积，提示铁超载可能是IVH后脑损伤和脑积水的重要机制，去铁敏在IVH后继发脑损伤治疗中具有的应用前景。二、大鼠脑室内铁离子注射模型脑损伤及米诺环素的干预研究目的建立大鼠脑室内铁离子注射模型，观察铁离子脑室内注射后的直接脑损伤效应，探讨米诺环素和巨噬细胞/小胶质细胞抑制剂(macrophage/microglial inhibitory factor，MIF)对在体条件下脑室内高铁所致脑损伤的保护效应及机制。方法将实验动物分成生理盐水对照组(Saline)、氯化亚铁组(FeCl2)、氯化亚铁+米诺环素组(FeCl2+Minocycline)、氯化亚铁+MIF组(FeCl2+MIF)、叁氯化铁组(FeCl3)和叁氯化铁+米诺环素组(FeCl3+Minocycline)，各组分别将上述(混合)溶液200μl注入大鼠右侧脑室内，氯化亚铁和叁氯化铁浓度为0.5mM，米诺环素和MIF浓度为1.5mM；模型建立后1天分别行MRI扫描、脑水含量测定，留取致伤后1天组织标本行Fluoro-Jade C、PANT和TUNEL检测；分别采用铁叁嗪比色法和改良铬天青S法检测米诺环素对二价和叁价铁离子的螯合力。结果1.氯化亚铁脑室内注入引起急性脑室扩张、脑水肿和神经元变性损伤，米诺环素和MIF可明显抑制氯化亚铁脑室注射后所引起的小胶质细胞活化，但仅有米诺环素能显着降低大鼠死亡率，减轻脑水肿和神经元损伤。2.叁氯化铁脑室内注射引起显着的急性脑室扩张和海马神经元变性，米诺环素能减轻神经元损伤，但未减轻脑室扩张。3.米诺环素对二价和叁价铁离子均具有螯合效应。结论铁离子脑室内注射可导致急性脑积水、脑水肿及神经元损伤；米诺环素具有亚铁和叁价离子螯合力，并能显着减轻铁离子脑室内注射所致的脑水肿和神经元损伤，其神经保护作用的机理可能与铁螯合效力有关。关键词：脑室出血铁米诺环素脑积水叁、依达拉奉对大鼠脑室出血后脑损伤的干预研究目的观察自由基清除剂依达拉奉对实验性大鼠脑室出血后氧化应激损伤、脑积水和神经行为学损伤的干预效应。方法研究分为2部分，第一部分为急性期指标测定，动物分为生理盐水对照组(Saline)、脑室出血+依达拉奉干预组(IVH+Edv)和脑室出血+溶剂干预组(IVH+Veh)，分别给予右侧脑室内注入200μl生理盐水或不抗凝自体全血，注血后分别给予依达拉奉(6mg/kg，IVH+Edv组)或溶剂(IVH+Veh)皮下注射，损伤后24小时取脑组织检测脑含水量、丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性。第二部分实验分组同前，注血组大鼠分别给予依达拉奉(6mg/kg，IVH+Edv组)或溶剂(IVH+Veh)皮下注射共3天(注血后15分钟，1天和2天)，IVH后23天开始行为学检测，28天行MRI扫描并留取标本行组织学检查。结果：1.大鼠IVH模型可导致急性脑水肿、氧化应激及后期学习记忆功能缺陷。2.依达拉奉减轻了IVH后组织氧化应激、脑水肿及脑室壁室管膜纤毛上皮损伤，改善了大鼠后期脑积水和学习记忆功能缺陷。结论自由基清除剂依达拉奉可减轻大鼠IVH后氧化应激和急性脑水肿，并改善后期脑室壁损伤、脑积水和学习记忆功能缺陷，氧化应激可能是IVH后脑损伤及脑积水的重要机制和治疗靶点之一。
皮斌[4]2012年在《叁七总皂苷对大鼠脊髓半横断损伤后神经保护作用及cPLA_2相关机制》文中提出目的研究叁七总皂苷对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)模型的脊髓神经功能的保护作用及对损伤段脊髓组织胞浆型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2, cPLA2)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)表达的影响。方法SD成年大鼠55只(雌雄不计),随机分成叁组：(1)假手术组(Sham operation group, n=5);(2)脊髓损伤组(Control group, n=25);(3)PNS治疗组(PNS experimental group, n=25)。脊髓损伤组和PNS治疗组大鼠按术后存活时间再细分为五个亚组,即1天组,3天组,7天组,14天组和21天组,每时间点5只大鼠。采用脊髓半横断法制作脊髓损伤模型,假手术组只行椎板切除,不行脊髓半横断操作。PNS治疗组大鼠在造模成功后15分钟开始予叁七总皂苷注射液经腹腔内注射20mg/kg,每天给药一次。脊髓损伤组大鼠则在造模成功后给予等量的生理盐水经腹腔内注射,给药次数和PNS治疗组相同。所有大鼠在处死前于平坦处行BBB评分,评估脊髓损伤后大鼠脊髓运动神经功能,统计学分析两组间是否有差异。