柏亚铎[1]2005年在《犬瘟热病毒、犬冠状病毒入侵宿主细胞机制研究》文中进行了进一步梳理病毒囊膜与宿主细胞膜的融合是囊膜病毒入侵宿主细胞的关键步骤。其过程涉及病毒囊膜表面蛋白与宿主细胞膜表面蛋白的构象变化和相互作用。对反转录病毒、纤丝病毒、正粘病毒和副粘病毒等的研究表明,其囊膜表面融合蛋白的七肽重复区HR1和HR2相互作用形成六螺旋束是引发膜融合的关键。其中,副粘病毒六螺旋束结构已经很清楚,但其它相关区域的功能还没有定论。对SARS冠状病毒和鼠肝炎冠状病毒(MHV)的研究表明冠状病毒也可能采用与其它囊膜病毒类似的膜融合机制。此外,副粘病毒膜融合过程中,融合蛋白的融合肽(FP)、HR3等区域被证明与融合蛋白的构象变化有关。本论文对副粘病毒科的犬瘟热病毒和冠状病毒科的犬冠状病毒膜融合机制进行了初步研究。采用搭桥PCR的方法扩增了犬瘟热病毒HR1、HR2、HR3和FP基因及犬冠状病毒HR1和HR2基因,分别克隆到pGEX-6p-Ⅰ表达载体中,用GST融合表达系统在大肠杆菌中获得了大量融合表达蛋白,将融合蛋白用GST-3C蛋白酶酶切并纯化,然后对其进行一系列蛋白质结构与功能学研究。圆二色谱及分子筛实验结果表明犬瘟热病毒和犬冠状病毒的HR1和HR2蛋白都能形成稳定的富含α螺旋的三聚体结构,说明犬瘟热病毒和犬冠状病毒与副粘病毒科和冠状病毒科其它成员采用相似的膜融合机制。犬冠状病毒在七肽重复区有14个氨基酸插入,不同于SARS-Cov和MHV,但不影响其形成六螺旋束结构的功能。在病毒合胞体抑制实验中,加入体外表达的犬瘟热病毒HR2蛋白后,能有效的抑制犬瘟热病毒在Vero细胞上产生的合胞体病变,而加入体外表达的犬瘟热病毒HR1蛋白后,则不能抑制犬瘟热病毒在Vero细胞上产生的合胞体病变;首次证明体外表达的犬瘟热病毒HR2蛋白能特异性地抑制犬瘟热病毒入侵宿主细胞,而犬瘟热病毒HR1蛋白则没有这种抑制活性。交叉抑制实验表明,犬瘟热病毒重组HR1和HR2蛋白不能抑制同属的麻疹病毒对Vero细胞的入侵。利用ExPASy系列生物学软件对犬瘟热病毒融合肽(FP)和叁个七肽重复区的功能域分析表明FP和HR3都有较明显的疏水趋势,HR1与HR2既有亲水区又有疏水区。圆二色谱分析表明FP富含α螺旋,HR3呈无规则卷曲,蛋白体外结合实验表明,HR1与HR2区域都可以与HR3区域结合,不能与FP区域结合。病毒合胞体抑制实验表明,体外表达的犬瘟热病毒HR3蛋白能特异性地抑制犬瘟热病毒入侵宿主细胞,而体外表达的犬瘟热病毒FP蛋白则没有抑制活性。
王晓佳[2]2004年在《副粘病毒入侵宿主细胞的机制研究》文中认为囊膜病毒与宿主细胞的膜融合是病毒入侵宿主细胞的第一步，这一过程涉及到病毒囊膜表面蛋白质与宿主细胞表面受体蛋白质(或唾液酸)之间的相互作用和构象变化。本论文研究了仙台病毒和禽副粘病毒-2这两种副粘病毒入侵宿主细胞过程中病毒囊膜表面相关蛋白质的相互作用。副粘病毒囊膜中与融合功能有关的糖蛋白有两种，即血凝素神经氨酸酶(HN)和融合糖蛋白(F)，其中F蛋白有两段七肽重复区域(heptad repeat, HR)，分别称为七肽重复区域1(HR1)与七肽重复区域2(HR2)。人免疫缺陷病毒(HIV)的研究已经证明，这两段多肽(HR1、HR2)相互结合形成六螺旋束(或称发夹叁聚体)结构从而引发膜融合。本研究通过体外表达HR多肽和体外实验，经分子筛及圆二色谱实验证明，仙台病毒F蛋白的七肽重复区(HR1-linker-HR2)可形成稳定的六螺旋束结构，热变性温度为95℃，首次获得了该聚合体的蛋白结晶，该晶体在pH2.5、0.1M柠檬酸环境下生成，X-光衍射解析结果确证其形成的结构是典型的六螺旋束(发夹叁聚体)结构。采用病毒合胞体形成抑制实验研究首次证明，体外表达的禽副粘病毒-2HR2多肽能特异性地高效抑制病毒与宿主细胞膜的融合，且与禽副粘病毒-1(即新城疫病毒)没有交叉抑制活性，而体外表达的禽副粘病毒-2 HR1则没有这种抑制活性：用分子筛结合蛋白电泳及圆二色谱实验首次证明，禽副粘病毒-2的HR1和HR2可相互结合形成稳定的六螺旋束结构，其热变性温度大于90℃。采用NNPREDICT和DNASTAR蛋白质结构预测软件对副粘病毒-2两种糖蛋白(HN、F)的结合功能域分析表明，F蛋白HR2多肽亲水区占其主要部分，F蛋白HR1与HN蛋白“球状头部”区域既含有疏水区也含有亲水区，HR1多肽富含α-螺旋结构，HR2多肽与HN蛋白的“球状头部”区域则有形成β-折迭结构的趋势：蛋白质体外结合实验证明，HR2和HR1都可以与HN的“球状头部”区域结合。
