胡军和[1]2005年在《猪体细胞核移植研究》文中研究表明本研究以猪卵母细胞为主要材料,体外成熟培养猪卵母细胞,同时分离培养颗粒细胞与胎儿成纤维细胞作为供核细胞,对卵母细胞成熟培养、孤雌激活和核移植的影响因素进行了探讨,为进一步进行转基因猪的研究奠定了基础。实验主要结果如下:(1)研究了不同时间段添加外源激素及不同基础培养液和血清有无对猪卵母细胞体外成熟的影响。实验包括,①猪卵母细胞以TCM199+10% FBS+10IU/mL Pregnant Mare Serum Gonadotrophin(PMSG)+10 IU/mL Human Chorion Gonadotrophin(hCG)+2.5 IU/mL Follicle Stimulate Hormone (FSH)为成熟培养液体外培养44 h,前22 h在培养液中加入激素,后22 h 不加入激素及前22 h不加激素,后22 h添加激素和添加激素连续培养44 h;②以实验①中激素添加的方案在体外添加激素连续培养44 h,对不同基础培养液(TCM199 粉剂、TCM199 原液和改良TCM199(mM199))对猪卵母细胞体外成熟进行了研究; ③以实验②中筛选出的mM199组为成熟培养液对比血清有无对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,实验①中3 种激素添加不同时间段其成熟率分别为45.67%、45.29%和46.07%,对猪卵母细胞体外成熟无显着影响(P>0.05);实验②中,mM199 组的成熟率(54.10%)高于TCM199 粉剂组的成熟率(46.16%)及TCM199 原液组的成熟率(47.14%),但差异不显着(P>0.05);实验③中无血清组的成熟率(67.10%)高于有血清清组的成熟率(52.22%),差异显着(P<0.05)。由此可见,mM199 +10 IU/mL PMSG+10 IU/mL hCG+2.5 IU/mL FSH 是一种适合于猪卵母细胞体外成熟的培养液,体外成熟率达67.10%。(2)研究了离子霉素、电场强度、电脉冲次数和电刺激-化学联合激活对猪卵母细胞孤雌激活的影响,以出现分裂球为激活的标准。结果表明:①10 μM 离子霉素处理5 min的激活率60.71%(17/28)与处理10 min、15 min的激活率62.50%(15/24)、65.22%(15/23)差异不显着(P>0.05)。②以电场强度120 v/mm,脉冲次数3 次处理猪卵母细胞的激活率66.67%(30/45)与60 v/mm、80 v/mm、100 v/mm 的激活率40.98%(17/42)、44.11%(15/34)、46.19%(18/39)有显着差异(P<0.05),但与140 v/mm、160 v/mm 的激活率63.89%(23/36)、64.10%(25/39)无显着差异(P>0.05)。③以电场强度120 v/mm,不同电脉冲次数进行激活。以2 次电脉冲激活猪卵母细胞的激活率67.40%(31/46)与1次、2 次电脉冲的激活率62.80%(27/43)、68.30%(28/41)无显着差异(P>0.05)。④以电场强度120 v/mm,2 次电脉冲与10 μM 离子霉素处理5min 联合激活猪卵母细胞的激活率84.84%(29/33)与只用电场强度120 v/mm,2 次电脉冲的激活率64.67%(23/34)差异显着(P<0.05)。实验结果表明:电场强度120 v/mm,2 次电脉冲与10 μM 离子霉素处理5min 联合处理激活能有效提高猪卵母细胞孤雌激活的激活率。(3)本研究利用成熟后的卵母细胞的颗粒细胞,可以简单而快速的进行颗粒细胞的分离与培养;用室温消化法可以分离培养单个细胞分别获得猪胎儿成纤维细胞;在进行冷冻保存后可以成功解冻猪胎儿成纤维细胞(其存活率为83.5%);这样为以后的核移
项智锋[2]2004年在《猪体细胞核移植及相关技术研究》文中认为1．以猪卵巢卵母细胞为研究对象，进行卵母细胞体外成熟培养，对影响该技术的几项重要因素即卵母细胞状态、培养基、培养基添加物进行研究分析，结果表明：(1)来源于不同直径卵泡和不同分级的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)在体外成熟中成熟能力差异显着，直径2-6ram卵泡GOEs成熟率80.7％，大于6mm卵泡COCs成熟率81.2％，均显着高于小于2mm卵泡COCs成熟率(36.5％，P＜0.05)。A、B级COCs成熟率极显着于C级(P＜0.01)，叁者成熟率分别为80.7％、80.2％，21.2％。(2)TCM199、NCSU-23两种不同的培养液对猪卵母细胞体外成熟培养卵母细胞成熟率无明显差异(79.8％，80.6％，P＞0.05)。