脊髓损伤组及PNS治疗组大鼠在造模后的相应时间点分别处死行主动脉插管灌注固定并取脊髓组织标本,每只大鼠取以损伤段为中心的长约1cm的脊髓组织。在每个脊髓标本纵轴中心取横行切片,每个检测指标2张,分别作cPLA2和GFAP的免疫组化染色与尼氏染色,观察各自的表达情况并计数。SPSS13.0统计分析软件对比两组动物的脊髓标本不同时间点cPLA2、GFAP的表达是否有统计学差异,并分析其相关性。结果脊髓损伤后两组大鼠其BBB评分值逐渐升高,PNS治疗组均较脊髓损伤组评分值高,除术后第一天BBB评分与脊髓损伤组相比无明显统计学意义,其余各时间点PNS治疗组行为学评分均显着高于脊髓损伤组,第叁天、第七天比较其P值<0.05,第十四天、第二十一天P值均小于0.01。尼氏染色病理学检测显示假手术组大鼠脊髓组织神经元形态完整,胞浆内尼式小体清晰可见。脊髓损伤组光镜下可见脊髓组织正常结构丧失,灰质形成较大空腔,少见完整的细胞结构,胞浆混浊,尼氏体显示不清。PNS治疗组脊髓组织结构比较清晰,损伤侧的灰质内,偶见小空腔,有较多的正常神经元,神经元细胞核稍浓聚,核膜完整,胞浆内尼氏体清晰可见,轴突清晰完整。cPLA2免疫组化结果示脊髓损伤后1d起cPLA2表达增加,免疫阳性细胞数增多,神经元肿胀,胞体增大,而PNS干预组cPLA2阳性细胞数较少,且cPLA2染色较浅,神经元肿胀程度较轻,形态更为完整,周围神经组织破坏程度较轻。在7d,14d,21d损伤组cPLA2表达均显着强于PNS干预组(P<0.01),且在各时间点内PNS组cPLA2表达均弱于损伤组。GFAP免疫组化结果显示,脊髓损伤后1d起GFAP表达增加,免疫阳性细胞数增多,神经元肿胀,胞体增大,而PNS干预组GFAP阳性细胞数较少,且染色较浅,神经元肿胀程度较轻,形态更为完整,周围神经组织破坏程度较轻。在7d,14d,21d, SCI组GFAP表达均显着强于PNS干预组(P<0.05),且在各时间点内PNS组GFAP表达均弱于SCI组。对两指标光密度值应用Pearson相关性分析,脊髓损伤后GFAP与cPLA2表达有显着相关性(r=0.90,P=0.04),说明在脊髓损伤过程中,星形胶质细胞激活与cPLA2表达有一定联系。结论叁七总皂苷对脊髓继发性损伤有神经保护作用。叁七总皂苷能抑制大鼠脊髓损伤模型损伤段脊髓cPLA2及GFAP表达,且其神经保护机制可能与抑制cPLA2表达,调控星形胶质细胞活化有关。
李芸[5]2016年在《内质网钙离子释放和CaMKⅡ/MAPK信号通路在臭氧脊髓神经元神经毒性的作用机制及XBP1预防靶点的研究》文中指出研究背景：臭氧(ozone, O3)作为一种古老而创新的治疗方法,因其令人难以置信的多功能性,越来越多地被世界各地的医学工作者所认同。目前臭氧在腰椎间盘突出症(LDH)、手术失败综合征(FBSS)、软组织损伤和关节痛等疾病的治疗中得到了广泛的应用。但是臭氧可以影响中枢神经系统(CNS)的功能,如降低认知反应能力、减少运动能力、诱发头痛、引起睡眠-觉醒周期紊乱、神经功能障碍、神经元退化变性和神经化学反应的发生等。在临床上也有硬膜外注射医用臭氧误入蛛网膜下腔对中枢神经系统产生严重毒性作用的个案报道。因此在临床应用中,臭氧对于脊髓神经元的神经毒性问题引起了越来越多的重视。近年的体外研究证实,医用臭氧对中枢神经系统有神经毒性作用,并呈浓度相关性。关于其机制的进一步研究结果显示,低浓度医用臭氧处理胎鼠离体脊髓神经元后,可使胎鼠脊髓神经元峰值钙电流向超极化方向移动、钙通道激活阈值降低。细胞内大多数的Ca2+存储在内质网,联系内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)诱发细胞凋亡的理论(细胞内钙离子浓度改变造成内质网钙稳态失衡,使内质网腔内未折迭蛋白、错误折迭蛋白增加,将激活相应的信号传导通路,诱发内质网应激,若机体受到持续严重的ERS时,ERS就会诱导细胞走向凋亡),我们推测,臭氧可能通过某种通路诱发内质网钙释放,引起细胞钙超载,诱发内质网应激,进一步诱导细胞走向凋亡。当细胞内外环境发生紊乱时,内质网腔内未折迭蛋白或错折迭蛋白蓄积,诱发ERS。哺乳动物细胞可通过ATF6和XBP1两个系统调控ERS来适应生存。当ERS水平较低时,可仅通过ATF6的蛋白水解激活作用来处理；当ERS水平极高时,大量未折迭蛋白或错误折迭蛋白蓄积于内质网内,形成严重压力,IRE1激活,可促使XBP1mRNA剪接并发生翻译框移位,翻译产生具有高转录活性的剪接型XBP1蛋白,其转位进入细胞核,与位于靶基因启动子区域的ERS反应元件结合,上调一系列与蛋白折迭、分泌相关的基因,增大内质网和细胞的体积与表面积,提高细胞处理蛋白的能力,之后通过一系列的反应来减轻内质网压力。