陈志杰[3]2017年在《小反刍兽疫病毒N75-1株入侵宿主细胞的途径研究》文中指出小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的感染小反刍兽的一类动物传染病。近年来,PPRV的研究大多集中在蛋白功能以及疫苗制备等方面,有关PPRV入侵宿主细胞的途径研究少有报道。本试验目的在于探究PPRV对山羊子宫内膜上皮细胞(Goat endometrial epithelial cells,EEC)的感染特性,以及病毒进入宿主细胞的内吞途径,从而为研究该病毒对宿主细胞的感染机制提供相关的理论基础及科学依据。研究结果如下:1.获得了PPRV在山羊子宫内膜上皮细胞上的增殖规律。PPRV接种于EEC细胞后24 h到48 h后细胞无明显的形态学变化,72h发现细胞发生典型的细胞病变(cytopathic effect,CPE),细胞聚集在一起,形成合胞体,折光性变强等,96 h后细胞出现裂解、死亡现象。EEC接种PPRV N75-1株后,激光共聚焦观察确定该病毒进入细胞的时间在1-2 h内。收取1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h的细胞上清,TCID50检测发现病毒滴度在感染后24 h达到最高;收取0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h的细胞样品,Western Blot检测表明N蛋白的表达在感染后12 h表达量最大,24h有所下降,获得了PPRV在EEC细胞上的增殖规律。2.PPRV入侵EEC不通过网格蛋白介导的内吞途径。用内吞途径的网格蛋白抑制剂氯丙嗪(CPZ)处理EEC,接毒后激光共聚焦显微镜观察进入细胞的PPRV与对照组相比无明显差异;Western Blot以及TCID50检测发现N蛋白的表达和毒价亦无明显变化。将网格蛋白的的siRNA转染EEC中,接毒后Western Blot以及TCID50检测N蛋白的表达以及PPRV毒价亦无明显变化。实验结果表明,PPRV入侵EEC不通过网格蛋白介导的内吞途径。3.PPRV入侵EEC是通过Caveola介导的内吞途径。用膜穴样凹陷内吞途径抑制剂甲基-β-环糊精(MβCD)和制霉素(Nystatin)两种药物处理EEC,接种PPRV后激光共聚焦显微镜观察到进入细胞的病毒相对于对照组明显减少。Western Blot检测发现,药物处理组PPRV-N蛋白表达与对照相比均显着减少。将Caveolin-1的siRNA转染EEC后接种PPRV,Western Blot以及TCID50检测发现N蛋白表达和病毒滴度明显降低。实验结果表明,PPRV入侵EEC是通过Caveola介导的内吞途径。综上所述,本研究通过特异性化学抑制剂阻断、siRNA干扰方法确定,PPRV入侵EEC是依赖膜穴样凹陷介导的内吞途径。研究结果为了解PPRV的致病机制和寻找新的药物治疗靶点提供理论依据。
宋战昀, 韩文瑜, 丁壮[4]2006年在《禽副粘病毒囊膜蛋白研究进展》文中研究表明囊膜病毒与宿主细胞的膜融合是病毒入侵宿主细胞的第一步,禽副粘病毒囊膜表面糖蛋白有2种,与宿主受体结合的血凝素神经氨酸酶(HN)及介导膜融合的融合糖蛋白(F)。这两种囊膜蛋白在禽副粘病毒融合及与靶细胞受体配体结合中发挥重要作用,本文针对禽副粘病毒与其受体配体相关及病毒融合相关的囊膜蛋白进行了综述。
谢文艳[5]2016年在《人副流感病毒3型融合蛋白连接区对膜融合功能的影响及机制研究》文中研究说明背景：人副流感病毒3型(human parainfluenza virus 3, HPIV3)是一种含有不分节段的单股负链RNA基因组的包膜病毒,为副粘病毒科(paramyxoviridae)副粘病毒属(paramyxovirus)的家族成员之一。在全球范围内,HPIV3主要引起5岁以下婴幼儿的上下呼吸道感染,例如肺炎、细支气管炎、喉炎等。当前仍没有安全有效的疫苗和抗病毒药物来预防和治疗该病毒引起的感染,而开发疫苗和药物的主要障碍在于对该病毒感染宿主细胞的机制还不清楚,因此必须进一步弄清HPIV3的致病机制。HPIV3入侵宿主细胞的先决条件为病毒包膜和宿主细胞膜的融合,同时细胞膜之间的融合也是HPIV3入侵宿主细胞的典型病理特征,该过程主要是通过同源性血凝素-神经氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase, HN)蛋白协助,由融合(fusion, F)蛋白介导完成的。