(3)基础培养基中添加促性腺激素PMSG、hCG能显着提高猪卵母细胞体外成熟率(添加PMSG、hCG组分别为：80.5％、77.2％、84.0％，未加组：62.5％、50.5％)；类固醇激素E2当与PMSG、hCG协同作用时对卵母细胞的体外成熟有支持作用，且激素作用时间为24h时成熟率最高(84.0％)；而再添加生长激素rpGH则作用不大(浓度为10ug/ml、20ug/ml、0成熟率分别为：80.4％、75.7％、77.5％，叁组差异不显着P＞0.05)；卵泡液对卵母细胞体外成熟具有促进作用(添加组：81.4％、81.8％，未加组：50.6％)，添加组成熟率显着高于未添加组(P＜0.05)。 2．以卵丘细胞为供核体细胞，采用胞质内注射法进行猪体细胞核移植，对去核、激活和培养等关键技术过程进行研究，结果表明：(1)点压法、挤压法对卵母细胞去核去核率明显高于盲吸法(叁者分别为62.5％，64.6％，50.7％，P＜0.05)。盲吸法去核染色体容易发生位置偏离，影响去核效果，但对早成熟的卵母细胞(36-44h)进行去核可明显提高去核效率(P＜0.05)，在36-38h、39-41b、42-44h去核率分别为60.9％、67.8％、64.3％，而45-48h为48.4％。(2)体细胞预激活有助于提高核移胚卵裂率(28.0％，20.1％，P＜0.05)。钙离子载体A23187单独或与6-二甲基氨基嘌呤6-DMAP联合作用能使猪体细胞核移胚激活继续发育。(3)核移胚以NCSU23及卵丘颗粒单层饲养TCM199培养系统进行分别培养，核移胚卵裂率无明显差异(30.06％，31.5％，P＞0.05)。但NCSU23培养4细胞后发育能力更高(13.5％，3.9％，P＜0.05)。
徐小明[3]2006年在《胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离》文中研究说明本研究以猪不同类型的细胞为供核细胞,体外成熟去核卵母细胞为受体胞质在体外构建胚胎,建立了体外生产体细胞核移植胚胎的技术体系,为体细胞克隆猪及核移植源胚胎干细胞(ntESCs)系的分离提供良好的平台。论文主要从以下5个方面进行了研究:1.供核细胞的准备共从4例胎儿肌肉组织中分离得到4个猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, pFF)株,从1例新生猪耳组织中用组织块培养法分离得到一个耳部皮肤成纤维细胞(porcine ear skin fibroblasts, pESF)株,从3例胎猪骨髓中分离得到3个胎猪骨髓间充质干细胞(porcine fetal mesenchymal stem cells, pFMSCs)株。将1~5代的pFF、pESF及pFMSCs分别进行冷冻保存,解冻复苏后形态及活力没有明显变化。pFMSCs形态为成纤维样,呈长梭形,连续传13代后形态没有明显改变。传代培养的pFMSCs生长潜伏期为1~2 d ,之后进入对数增殖期,接种后的第6天进入平台期。透射电镜分析表明,pFMSCs细胞核质比高,胞浆中细胞器少。核型分析表明,pFMSCs具有正常的核型(2n=38,XY)。流式细胞仪检测显示,pFMSCs表达细胞表面抗原CD44,CD166,CD105,CD117,不表达CD45,CD90,CD11a,CD14。在β-巯基乙醇作用下,pFMSCs可诱导分化为神经样细胞,Nestin染色阳性。经血清饥饿和接触抑制处理的pFMSCs,流式细胞仪检测G0/G1期的细胞分别为86.72%和88.44%。以上细胞的分离培养为猪体细胞核移植相关研究打下了基础。2.猪卵母细胞体外成熟培养体系的建立从屠宰场采集猪卵巢,选择颗粒细胞层数2层以上、胞质均一的COCs进行体外成熟培养,对培养液组份进行了比较发现:①mM199组猪卵母细胞成熟率显着高于M199组(71.7% vs 59.7%)(p<0.05),mM199组和M199组较NCSU-23组(43.6%)均能显着提高卵母细胞的成熟率(p<0.01)。②PMSG+hCG+FSH组卵母细胞成熟率略高于FSH+LH组,二组卵母细胞成熟率显着高于hMG组(p<0.01)。③分别添加FBS和PFF与对照组(分别不添加FBS和PFF)成熟率无统计学上的差异,但电激活后,均能显着提高卵裂率(p<0.05),桑囊率二者无显着差异(p>0.05)。④单独添加EGF和联合添加EGF和ITS卵母细胞成熟率较不添加组稍有提高。电激活后,均能显着提高桑囊率(p<0.05)。⑤选择颗粒细胞层数3层以上的COCs可以显着提高卵母细胞体外成熟率