在哺乳动物,XBP1是内质网应激反应下被特异激活的信号转导分子,有两种XBP1,剪切型XBP1和未剪切型XBP1,只有XBP1的剪切形式才能高效激活内质网应激反应。Thuerauf等报道体外培养心肌细胞低氧暴露16h后XBP1及GRP78表达上调,当用编码XBP1显性负相腺病毒重组体感染心肌细胞后,GRP78表达下调,同时细胞凋亡数目增加。此外,Yoshida发现细胞中转染XBP1转录系统后,在用ERS诱导剂衣霉素或毒胡萝卜素处理细胞未见凋亡,而没有转染XBP1转录系统的细胞凋亡率为60.2%,这说明XBP1作为细胞保护性信号的关键分子影响着细胞转归。基于我们课题组前期关于低浓度医用臭氧对胎鼠离体脊髓神经元钙通道的影响的研究和同行对钙超载与细胞凋亡关系的研究,本研究第一部分从内质网钙通道水平探讨臭氧引起内质网钙释放的机制,以及内质网钙释放和CaMKII/ MAPK信号通路、细胞凋亡的关系。第二部分为了研究XBP1对臭氧诱导脊髓神经元凋亡是否有保护作用,本研究通过腺病毒载体介导XBP1过表达,检测医用臭氧能否激活内质网应激,并探讨了XBP1在这一过程中是否发挥保护作用以及其可能机制。本研究从内质网钙释放角度及后续可能的级联反应探讨臭氧引起脊髓神经元神经毒性的可能机制和预防该臭氧毒性可行性措施,为将来临床上更安全有效的使用医用臭氧提供理论依据。第一部分内质网钙离子释放和CaMKII/MAPK信号通路在臭氧脊髓神经元神经毒性中的作用及其机制研究研究目的：本研究检测体外条件下臭氧对脊髓神经元是否具有神经毒性,以及神经毒性的原因是否与内质网钙离子释放和CaMKⅡ/MAPK信号通路有关,进一步从细胞凋亡角度来探讨臭氧引起脊髓神经元神经毒性的可能机制。研究方法：1.大鼠脊髓神经元的原代培养2.光学显微镜观察大鼠脊髓神经元细胞的形态,并进行MAP-2免疫荧光鉴定3.CCK8法检测不同浓度医用臭氧对脊髓神经元的毒性4.激光共聚焦显微镜检测臭氧对脊髓神经元内质网钙离子释放的影响用Fluo-3/AM预处理脊髓神经元,负载后在激光共聚焦显微镜下检测加入40μg/ml臭氧培养液后钙流峰值变化。5.激光共聚焦显微镜检测内质网IP3/RYR信号通路是否参与臭氧诱导的钙离子释放6. Western blotting法检测臭氧是否通过促进内质网钙离子释放进一步激活CaMKⅡ和MAPK信号通路◆ Western blotting法检测臭氧处理之后phospho-CaMKⅡ (p-CaMKⅡ)的表达;◆ Western blotting法检测臭氧处理是否引起CaMKⅡ的磷酸化,以及是否与内质网钙离子释放有关；◆ Western blotting法检测臭氧处理是否引起MAPK信号通路的表达情况的改变,以及是否与内质网钙离子释放有关。7.TUNEL法检测臭氧是否通过促进内质网钙离子释放、激活CaMKⅡ和MAPK信号通路诱导脊髓神经元凋亡研究结果：1.原代培养新生大鼠脊髓神经元细胞的生长情况倒置相差显微镜下脊髓神经元细胞核大,界限清晰,折光性强,光晕明显,有明显的立体感,生长状态良好。2.体外培养大鼠脊髓神经元鉴定大鼠脊髓神经元经MAP-2染色后,经细胞计数和统计分析所培养的神经元纯度为89.70±4.70%。3.医用臭氧剂量依赖性的导致脊髓神经元神经毒性通过CCK-8比色法测定不同浓度医用臭氧干预后脊髓神经元的存活率。0μtg/ml和30μg/ml03不影响脊髓细胞元的存活率,而40μg/ml至100μg/ml臭氧对脊髓神经元的神经毒性呈剂量依赖性,更高浓度的臭氧干预后脊髓神经元存活困难。4.臭氧促进脊髓神经元内质网钙离子释放与对照组相比,臭氧处理组加入臭氧培养液后,细胞内Ca2+显着升高(P<0.05)；EGTA(细胞外钙离子螫合剂)预处理联合臭氧处理组细胞内Ca2+也显着升高(P<0.05),均差异极显着(P<0.05)。BAPTA-AM(细胞内钙离子螯合剂)预处理联合臭氧处理组与对照组相比,细胞内Ca2+无明显升高。Trapsi处理细胞后,细胞内Ca2+瞬间显着升高,之后钙离子浓度趋于稳定,再用臭氧处理,细胞内Ca2+无显着变化。5.内质网IP3/RYR信号通路参与臭氧诱导的钙离子释放2APB或者Dantrolin单独处理脊髓神经元,细胞内钙离子浓度无变化；2APB或者Dantrolin预处理细胞后,加入臭氧培养液,细胞内钙离子浓度也无变化；臭氧单独处理脊髓神经元细胞内Ca2+显着升高,与2APB或者Dantrolin单独处理相比,差异极显着(P<0.05),与2APB或者Dantrolin联合臭氧处理相比,差异极显着(P<0.05)。6.臭氧通过促进内质网钙离子释放进一步激活CaMKII/MAPK信号通路臭氧作用于脊髓神经元60min后,明显增加了p38和JNK信号通路的表达水平,而ERK1/2的表达水平无明显变化。