F蛋白为型病毒糖蛋白,最初合成的是非活化的蛋白前体F0,经过加工修饰后被宿主细胞蛋白酶裂解为二硫键连接的F1和F2。研究表明F蛋白上的多个结构域对膜融合活性有重要作用。其中融合肽(fusion peptide, FP)能够插入宿主细胞膜中从而启动膜融合过程；两个疏水性的七重复基元(heptad repeat motif,HR),即HRA和HRB,具有很强的亲和力,能够在膜融合过程中形成稳定的6-螺旋束(six-helical bundle,6HB)促进病毒包膜和靶细胞膜的融合；而跨膜区(transmembrane region, TM)为形成融合小孔所必须。在HRA和HRB之间有大约250个氨基酸(amino acid, aa),主要包括叁个结构域(DⅠ-DⅢ)和两个连接区(DⅠ-DⅡ连接区和HRB连接区)。DⅠ-DⅡ连接区(369aa-374aa)连接结构域DⅠ和DⅡ,HRB连接区连接结构域DⅡ和HRB。当前只有HPIV3 F蛋白融后合构象的X-射线晶体结构是已知的,且HRA、HRB、结构域DⅠ-DⅢ和两个连接区均可在该结构上观察到。到目前为止,虽然已有F蛋白的多个结构域对膜融合活性影响的报道,但DⅠ-DⅡ连接区对膜融合活性的影响还未有报道。目的：确定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区对膜融合活性的影响,探讨DⅠ-DⅡ连接区影响膜融合功能的机制,以期为研究安全有效的疫苗和抗病毒药物提供线索。方法：1.采用蛋白同源建模的方法在SWISS-MODEL软件上以PIV5(parainfluenza virus 5, PIV5) F蛋白融合前构象的晶体结构(PDB ID:4GIP)为模板得到HPIV3 F蛋白的融合前构象的模型,以确定DⅠ-DⅡ连接区在融合前构象上的位置。2.采用定点突变和体内同源重组相结合的方法构建出该区域(369aa-374aa)的九个单氨基酸突变体,测序确定构建成功后将它们在真核瞬时表达系统内进行蛋白表达。3.采用叁种不同类型的膜融合试验,即吉姆萨染色法,指示基因法,染料转移法,定性和定量检测各突变体蛋白对膜融合功能的影响。4.采用流式细胞术来检测各突变体F蛋白在细胞表面的表达效率。5.采用免疫共沉淀试验来检测各突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白在细胞表面的相互作用能力。6.采用SPSS 17.0软件进行数据处理,应用Student's t-检验对突变体和野生型F蛋白的实验数据进行分析比较,P<0.05被认为差别具有统计学意义。结果：1.成功构建出HPIV3 F蛋白融合前构象的同源结构模型,通过氨基酸序列比对确定了HPIV3 F蛋白融合后构象的DⅠ-DⅡ连接区(369-374aa)在它的融合前构象中仍然扮演DⅠ-DⅡ连接区的角色。HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区的9个单氨基酸突变体(K369A、K369E、S370A、D371A、I372A、V373A、V373T、P374A和P374T)均构建成功。2.各突变体F蛋白在膜融合过程的所有阶段均表现出降低的膜融合活性。与野生型蛋白相比,突变体F蛋白形成的合胞体不仅数目减少而且面积也较小,其中K369E、S370A、V373A、V373T和P374T突变体几乎丧失了形成合胞体的能力,仅为野生型的5%以下,内容物混合的能力也极度降低,分别为野生型的18.0%、17.3%、 16.4%、18.9%和15.4%,同时它们的半融合活性也大幅度降低,半融合的速率和程度均低于野生型水平的15%；而剩下的4个突变体(K369A、D371A、I372A和P374A)虽具有合胞体形成能力,但均低于野生型水平,其中K369A和D371A突变体内容物混合的能力均约为野生型的66.7%,半融合的速率和程度约为野生型水平的五分之四(82.2%、82.0%)和四分之叁(74.5%、75.2%),而1372A和P374A突变体内容物混合的能力分别为野生型的水平的57.6%和54.5%,半融合的速率分别降低到野生型水平的58.5%和51.8%,半融合的程度分别降低为野生型的62.6%和60.6%。3.DⅠ-DⅡ连接区的突变对F蛋白在细胞表面的表达水平无影响。