张运海[4]2005年在《利用体细胞核移植技术生产猪克隆胚胎的研究》文中研究表明猪是人异种器官移植理想的器官来源。体细胞核移植为人们生产不引起免疫排斥以及无内源性病毒的猪提供了可能。本研究系统地研究了猪体细胞克隆相关技术环节,旨在搭建一个能有效生产猪克隆胚的平台。主要内容如下: 利用组织块培养法建立了中国实验用小型猪9个40d胎儿成纤维细胞系和1个成体成纤维细胞系。利用血清饥饿以及接触抑制对细胞进行细胞周期同期化处理,发现细胞同期到G0/G1期的效率相同,而且在处理2d之后,G0/G1期细胞比例不再有显着增加。结果表明胎儿成纤维细胞对血清饥饿以及接触抑制的反应相当,同期处理2d即可为核移植提供足够的供体细胞。 比较了不同培养基,氧分压以及添加胰岛素和LIF对猪卵母细胞体外成熟,成熟后孤雌激活发育的影响,首次尝试将一种新的胚胎培养基PZM-3用于猪卵母细胞体外成熟,还探索了猪体外成熟卵母细胞孤雌激活方案。结果如下:NCSU-23中,卵母细胞核成熟明显优于在TCM199中成熟的效果(p<0.05);1.4kv,100μs,1DC电激活后,卵母细胞死亡率明显高于2.0kv/cm,30μs,1DC和2.0kv/cm,60μs,1DC处理组。但激活后叁组间胚胎卵裂率(分别为:72.6%vs.85.9%,73.2%)和囊胚率(分别为:32.1%vs.49.4%,39.0%)相似;化学激活后,胚胎卵裂以及囊胚率都明显不如电激活处理(卵裂率14.4%vs.72.8%;囊胚率3.3%vs.31.5%);以NCSU-23为基础培养基,高氧核成熟显着优于低氧;以改进的PZM-3成熟卵母细胞,核成熟上仍然是高氧优于低氧。若不考虑气相影响,PZM-3的成熟效果明显不如NCSU-23;添加5μg/ml胰岛素后卵母细胞成熟效果显着提高,但是成熟后激活发育没有显着改善。而添加1000 IU/ml LIF卵母细胞核成熟率不但没有明显提高,反而孤雌激活后囊胚率急剧下降,尽管卵裂率以及囊胚细胞总数都没有明显改变。上述结果表明①NCSU23是猪卵母细胞比较理想的培养基,其成熟卵在2.0kv/cm,30μs,1DC或者2.0kv/cm,60μs,1DC电击参数激活下发育比较好;②高氧对卵母细胞核成熟有利,但附植前孤雌胚胎发育具有培养基依赖性;③添加Insulin可以改善卵母细胞核成熟,而添加LIF对卵细胞质成熟有害;④PZM-3如果应用于卵母细胞体外成熟还需要进一步优化。 比较了IVF,PA以及SCNT胚胎的发育率和囊胚质量。叁者发育率相似(囊胚率分别为:11.0%,22.6%和16.9%),但是在囊胚质量即ICM/总细胞数比例上,IVF和SCNT胚优于PA胚。比较了PZM-3和NCSU-23培养对孤雌激活胚以及克隆胚发育的影响。对PA胚来讲,PZM-3明显好于NCSU-23(囊胚率35.4%vs.22.6%,p<0.05);而对SCNT胚,PZM-3明显不利于卵裂,但对囊胚发育影响不大(21.1%vs.26.6%,p>0.05)。在NCSU-23+4 mg/ml BSA中添加5μg/ml胰岛素对胚胎发育没有明显促进作用,而添加1000 IU/ml LIF也没发现有损害早期发育的情况。上述结果表明,对孤雌胚或者体外受精胚理想的培养基,当用于克隆胚胎培养时却不一定是最佳的选择;孤雌胚胎在体内发育能力差,可能和ICM/总细胞数很低有关。添加5μg/ml Insulin或者1000IU/ml LIF对孤雌激活胚胎早期发育没有显着影响。 利用脂质体转染技术建立了转GFP的猪胎儿成纤维细胞系,尝试了生产转GFP胚胎的可能性,同时系统研究了供体细胞转染与否、传代次数、准备方式、细胞周期同期化、细胞年龄、细胞形态以及细胞性别等对克隆胚胎早期发育的影响。结果如下:用转GFP的细胞获得克隆胚胎
张德福[5]2008年在《猪体细胞核移植及其相关技术研究》文中研究说明体细胞克隆猪在人的动物疾病模型和人类异种器官移植方面具有巨大优势和应用潜力,已经成为当今体细胞克隆领域研究的热点。虽然体细胞克隆猪在几个国家已获得成功,但其克隆效率仍很低(1-2%)。本研究以建立高效的猪体细胞核移植技术体系为目的,系统地研究了影响猪体细胞核移植效率的因素,通过优化相关技术,改善培养条件,达到稳定、大量地生产克隆胚胎,并进行胚胎移植以期获得克隆猪的出生。本研究利用组织块法建立了广西巴马香猪的40d胎儿成纤维细胞系、成年耳成纤维细胞系,以机械刮取法建立了输卵管上皮细胞系,并分离培养了猪卵泡液中的颗粒细胞。研究了冻存对胎儿成纤维细胞的影响以及胎儿成纤维细胞的生长曲线和染色体倍性。实验结果表明,冻存后的胎儿成纤维细胞仍能保持良好的生长状态,细胞生长曲线呈典型的S型,在传代10次之前,染色体倍性正常的比例在92%以上。利用脂质体法转染了质粒pEGFP-cl,研究了细胞密度、DNA、脂质体的用量、DNA脂质体复合物的暴露时间对转染效率的影响。结果表明：24孔板内细胞汇合85%-90%,1.0μg DNA和2.4μL脂质体的用量,暴露4h转染效率最高。优化了卵母细胞体外成熟体系：在NCSU-23+10%PFF中培养的卵母细胞成熟率最高(79.08%),FBS对卵母细胞体外成熟作用不大；成熟培养液NCSU-23的成熟培养效果略高于TCM 199；在NCSU-23培养液中添加EGF对成熟效率影响不大。经多次孤雌激活实验表明,以200V/mm,60μs,1DC的处理效果最佳；电激活后分别在成熟培养液中添加2mM 6-DMAP进行化学处理,所得的卵裂率略高于对照组、囊胚率显着高于对照组；20μM/L离子霉素激活处理40min激活效果最好；体外成熟培养36h、40h、52h的卵母细胞在卵裂率和囊胚率上明显不如44h、48h,成熟培养48h的卵母细胞卵裂率最高可达81.75%,44h囊胚率最高为22.22%。