进一步结果显示,臭氧激活p38和JNK信号通路的表达的作用能够被BAPTA/AM,KN62,2APB或者Dantrolene阻断。CaMKⅡ的磷酸化与p38和JNK信号通路的表达趋势一致。7.臭氧通过促进内质网钙离子释放、激活CaMKⅡ信号通路诱导脊髓神经元凋亡臭氧作用于脊髓神经元后24小时,凋亡细胞的数量明显增加。而且,臭氧诱导细胞凋亡的作用能够被BAPTA/AM或者KN62预处理阻断。BAPTA/AM或者KN62单独处理不会诱导细胞凋亡。结论：1.医用臭氧对脊髓神经元有神经毒性作用,且呈剂量依赖性。2.医用臭氧具有神经毒性,这一过程通过激活内质网钙离子释放和CaMKⅡ/ MAPK信号通路来实现。第二部分X-盒结合蛋白1(X-box binding proteinl,XBP1)在臭氧神经毒性保护机制中的作用研究研究目的：1.检测臭氧处理脊髓神经元后能否诱导内质网应激；2.检测XBP1在臭氧神经毒性过程中是否有保护作用及保护的可能机制。研究方法：1.重组腺病毒Adv-XBP1的构建和转染2.重组腺病毒Adv-XBP1对脊髓神经元XBP1过表达情况的鉴定RT-PCR和Western blotting法检测重组腺病毒Adv-XBP1处理脊髓神经元后内XBP1mRNA水平和蛋白水平表达的变化。3.观察臭氧处理之后内质网应激情况和XBP1的表达Western blotting法检测臭氧作用后脊髓神经元内GRP、CHOP和XBP1蛋白水平表达的变化,确定臭氧对内质网应激和XBP1通路的激活作用。4.观察XBP1重组腺病毒是否通过减少内质网应激保护臭氧诱导的细胞凋亡Western blotting法检测XBP1重组腺病毒预处理之后臭氧对脊髓神经元内GRP、CHOP和XBP1蛋白水平表达的影响,确定XBP1重组腺病毒对臭氧毒性的保护作用。研究结果：1.过表达腺病毒载体对脊髓神经元转染效率的鉴定脊髓神经元培养至7-8天,用不同滴度和不同持续时间的过表达腺病毒转染,观察转染后荧光强度的变化发现,最佳的转染时间为24h,最佳的转染滴度为80,该条件下转染效率达到80%。2.过表达腺病毒载体对脊髓神经元XBP1过表达效率的鉴定Adv-XBP1过表达腺病毒转染脊髓神经元之后,XBP1mRNA和相关蛋白的表达明显增加,而Adv-LacZ转染之后XBP1表达和对照组比较无统计学意义。3.臭氧暴露能够激活内质网应激和XBP1的剪切脊髓神经元臭氧处理之后,GRP78和CHOP蛋白的表达明显增加。此外,实时定量PCR检测结果显示,医用臭氧处理脊髓神经元之后能够增加XBP1mRNA的剪切,这种剪切与公认的内置网应激诱导Tunicamycin诱导的内质网应激相比,无统计学意义。另外,Western Blot结果显示臭氧能够明显增加XBP1蛋白的表达。4.过表达腺病毒对臭氧诱导内质网应激和脊髓神经元凋亡有保护作用臭氧处理之后GRP78和CHOP蛋白的表达明显增加,但用Adv-XBP1过表达腺病毒预处理之后再用臭氧处理,GRP78和CHOP蛋白的表达较单纯臭氧处理组明显降低。Adv-XBP1过表达腺病毒预处理联合臭氧处理脊髓神经元与Adv-LacZ腺病毒预处理联合臭氧处理相比,脊髓神经元的细胞活性增加,有统计学意义(P<0.05)。结论：1.医用臭氧作用于脊髓神经元能够激活内质网应激,增加XBP1的表达。2.XBP1重组腺病毒能够通过增加XBP1的表达,反馈抑制内质网应激,减缓细胞凋亡。
张治国[6]2006年在《甲基强的松龙联合褪黑素治疗急性脊髓损伤的实验研究》文中进行了进一步梳理前言:脊髓损伤引起损伤平面以下功能丧失,由原发性损伤引起的继发性损伤包括一系列的生化和细胞的变化,导致组织坏死和细胞死亡。在脊髓继发性损伤的众多机制中,自由基介导的氧化应激机制被认为是最重要的原因之一。甲基强的松龙通过减轻水肿和保护细胞膜对抗过氧化,是唯一被证明对SCI有临床效果的药物,褪黑素作为一种已知的自由基清除剂,已被证明可减轻实验性脊髓损伤的脂质过氧化,而且在超微结构观察比甲基强的松龙更具有保护作用。本研究的目的是为了观察联合应用甲基强的松龙和褪黑素对急性脊髓损伤的治疗效果。方法:成年Wistar大鼠(体重200～250g)随机分为4组(每组18只)用Allen的WD法建立模型,1组伤后立即给予30mg/kg的甲基强的松龙,2组予以10mg/kg的褪黑素,3组联合应用上述两药,4组予以5%乙醇0.2ml。然后每一组又分成伤后4h组、伤后24h组、伤后10天组。在各个亚组内至少有6只动物,不足的应及时补充。分别在伤后4h、24h、10天处死动物,其中10天组记录第1、3、5、7、10天的运动功能评分和斜板试验。通过对受损部位脊髓丙二醛含量的测定,观察受损部位脊髓的脂质过氧化水平。HE染色、Olsiwski氏小体染色观察受损部位脊髓的病理形态。电镜观察褪黑素、甲强龙及联合用药对轴突、神经元、髓磷脂、神经核及细胞间质水肿的影响。结果:甲强龙、褪黑素及两药联合治疗组在抑制脂质过氧化、行为学评分及病理形态和超微结构上与对照组相比有很大的提高,但叁个治疗组在上述方面上却处于同一水平。结论:甲强龙、褪黑素及两药联合对急性脊髓损伤的治疗效果在同一水平,由于两药有不同的抗氧化机制,因此进一步的研究包括不同剂量的联合,或许能够取得更好的效果。