血清饥饿法和接触抑制法对供核细胞进行细胞周期化处理,诱导细胞进入G0/G1期。各组之间的卵裂率、囊胚率差异不显着,经血清饥饿的供体细胞所得的囊胚率较高。比较了盲吸法、Spindle-view去核法,发现Spindle-view法的去核率可以达到95.76%,是一种安全、高效的去核方法。以胎儿成纤维细胞作为供核体细胞构建的重构胚后期发育效果良好；10代以内的胎儿成纤维细胞更有利于重构胚的发育,融合率、卵裂率和囊胚率都很高。200v,60us,1DC电激活后,在以B2为培养基的培养体系中进行培养,无论在重构胚的融合率、卵裂率和囊胚率上均高于NCSU-23,但差异不显着。从实验成本考虑,采用传统的NCSU-23培养基是可行的。在以上实验的基础上,对实验室获得的早期重构胚胎(1-4细胞胚胎)进行了手术法胚胎移植。移植受体母猪(上海白猪)12头,结果有一头猪顺利怀孕到终期,经剖腹产产下一头健康的克隆巴马小型猪,还有另外叁头母猪于移植后51 d、76 d和77d返情,怀孕率33.3%。
黄雅琼[6]2008年在《猪体细胞核移植相关技术研究》文中指出1.探讨了猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程和卵母细胞的发育潜力。(1)不同直径卵泡内的卵母细胞的成熟进程及各时相出现的时间存在差异。直径＞2mm的卵泡内的卵母细胞体外培养16 h,大部分发生GVBD(germinal vesicle breakdown);卵母细胞GV期的比率由0h的68.00%下降到16h的15.38%;成熟培养20h时,终变期(diakinesis,DK)的比率达到峰值(27.06%),而MⅠ的峰值(69.69%)出现在培养后28h;成熟培养32～44h时,Ana-Ⅰ/Tel-Ⅰ期的比率达到最高(53.33%);成熟培养48h时,MⅡ期的比率达到最大值(63.64%)。(2)不同直径卵泡的卵母细胞体外成熟后的孤雌发育能力不同。直径＜2mm、直径2～6mm、直径＞6mm的卵泡的卵母细胞的成熟率分别为5.12%,66.63%和46.72%;分裂率分别为1.42%,72.19%和58.54%;囊胚率分别为0、28.76%和23.13%。直径＜2mm和＞6mm卵泡内的卵母细胞的卵裂率明显低于直径2～6mm卵泡的卵母细胞的卵裂率(P＜0.05)。直径2～6mm卵泡内的卵母细胞体外成熟较快,体外发育潜能较高。2.探讨了激素和生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果发现,在成熟液中添加0.1μg/mL FSH的卵母细胞成熟率显着高于添加0.01IU/mL人绝经期促性腺激素(hMG)的卵母细胞成熟率(P＜0.05),但两组间的分裂率和囊胚率差异不显着(P＞0.05)。猪卵母细胞分别在添加有0、10、30、50、70或90ng/mL表皮生长因子(EGF)的成熟液中成熟培养后进行孤雌激活,50ng/mL EGF组的成熟率达到66.89%,孤雌激活的分裂率达到84.90%,囊胚率达到30.20%,成熟率显着高于其余各组,分裂率和囊胚率高于对照组。在成熟液中添加10ng/mL胰岛素样生长因子(IGF-I)显着提高猪卵母细胞的第一极体排出率。在成熟液中同时添加50ng/mL EGF和10ng/mL IGF-I显着提高猪卵母细胞的孤雌发育能力(P＜0.05)。分别使用以TCM-199、NCSU-23(North Carolina State University-23,北卡大学胚胎培养液)和PZM-3为基础液的成熟液进行成熟培养猪卵母细胞,各组间在分裂率,成熟率和囊胚率方面差异不显着(P＞0.05),表明均可用于猪卵母细胞的体外成熟和体外培养。3.系统探讨了孤雌激活方法对猪卵母细胞孤雌发育效果的影响。结果发现:(1)浓度为9%的乙醇(EH)激活处理10min效果好于15min;(2)用9%EH激活处理10min后,再用2μmol/L 6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)培养处理3～4h的卵母细胞分裂率及囊胚率分别为82.86%和22.86%,显着高于再用10μg/mL放线菌酮(CHX)+10mmol/L SrCL_2(Sr~(2+))、10 mmol/L Sr~(2+)+2μmol/L 6-DMAP、10μ/mL CHX+2μmol/L6-DMAP或10μg/mL CHX+2μmol/L 6-DMAP+10 mmol/L Sr~(2+)培养处理3～4h的卵母细胞。(3)比较几种激活方法(5μmol/L Ion激活处理5min,9%乙醇激活处理10min,50 v/mm和50μs的电脉冲2次)的猪卵母细胞孤雌激活效果发现,离子霉素(Ion)的猪卵母细胞孤雌激活效果最好,囊胚率达到37.50%。(4)卵母细胞周围的卵丘细胞层数对其成熟后的孤雌发育有显着影响,4～6层和6层以上卵丘-卵母细胞复合体成熟后的孤雌激活分裂率(68.99%和75.36%)和囊胚率(32.56%和37.68%)显着高于其它组(p＜0.05)。4.对猪卵丘细胞、胎儿成纤维细胞和睾丸间质细胞的分离和传代培养进行了系统研究。结果发现,猪卵丘细胞单层的生长需要5～6d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。酶消化法和钢网过滤筛选法可获得猪睾丸间质细胞,猪睾丸间质细胞单层生长需要3～5d。猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后,复苏率为68.36%。通过培养和观察,猪胎儿成纤维细胞的生长形成有规则的生长曲线。5.对猪体细胞核移植的方法及影响因素进行了探索。(1)猪卵母细胞体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h后,分别进行去核构建重构胚,结果发现,成熟44h和48h的卵母细胞核移植后的融合率(58.99%和56.51%)、卵裂率(67.52%和65.73%)和囊胚率(22.78%和15.96%)较高,其中卵龄为44h的分裂率与囊胚率显着高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞(P＜0.05)。卵龄为48h的融合率高于卵龄为52h的卵母细胞(P＜0.05)。(2)盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view系统去核法的去核率分别为76.33%,100.00%,98.40%,前者低于后两者(P＜0.05);叁种去核方法去核的卵母细胞核移植后,分裂率以Hoechest染色法较低(P＜0.05),但融合率和囊胚率差异不显着(P＞0.05)。(3)不同注核方法(细胞质内注射法和透明带下注射法)的核移植效果研究结果显示,细胞质内注射和透明带下注射法的分裂率为(68.13%和60.37%)与囊胚率(6.44%和8.08%)差异均不显着(P＞0.05)。6.探讨了供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响。(1)比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞的核移植效果发现,胎儿成纤维细胞的融合率(64.74%)高于颗粒细胞(51.05%)和卵丘细胞(56.89%),但叁种细胞的卵裂率及囊胚率差异不显着(P＞0.05)。(2)不同代数的胎儿成纤维细胞的核移植效果的研究发现,6～9代的融合率显着高于3～5代和＞10代的成纤维细胞(P＞0.05),但卵裂率和囊胚率差异不显着(P＞0.05)。(3)不同性别猪胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现:雄性胎儿成纤维细胞核移植的融合率和分裂率与雌性胎儿成纤维细胞相比差异不显着(P＞0.05),但囊胚率显着低于雌性胎儿成纤维细胞(P＜0.05)。(4)100%长满汇合的胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70～80%汇合的胎儿成纤维细胞(P＜0.05),分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞(P＜0.05),但囊胚率差异不显着。(5)猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后的核移植分裂率和囊胚率均显着低于新鲜和4℃冷藏的细胞(P＜0.05),虽然融合率无显着差异(P＞0.05),表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植。(6)表面光滑的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率均显着高于表面粗糙的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率(P＜0.05),虽然融合率差异不显着(P＞0.05)。(7)直径＜15μm的供体细胞核移植后的融合率显着低于直径＞30μm的供体细胞(P＜0.05),直径20～3μm供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率(63.73%和21.54%)较高。(8)组织块法和酶消化法分离得到的供体细胞所构建的重构胚在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显着差异(P＞0.05)。