梁朝革[7]2005年在《不同弹速椎体火器贯通伤对机体早期影响的实验研究》文中研究指明目的:探讨不同弹速椎体贯通伤对机体的早期影响及椎体贯通伤后早期脊髓继发损伤机制。方法:月龄约3月大的健康雄性家猪,建立L_2椎体不同弹速贯通伤模型,通过血清酶学、血液动力学等方法观察伤后不同弹速火器伤对机体的早期影响;通过CT、MRI观察损伤动物脊柱脊髓影像学特点;免疫组织化化学方法观察伤后脊髓组织的变化。结果:伤后高速枪伤组对机体造成的损伤是广泛而严重。免疫组化显示两组伤后转铁蛋白均呈阴性表达,而nNOS、铁蛋白和caspase-3均呈不同程度的阳性表达,但高速枪伤组叁种上述指标阳性细胞颗粒数及TUNEL染色阳性细胞颗粒数明显增多。结论:枪弹的速度是决定损伤程度的重要决定因素之一,伤后通过动态观测血清酶等指标的变化,可以有效的对伤情进行判定。CT、MRI对脊柱火器伤的外科治疗具有非常重要的指导作用。铁蛋白参与了脊髓的继发损伤反应,并且同损伤程度相关,而与转铁蛋白无关。在脊髓火器伤的早期阶段,nNOS和caspase-3起着重要的作用,它们表达的程度同脊髓损伤程度及损伤后神经细胞调亡指数相关。
秦杨[8]2016年在《脑损伤后脑结构改变与认知功能障碍的研究》文中进行了进一步梳理研究背景创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是各种战争或非战争军事行动及日常生活中常见的意外损害,其已成为青壮年致死致残的主要因素之一。临床观察发现很多创伤性颅脑损伤伤者即使感觉运动功能逐渐恢复正常,但是其后仍可能会逐渐出现不同程度的认知功能障碍,而且脑外伤病史已被认为是阿尔茨海默病的危险因素之一。约有65%的中到重型创伤性颅脑损伤伤者和约15%的轻型创伤性颅脑损伤伤者长期存在认知方面的问题;认知功能障碍被认为是创伤性颅脑损伤致残的主要原因。目前还需要对创伤性脑损伤后的一系列病理生理改变进行更多的基础研究,对于如何改善创伤性颅脑损伤后期认知损伤缺少具体治疗方案,因此该研究具有重要的现实意义。研究目的本课题以大鼠动物模型为基础,拟研究反复轻型创伤性颅脑损伤和伴蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)的中型创伤性颅脑损伤对脑结构和认知行为功能的影响,并初步比较尼莫地平和去铁胺治疗伴有蛛网膜下腔出血的创伤性颅脑损伤中的作用。研究方法使用落重法建立大鼠反复轻型创伤性脑损伤模型;改良两次注血法蛛网膜下腔出血大鼠模型,并以此为基础建立大鼠中型闭合性创伤性脑损伤模型。通过行为学研究方法评估大鼠运动、感觉、反射等基本神经功能状态和学习、记忆等高级认知功能。主要工具为改良神经功能缺失量表评分量表(m NSS)和和Morris水迷宫实验(MWM)。利用7.0T高场强小动物磁共振在活体上动态观察脑解剖结构的变化。主要成像手段包括T2加权成像、弥散张量成像和磁共振脑动脉成像及重建。病理学及分子生物学实验观察神经细胞保丢失及铁蛋白、铁转运蛋白、转铁蛋白受体蛋白的表达情况。药物干预研究,比较尼莫地平和去铁胺在干预伴蛛网膜下腔出血的中型闭合性脑损伤中的作用。研究结果1、反复轻型闭合性创伤性脑损伤大鼠随着创伤次数的增加,从第五次撞击开始实验组大鼠苏醒时间显着延长(p<0.05),在游泳运动能力无差异情况下,实验组大鼠在工作记忆、探索任务和参考记忆测试等方面显着差于空白对照组和单次撞击组(p<0.05)。2、损伤组大鼠在大脑皮层、海马区、扣带回、大脑脚等灰质和白质区域出现了显着的部分可逆的弥散张量成像改变。脑结构像表明皮层和海马逐渐萎缩、脑室扩张,同假损伤组和单次损伤组比较均具有显着统计学差异(p<0.01)。3、病理学研究提示实验组大鼠萎缩脑区神经细胞显着丢失(p<0.05)。4、改良后大鼠二次注血蛛网膜下腔出血模型血液主要分布于基底池和各大血管压迹内;基底动脉、大脑中动脉和大脑前动脉出现显着痉挛(p<0.05)。5、蛛网膜下腔出血组大鼠大脑脚FA值减小(p<0.05),而锥体束无显着改变。6、伴蛛网膜下腔出血的中型创伤性颅脑损伤大鼠m NSS评分可逆性增加(p<0.05),在10天左右恢复。7、盐水和去铁胺治疗组在第3-7天出现显着的脑血管痉挛(p<0.05或p<0.01),尼莫地平治疗组未出现明显脑血管痉挛。