吕培茹[7]2008年在《巴马小型猪体细胞核移植和食蟹猴—猪异种体细胞核移植相关问题的初步研究》文中指出本研究主要探讨巴马小型猪体细胞核移植和食蟹猴-猪异种核移植的相关技术问题。本论文包括两大部分,第一部分是文献综述,第二部分是试验研究。试验研究包括:(一)猪和食蟹猴体细胞培养体系的建立;(二)巴马小型猪体细胞核移植体系的建立;(叁)PHA对孤雌激活和体细胞核移植胚胎发育的影响;(四)猪体细胞核移植胚胎移植方法的建立;(五)食蟹猴-猪异种核移植的初步研究。试验研究的方法和结果可归纳为如下几点:1.建立巴马小型猪睾丸成纤维细胞、耳部成纤维细胞、普通猪胎儿成纤维细胞和颗粒细胞的体外培养体系,并探讨其作为猪体细胞核移植供体的可能性。使用酶消化和组织块法成功分离培养了睾丸成纤维细胞,鉴定了其细胞类型,并且对其细胞周期与核心组蛋白(H3K9)乙酰化的关系进行了研究。结果表明,该培养体系可以支持上述几种细胞的体外生长。免疫荧光染色鉴定所分离到的细胞为睾丸成纤维细胞。两种同期化方法(血清饥饿和接触抑制)的结果显示:随着血清饥饿时间的延长G0+G1细胞的比例急剧升高后又趋于稳定,2d、4d组与70-80%汇合组差异显着(75.9%,95.9%vs.95.2%,P＜0.05),但2d、4d组差异不显着;细胞随着汇合度的增加G0+G1细胞的比例开始上升,接触抑制两天后基本趋于稳定,2d组、4d和6d组显着高于70-80%汇合组和100%汇合组(97.3%,95.0%,97.4%vs.74.7%,84.2%,P＜0.05)。流式细胞仪分析显示:无论是血清饥饿还是接触抑制处理,G0/G1期供体细胞组蛋白乙酰化水平变化趋势基本相同,基本上是先升高后又降低。2.建立了食蟹猴耳部成纤维细胞的体外培养体系,并探讨其作为猴同种体细胞核移植或异种体细胞核移植供体的可能性。分别使用酶消化和组织块法分离到了食蟹猴耳部成纤维细胞,间接免疫荧光法鉴定了其细胞类型并进行了核型分析。结果表明:该培养体系可以很好地支持该种细胞的体外生长,目前已传代到43代,生长仍旺盛;免疫荧光染色鉴定分离到的细胞为耳部成纤维细胞;对21代的细胞进行核型分析,核型正常。3.本试验的目的是:A.掌握猪卵母细胞成熟过程中第一极体的位置随时间发生偏移的规律,为提高盲吸法去核效率提供依据;B.初步探讨胎儿成纤维细胞和颗粒细胞核移植效率;C.胚胎培养时添加胰岛素对孤雌激活和颗粒核移植胚胎发育率的影响;D.探讨简易融合仪对孤雌激活和体细胞核移植胚胎发育能力的影响。结果表明:在44-46h,有84.7%的极体位置偏移不超过30°,盲吸法的去核率基本与之对应,平均在88.1%,适于在本段时间进行去核。胎儿成纤维细胞、颗粒细胞核移植胚胎的囊胚率分别为9.9%和8.7%。Insulin无论对于颗粒细胞核移植胚胎(8.0%vs.2.4%,P＞0.05),还是孤雌激活胚胎均无显着促进作用(47.3%vs.44.3%,P＞0.05),但孤雌激活胚胎的囊胚显着高于核移植胚胎(47.3%和44.3%vs.8.0%和2.4%,P＜0.05)。简易融合仪下,对于核移植胚胎,场强为200v/mm组的桑椹胚发育率均高于220v/mm组(33.3%,29.6%vs.17.1%,13.8%,P＞0.05);场强一定时,20μs组的桑椹胚率均高于40μs组。随着场强的升高和脉冲时间的延长,桑椹胚发育率呈下降趋势。对于孤雌激活胚胎,20μs组的分裂率和囊胚率均高于40μs组,但差异不显着。;4.对睾丸成纤维细胞进行血清饥饿和接触抑制处理,寻找适宜的同期化方法,同时探讨了高代睾丸成纤维细胞重构胚胎的核重塑的规律,并比较了高代、低代睾丸成纤维细胞和耳部成纤维细胞重构胚胎的发育率。结果显示:接触抑制法处理供体,核移植胚胎融合率显着高于血清饥饿法(68.6%vs.55.3%,P＜0.05),胚胎囊胚率也高于后者(21.1%vs.14.1%;P＞0.05),但差异不显着;重构胚胎激活后3h,供体核的大小基本不发生变化,激活后6h,绝大多数重构胚形成膨大的类原核,到12h时,几乎所有重构胚形成膨大的类原核,并开始观察到重构胚分裂现象;低代睾丸成纤维细胞和耳部成纤维作为供体细胞时,重构胚胎的融合率均显着高于高代睾丸成纤维细胞(84.4%,79.1%vs.69.2%,P＜0.05),前两者的重构胚融合率也差异显着(84.4%vs.79.1%,P＜0.05),低代睾丸成纤维细胞作为供体细胞时重构胚胎的囊胚率显着高于高代睾丸成纤维细胞和耳成纤维细胞(13.9%,8.9%vs.6.4%,P＜0.05)。5.探讨了植物凝集素(PHA)对于化学激活、电激活孤雌激活胚胎和体细胞核移植胚胎发育能力的影响。结果表明:添加适量PHA可以提高化学激活胚胎的囊胚率,10μg/mlPHA可以使囊胚率提高到54.1%;加入量大则有害;添加10μg/ml,20μg/ml的PHA可以显着提高体细胞核移植囊胚发育率(13.0%,5.6%vs.5.0%,P＜0.05),10μg/ml组的囊胚率比对照组提高1倍多。总之,PHA对于化学激活、电激活和体细胞核移植胚胎的作用呈剂量依赖性,适量添加有助于叁种胚胎的发育,过量则有害。6.以胎儿成纤维细胞和新生巴马小型猪睾丸成纤维细胞为供体构建的重构胚胎,利用刺入式胚胎移植法将其分别移入两头巴马小型猪和两头陆川猪的输卵管内。其中两头巴马小型猪和一头陆川猪返情,一头陆川猪怀孕到期,产下一头健康的雄性巴马小型猪。说明新生巴马小型猪睾丸成纤维细胞核移植胚胎可以发育到期。7.采用食蟹猴耳部成纤维细胞作为核供体构建猴-猪异种核移植胚胎,研究其核重编机制并寻找适宜的培养基,初步建立食蟹猴-猪异种核移植体系。结果显示:(1)重构胚胎激活后3h,供体核的大小基本不发生变化,但在激活后6h大部分形成膨大的类原核。(2)食蟹猴-猪异种核移植胚胎融合率为74.2%,有70.5%的重构胚胎发生卵裂,29%的卵裂胚胎发育到桑椹胚阶段。(3)NCSU23+10%FCS和TCM199+10%FCS培养基中,重构胚突破4-细胞阻滞发育到8-细胞以上的比例分别为23.5%和17.0%,NCSU23培养基为19.9%,但是只有在NCSU23+10%FCS和TCM199+10%FCS培养基中重构胚胎可以发育到囊胚阶段(1.4%vs.1.1%,P＞0.05),尽管差异不显着。
郭慧利[8]2009年在《5-氮杂胞苷对猪克隆胚胎体外生产的影响》文中提出尽管体细胞核移植(SCNT)技术已在多种动物上获得克隆后代,但克隆技术仍存在许多问题,有待进一步研究完善。DNA甲基化是哺乳动物表观遗传修饰基因调控表达的主要形式之一,供体核去甲基化不彻底或克隆胚胎过早发生重新甲基化,有可能影响克隆胚胎的正常发育。DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-azaC),是一种胞嘧啶类似物,能与胞嘧啶竞争性结合于DNA甲基化转移酶(DNAmethyltransferase, DNMT)上,通过降低酶的活性来影响基因的表达。本试验主要以猪SCNT胚、体外受精(IVF)胚和孤雌激活胚为研究对象,通过不同方式、不同浓度5-azaC的添加,观察其对供体细胞、SCNT胚、IVF胚及孤雌激活胚发育的影响。结果如下：1、5-氮杂胞苷对核供体细胞的影响以猪卵丘细胞为核供体细胞,在体外培养的卵丘细胞中添加5-azaC,以期通过改变供体细胞的DNA甲基化水平来提高其后在受体胞质中的重编程能力,为提高猪克隆胚体外生产效率探索一条新途径。但是5-azaC对细胞具有一定的毒害作用,且对体外培养的细胞尤为敏感。因此选择合适的作用浓度与作用时间尤为重要。本试验分别选用0、0.01、0.05、0.1和1μM5-azaC处理卵丘细胞72h,通过光学显微镜观察其对卵丘细胞的形态学影响,通过制作生长曲线研究其对卵丘细胞增殖分裂的影响,并通过彗星试验检测其对细胞凋亡的影响。结果发现,1μM以下的低浓度组对细胞的形态以及生长情况无明显影响,而1μM的高剂量组则改变了体外培养的卵丘细胞形态,抑制了细胞的分裂增殖,并且明显增加了凋亡细胞的数目。该结果表明在用5-azaC处理卵丘细胞72h时,应以1μM以下的作用浓度为宜,而使用1μM及以上作用浓度时,其毒性作用可能会使细胞产生明显的变化。2、5-氮杂胞苷对猪体外生产胚胎的影响以猪SCNT胚、IVF胚及孤雌激活胚为研究对象,将5-azaC以不同的作用方式进行处理,研究其对猪不同类型体外生产胚胎体外发育的影响。通过对本实验过程中猪卵母细胞体外成熟、去核效果与重构胚发育情况进行评价,结果发现卵母细胞的体外成熟率可达76.9%,去核率为82.9%。FDA染色检查发现,重构胚存活率可达84.8%,而对4-细胞和8-细胞期克隆胚胎的FDA染色表明,其存活率均为100%。将5-azaC处理72h的卵丘细胞用作核供体经核移植后,观察SCNT胚胎的发育情况。结果发现,与对照组相比,0.01μM组的SCNT胚卵裂率(73.8%对67.1%)略高,但统计学差异不显着；而1μM浓度组的克隆胚后期发育效果明显下降。在早期SCNT胚胎培养液中分别添加0、0.1、1和10μM5-azaC处理48h后发现,与对照组相比,1μM浓度组SCNT胚的卵裂率(71.7%对66.7%),8-细胞发育率(47.8%对44.4%)略高,但差异均不显着(P>0.05)；而10μM5-azaC浓度组胚胎的卵裂率(43.2%对66.7%)、桑椹胚发育率(4.5%对17.8%)均显着下降(P<0.05)。在早期IVF胚培养液中分别添加0、0.1、1和10μM5-azaC处理48h或60h,与对照组相比发现,1μM5-azaC处理48h能明显提高ⅣF胚胎卵裂率(80.0%对60.3%,P<0.05),但桑椹胚发育率未获明显提高(25.0%对23.1%,P>0.05),而10μM浓度组不论是处理48h还是60h,均降低了IVF的后期发育效果。在早期孤雌激活胚培养液中分别添加0、0.1、1和10μM5-azaC处理48h或60h,结果与对照组相比,1μM处理48h和60h均能显着提高其卵裂率(分别为81.8%对62.9%和83.3%对63.3%；P<0.05),但桑椹胚发育率均未获明显提高(30.3%对24.3和29.2%对24.5%；P>0.05),同样10μM5-azaC浓度组降低了胚胎的卵裂率,8-细胞以及桑椹胚发育率。比较同浓度内5-azaC作用不同时间对ⅣF胚及孤雌激活胚的影响,只筛选出对ⅣF胚以及孤雌激活胚发育较好的0.1μM与1μM两组进行比较,结果发现在同浓度内5-azaC作用48h和60h,胚胎的卵裂率,桑椹胚发育率均无明显差异(P>0.05)。由以上结果可以看出,不同浓度的5-azaC作用于卵丘细胞72h或早期SCNT胚48h,均未能提高SCNT胚胎的发育能力,而IVF及孤雌激活胚通过早期培养液添加5-azaC可提高其卵裂率,但桑椹胚发育率也无明显提高,高浓度5-azaC处理均降低了猪SCNT、IVF及孤雌激活胚的发育能力。