8、盐水和尼莫地平治疗组MWM表现明显差于去铁胺治疗组(p<0.05),且脑体积和皮层和海马神经元减少较去铁胺治疗组也更显着(p<0.05)。结论1、重复单次无症状轻型脑撞击可导致认知功能损伤。2、认知功能比感觉运动功能更易在重复轻型创伤性颅脑损伤中受损。3、创伤性颅脑损伤后认知功能损伤大鼠大脑皮层和海马的萎缩是明显的。4、脑白质和灰质的急性损伤在轻度撞击完成后恢复较快。5、改良的大鼠微创蛛网膜下腔出血模型成功率高,死亡率低;并能很好地模拟脑血管痉挛。6、蛛网膜下腔出血大鼠的皮质脊髓束在大脑脚部分损伤,但延髓部位正常。7、短期尼莫地平的运用能显着改善伴蛛网膜下腔出血中型创伤性颅脑损伤大鼠的脑大动脉痉挛,但是不能改善后期脑结构改变、MWM表现和神经元死亡。8、去铁胺不能减轻血管痉挛但有效改善了脑结构改变、MWM表现和神经元死亡。
朱丽华[9]2015年在《Rh-EPO干预早产儿脑白质损伤模型鼠的作用及机制研究》文中研究表明目的：脑室周围白质损伤(periventricular white matter damage,PWMD)是早产儿脑损伤的主要神经病理学形式,已成为早产儿脑瘫、智力障碍等神经系统后遗症的主要原因之一,给家庭和社会带来沉重负担。目前,早产儿脑白质损伤的发病机制尚未完全明确,缺氧缺血是早产儿PWMD发生的两个主要病因之一,而脑室周围血管发育不完善是早产儿发生PWMD的重要解剖因素,目前针对早产儿PWMD尚无有效的干预措施。所以寻找治疗或预防早产儿脑白质损伤的方法、改善早产儿生存质量已是目前迫切需要解决的问题之一。重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rh-EPO)多年来广泛用于早产儿贫血的治疗且取得较好的效果,随着深入的研究发现EPO不仅具有造血功能,而且具有良好的神经保护作用。研究表明外周静脉或腹腔内注射rh-EPO能通过血脑屏障直接在脑内发挥神经保护作用。目前国内外对rh-EPO与脑损伤的关系及机制研究主要集中于rh-EPO对脑卒中及脑外伤等的神经保护作用,与早产儿PWMD的关系的研究仍少,尤其是其中的机制目前不明确。因此,本研究通过建立缺氧缺血性PWMD新生鼠模型,并给缺氧缺血后的新生鼠腹腔内注射一定剂量的rh-EPO,观察rh-EPO对缺氧缺血的PWMD新生大鼠脑保护功能,并探讨可能机制。该研究将为临床治疗早产儿PWMD提供一定的实验信息及依据,为今后进一步研究早产儿PWMD的防治提供新的思路和途径。方法：本实验采用生后3日龄的新生大鼠,除假手术(Sham)组外,其余各组大鼠乙醚麻醉后取颈部正中切口,游离右侧颈总动脉并结扎,术毕放回原饲养环境中恢复2-3小时后置于恒温密闭容器中,以2L·min-1的速度输入6%02、94%N2混合气体,持续4小时。Sham组大鼠手术仅游离右侧颈总动脉但不结扎,不进行缺氧通气。药物干预组(HI-EPO)大鼠于缺氧后1小时内给予腹腔注射(5U/g)的rh-EPO。缺氧缺血(hypoxia-ischemia, HI)组和Sham组大鼠给予腹腔注射相同剂量的无菌生理盐水。第一部分：整个实验过程中观察大鼠的生长发育状况,术后11天(P14)天断头取脑行HE染色观察脑组织病理改变,生后(postnatal day,P)30天动物行为检测(悬吊实验、旷场实验、拒俘反应实验、圆筒实验)和P90天学习记忆检测(叁臂迷宫实验)。每小组完成实验保证6只。第二部分：分别于术后2天(P5)、术后5天(P7)、术后7天(P10)和术后11天(P14)断头取脑,一部分标本用于免疫组化检测EPO受体(Eythropoietin receptor, EPOR)和携氧蛋白神经珠蛋白(Neuroglobin,Ngb),一部分标本用于Western Blotting方法检测EPOR蛋白,另一部分用于Real-time PCR方法检测Ngb。每小组完成实验保证6只。第叁部分：分别于术后2天(P5)、术后5天(P7)、术后7天(P10)和术后11天(P14)断头取脑,一部分标本用于免疫组化检测血管生成细胞内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),一部分标本用于Western Blotting法检测EPCs,另一部分用Real-time PCR方法检测血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素-1(Angiopoietin-1, Ang-1)、新生微动脉标志EphrinB2和微静脉标志EphB4。每小组完成实验保证6只。