李智方[9]2015年在《利用体细胞核移植及嵌合体技术制备荧光蛋白转基因猪的研究》文中提出猪在体型大小、消化代谢和基因组等方面都与人的极为相似,是人类疾病模型和异种器官移植研究的理想动物,转荧光蛋白报告基因的工具猪在异种移植、嵌合体和医学领域具有重要的应用价值。本研究利用转基因技术、体细胞核移植技术和嵌合体技术,进行构建绿色荧光蛋白示踪的工具猪及嵌合体猪的研究。1、构建α-1,3半乳糖基转移酶敲除(GTKO)小型猪(巴马、五指山)原代耳成纤维细胞系,利用脂质体或电转染技术转染细胞系,G418筛选获得了可用于后续试验的绿色荧光蛋白(EGFP)和橘红色荧光蛋白(huKO)阳性细胞。2、EGFP阳性克隆点细胞为核供体进行体细胞核移植和胚胎移植,移植559枚胚胎到3头受体母猪,1头母猪分娩产出2个EGFP阳性克隆猪。采样心、肝、脾、肺、肾、胰腺、肠、胃、舌、大脑、小脑、脊髓和骨骼肌肉等13种组织进行石蜡切片观察、Western和实时定量PCR分析,结果显示EGFP为全身性表达,但是在肝脏、大脑、小脑和脊髓中的表达较弱。3、显微注射iPS细胞构建嵌合体胚胎,胚胎移植进行体内验证iPS细胞的全能性。共计移植602枚嵌合胚,获得9个胎儿(其中1-5#进行PCR检测)。通过小动物活体和体式荧光观测未发现有EGFP表达；PCR检测显示1#胎儿头部和2#胎儿胎盘检测到EGFP基因。4、通过注射和聚合法进行嵌合体猪的研究,共移植了436枚胚胎；但是未获得嵌合体胎儿。总之,本研究利用体细胞核移植技术成功获得了GFP广泛表达的GTKO猪,建立了制备嵌合体猪的平台。
纪慧丽[10]2016年在《核移植胚胎聚合法制备嵌合体猪》文中认为猪,尤其是小型猪在体型大小、消化代谢和基因组等方面都与人的极为相似,是人类疾病模型和异种器官移植研究的首选动物；通过胚胎补偿的方法制作嵌合体,是在猪体内长出人源化器官研究的重要技术手段。体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)是目前获得转基因个体的重要技术手段,本研究利用Primo Vision Time-Lapse时差分析系统观察猪体细胞核移植胚胎的体外发育,选择合适时期的胚胎进行聚合制备嵌合体小型猪的研究。1、利用Primo Vision Time-Lapse时差分析系统观察猪SCNT胚胎的体外发育,统计克隆胚胎与孤雌胚胎早期发育的卵裂时间及发育到囊胚期的时间,并比较微孔培养与微滴培养体系SCNT胚胎的发育。结果显示克隆胚胎2-、4-、8-、16-细胞的卵裂时间分别为18.5+3.5 h、35±4 h、67.5±3.5 h、80±4.5 h,与孤雌胚胎的卵裂时间没有显着性差异,而克隆胚胎发育到囊胚期的时间显着延长(108±8 h vs.96±6 h)；微孔与微滴培养体系的克隆胚胎不同时期的卵裂率逐渐下降,两种体系之间没有显着性差异,但微滴培养的囊胚率显着高于微孔胚胎体系(26.9%vs.16.7%)。2、比较不同时期SCNT胚胎聚合制作嵌合体效率,发现SCNT胚胎中4-8细胞胚胎的获得率为49.5%(657/1326),8-16细胞胚胎的获得率只有33.9%(499/1474),4-8细胞胚胎的聚合效率显着高于8-16细胞胚胎的聚合效率(23.9%vs.20.0%),而4-8细胞胚胎聚合获得囊胚及嵌合囊胚效率与8-16细胞的聚合效率没有显着差异(54.1%vs.56.O%；38.8%vs.37.5%),因此,选择4-8细胞期胚胎制备嵌合体猪。分别以表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的雄性五指山猪WPF19和雌性五指山猪1220耳成纤维细胞,以及雌性巴马小型猪BMM2耳成纤维细胞为供核细胞进行SCNT,胚胎发育至4-8细胞阶段时,两种胚胎以2：2比例进行聚合,772枚聚合胚胎有391枚发育至囊胚(50.6%),387枚囊胚移植到5头受体母猪,4头怀孕并到妊娠终期,获得2头具有明显毛色嵌合的小型猪。通过荧光及微卫星分析,死亡小猪的皮肤、心脏和肾脏存在嵌合特征。
参考文献：
[1]. 猪体细胞核移植研究[D]. 胡军和. 西北农林科技大学. 2005
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