结果：1.Sham组幼鼠死亡率为2.50%；HI组幼鼠死亡率为16.12%：HI-EPO组幼鼠死亡率为8.23%；叁组间死亡率差异存在统计学意义(χ2=8.32,P<0.05)。术前,各组大鼠体重差别无统计学意义(F=0.448,P=0.647),自术后2天(P5)起HI组大鼠体重增长幅度低于Sham组,两组间差异存在统计学意义(P<0.05)：HI-EPO组大鼠在手术后初期体重增长情况不良,从术后7天始体重增长加快,体重高于HI组但略低于Sham组,而且与Sham组和HI组间体重差异均存在统计学差异(P<0.05)2. Sham组鼠双侧脑室大小相同,细胞排列整齐,形态大小正常。HI组鼠右侧脑室较对侧明显增大,脑室形状不规则,脑室周围组织疏松,细胞变性、水肿,部分可见内囊部位空腔形成：HI-EPO组鼠脑室周围白质病变减轻。3.悬吊实验、旷场实验、拒俘实验及叁臂迷宫评分结果均显示叁组间存在统计学差异,进一步两两分析,HI组评分明显低于Sham组(P<0.05),HI-EPO组评分改善高于HI组(P<0.05),且与Sham组间差异无统计学意义(P>0.05)。圆筒实验评分结果显示HI组偏好右前足的频率与Sham组间存在明显统计学差异(P<0.01),HI-EPO组则有改善,但未恢复到正常,与前两组间均存在统计学差异(P<0.05)。4. Sham组大鼠EPOR表达在一较低水平；大鼠缺氧缺血后脑内EPOR在术后2天(P5)即明显增多,术后4天(P7)则逐渐开始下降,但一直到术后11天(P14)仍保持在一较高水平,术后各时间点与Sham组比较有统计学意义(P<0.05)；HI-EPO组大鼠EPOR在术后2天(P5)较HI组及Sham组均增高且达到一高峰,与HI组及Sham比较增高有统计学意义(P<0.05),但很快开始下降,在术后4天(P7)就降至HI组水平,术后7天(PI0)和术后11天(P14)进一步下降,与Sham组比较无统计学意义(P>0.05),与HI组比较存在统计学意义(P<0.05)。5.Sham组大鼠Ngb随着日龄的增大而略微增加；大鼠HI后脑内Ngb在术后2天(P5)即开始增加,术后7天(PI0)及11天(P14)未表现出进一步增多,术后各时间点与Sham组比较有统计学意义(P<0.05)；HI-EPO组大鼠Ngb在术后2天(P5)至术后7天(PI0)较HI组增高,且两组之间比较有统计学意义(P<0.05),术后11天(P14)Ngb则下降,与HI组比较无统计学意义,但与Sham组比较仍有统计学意义(P<0.05)6. Sham组CD34+细胞随着日龄的增加而增加；HI后CD34+细胞较相同日龄Sham组大鼠初始增多(P5和P7),且两组间差异存在统计学意义(P<0.05),但术后7天起(PI0)开始下降,并少于相同日龄Sham组大鼠,两组间差异存在统计学意义(P<0.05)；HI-EPO组大鼠CD34+细胞变化趋势同缺氧缺血组,且较相同日龄缺氧缺血组鼠增多,各时间点两组间差异存在统计学意义(P<0.05),同时与Sham组间差异也存在统计学意义(P<0.05)。7.Sham组大鼠VEGF、Ang-1表达随着日龄的增加而增加：大鼠HI后脑内VEGF水平在术后2天(P5)即开始增加,至术后7天(PI0)达到高峰,然后下降,各时间点VEGF表达量均较Sham组增多；HI-EPO组大鼠术后2天(P5)VEGF、Ang-1表达量即较缺氧缺血组大鼠开始增加,术后7天(PI0)达高峰,术后11天(P14)又开始下降但仍高于缺血缺氧组,各个时间点与缺血缺氧组间差异存在统计学意义(P<0.05)8.Sham组大鼠EphrinB2及EphB4表达均随着日龄的增加而增加,各时间点EphrinB2/EphB4比例接近0.5；大鼠缺氧缺血后脑内EphrinB2及EphB4在术后2天(P5)未见增加,EphrinB2/EphB4为0.49,与Sham组比较差异无统计学意义(P>0.05),但自术后4天(P7)EphrinB2及EphB4迅速增加,与Sham组比较差异有统计学意义(P<0.05),术后7天(PI0)开始则下降,但EphrinB2表达较EphB4多,EphrinB2/EphB4为0.56;HI-EPO组大鼠术后2天(P5)EphrinB2及EphB4表达较HI组大鼠明显增加(P<0.05),术后4天(P7)达高峰然后开始下降,但仍高于缺血缺氧组,且EphrinB2表达较EphB4多。结论：1.缺氧缺血后脑组织有内源性修复反应,表现为脑室周围白质EPOR表达增加,携氧蛋白Ngb呈现持续上升表达,并有血管新生反应。2. Rh-EPO对PWMD起到了保护作用,rh-EPO干预缺氧缺血脑白质损伤鼠可以明显减轻脑室周围白质区域的损伤,可以改善大鼠的远期神经行为学能力,促进脑白质内EPOR表达进一步上调,给EPO提供受体发挥效应。3. Rh-EPO与EPOR结合后,一方面可以通过促进Ngb为脑组织提供更多的氧,另一方面可以通过促进血管新生反应为脑组织提供更多脑血流发挥干预效应。
赵伟[10]2008年在《大鼠全横断损伤脊髓及其相关部位的蛋白组学比较研究》文中指出【目的】:调查大鼠脊髓全横断损伤处瘢痕、损伤位点头侧和尾侧脊髓及其相联系的大脑皮质与骨骼肌中的蛋白组学变化,探讨其与脊髓可塑性的关系。【方法】:取成年SD雌性大鼠25只,随机分成5组:双向电泳条件实验组,假手术对照组、脊髓全横断手术3、14和28天组,每组5只动物。各组大鼠存活期间分别行后肢BBB运动功能评分和CSEP测定。然后分别于各时间点将动物麻醉后分别提取双侧大脑皮质、T11脊髓瘢痕、横断处头、尾端脊髓和腓肠肌的总蛋白,Bradford法测定蛋白浓度,采用双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分离蛋白质,得到各组双向电泳凝胶图谱;应用PDquest软件分析不同部位各组间双向电泳图谱中表达明显差异的蛋白质(各组间表达差异大于1.5倍);采用串联质谱技术检测出筛选的表达明显差异蛋白质的肽指纹图,并应用生物信息学技术进一步鉴定这些蛋白质。【结果】:1.双向电泳条件实验结果显示:不同批次相同上样量的2-DE凝胶及同一批次相同上样量的凝胶之间所有蛋白质斑点的匹配率均达到70%以上。2.动物BBB评分结果显示:脊髓全横断后,各组大鼠后肢的运动功能呈现了部分恢复。从术后3天至术后14天到28天组逐渐增高(P＜0.05)。但在损伤各组均未记录到CSEP。3.蛋白组学检测结果显示:在假手术、损伤3、14和28天四组大脑皮质的双向电泳图谱中分别检测到蛋白点数量分别为550、412、351和357个。应用串联质谱技术鉴定出30个表达明显差异的蛋白质;在头侧各组脊髓中检测到蛋白点数量分别为500、326、464和434个。应用串联质谱技术鉴定出14个表达明显差异的蛋白质;在尾端脊髓各组中分别检测到的蛋白点数量为580、394、245和193个。应用串联质谱技术鉴定出33个表达明显差异的蛋白质;在横断处瘢痕的假手术、损伤14和28天各组中分别检测到的蛋白点数量为553、456和263个。在瘢痕与损伤处头、尾端脊髓比较时,在损伤14天头、尾端脊髓,28天头尾端脊髓以及14天与28天瘢痕组织中分别检测到557、429、433、400、477和397个蛋白斑点。应用串联质谱技术鉴定出40个表达明显差异的蛋白质;在腓肠肌各组中分别检测到蛋白点数为442、395、407和384个。应用串联质谱技术鉴定出18个表达明显差异的蛋白质。上述差异蛋白质按功能可分为几类:包括参与代谢的蛋白,与突触联系相关蛋白,抗氧化机能蛋白,神经传导相关蛋白,维持细胞功能形态蛋白,神经元变性死亡相关蛋白,瘢痕形成相关蛋白,骨骼肌功能相关蛋白等等。【结论】:1.本实验成功建立了大鼠皮质蛋白质双向电泳技术。并用该技术成功对全横断脊髓损伤后动物的大脑皮质,损伤脊髓头、尾端,瘢痕及骨骼肌的蛋白质进行了分离和鉴定。结合动物下肢运动功能评价,揭示了大鼠脊髓全横断损伤后,可能与脊髓可塑性有关的分子机制以及各相关部位蛋白组学的表达变化关系。2.本实验中脊髓及其相联系的各部位蛋白质组发生的这种复杂变化是由脊髓全横断损伤所触发的,这些差异蛋白可能参与了脊髓损伤后的一系列应答反应,并可能对损伤神经元的存活,神经胶质瘢痕的形成,轴突的再生、延伸以及重建功能性突触联系产生一定的作用。
参考文献：
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[3]. 铁离子在实验性脑室出血后脑损伤中的作用机制及干预研究[D]. 陈志. 第叁军医大学. 2014
[4]. 叁七总皂苷对大鼠脊髓半横断损伤后神经保护作用及cPLA_2相关机制[D]. 皮斌. 中南大学. 2012
[5]. 内质网钙离子释放和CaMKⅡ/MAPK信号通路在臭氧脊髓神经元神经毒性的作用机制及XBP1预防靶点的研究[D]. 李芸. 山东大学. 2016
[6]. 甲基强的松龙联合褪黑素治疗急性脊髓损伤的实验研究[D]. 张治国. 山西医科大学. 2006
[7]. 不同弹速椎体火器贯通伤对机体早期影响的实验研究[D]. 梁朝革. 第二军医大学. 2005
[8]. 脑损伤后脑结构改变与认知功能障碍的研究[D]. 秦杨. 第叁军医大学. 2016
[9]. Rh-EPO干预早产儿脑白质损伤模型鼠的作用及机制研究[D]. 朱丽华. 东南大学. 2015
[10]. 大鼠全横断损伤脊髓及其相关部位的蛋白组学比较研究[D]. 赵伟. 昆明医学院. 2008
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