各突变体F蛋白在细胞表面的表达水平均处于野生型F蛋白的93.1%-105.9%之间,与野生型相比差别无统计学意义(P>0.05)。4.DⅠ-DⅡ连接区的各突变体与HPIV3 HN蛋白在细胞表面的相互作用能力均降低,其中K369E、V373A、V373T和P374T这4个突变体几乎丧失了与HN蛋白相互作用的能力,均低于野生型水平的10%；S370A突变体与HN蛋白相互作用的能力约为野生型的五分之一；K369A、D371A、I372A和P374A突变体与HN蛋白相互作用的能力分别为野生型的41.4%、66.0%、26.9%和15.2%。结论：HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区对膜融合功能有重要影响,且各氨基酸残基对膜融合活性影响的程度不同。膜融合活性的降低可能是由于突变导致各突变体F蛋白与同源性HN蛋白在细胞表面的相互作用能力降低所致。背景：HPIV3入侵宿主细胞是通过病毒包膜和靶细胞膜的融合来实现的,该过程能将单负链不分节段的RNA基因组导入宿主细胞质内,是病毒完成生命周期的关键步骤。HPIV3包膜上有两种与膜融合相关的糖蛋白,即HN蛋白和F蛋白,两者协同完成了该过程。HN蛋白负责介导病毒与靶细胞表面的吸附,而F蛋白则直接介导膜融合过程。在F蛋白HRA和HRB之间有一段过渡性的区域,主要包含叁个结构域DⅠ,DⅡ和DⅢ,它们通过连接区相连。DⅠ和DⅡ结构域由DⅠ-DⅡ连接区(369aa-374aa)连接；DⅡ和HRB结构域由HRB连接区连接；D1和D3结构域直接相连,两者之间并没有氨基酸序列连接,所以我们定义为“伪连接区”,对该区域的氨基酸进行序列比对后发现其含有亮氨酸拉链类似结构。亮氨酸拉链类似结构是一种特殊的类七重复基元结构,最显着的特征是亮氨酸或异亮氨酸总是有规律地每隔6个氨基酸就出现一次,将该氨基酸序列用假想的α螺旋轮展示时,第“a”位的全部氨基酸残基和第“d”位的大部分氨基酸残基均为非极性氨基酸。对叁种不同副粘病毒融合蛋白亮氨酸拉链类似结构的研究表明该基序对膜融合活性有重要影响。然而位于HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区的亮氨酸拉链类似结构对膜融合活性的影响尚未见报道。目的：确定HPIV3F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区亮氨酸拉链类似结构对膜融合活性的影响,寻找亮氨酸拉链类似结构干扰膜融合功能的机制。方法：采用PCR定点突变和体内同源重组相结合的方法将该区域的亮氨酸和其它保守氨基酸(L257、V264、L271、L278、L285、Q292和I299)分别突变为丙氨酸,同时将中间的叁个高度保守的亮氨酸(L271、L278和L285)进行了联合突变,应用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬时表达系统于BHK-21细胞内进行蛋白表达,之后采用合胞体形成试验、内容物混合试验、R18探针试验,半融合动力学试验检测突变对膜融合功能的影响；采用流式细胞术检测各突变体F蛋白在细胞表面的表达水平；采用免疫共沉淀试验来检测突变对HN蛋白和F蛋白在细胞表面的相互作用能力的影响。采用SPSS 17.0软件进行数据处理,应用Student's t-检验对突变体和野生型F蛋白的实验数据进行分析比较,P<0.05被认为差别具有统计学意义。结果：1.应用PCR单点突变和联合突变的方法成功构建出了HPIV3F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区亮氨酸拉链类似结构的7个单点突变体(L257A、V264A、L271A、 L278A、L285A、Q292A和I299A)、3个二联突变体(L271A-L278A、L271A-L285A和L278A-L285A)和1个叁联突变体(L271A-L278A-L285A)。2.各突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白共表达时,在膜融合过程的所有阶段均表现出降低甚至消失的膜融合活性。与野生型相比,突变体蛋白形成的合胞体不仅数量减少而且面积也较小,3个单点突变体(L257A、L271A和I299A)和3个二联突变体的合胞体形成能力极度降低,低于野生型水平的6.0%,内容物混合的能力只有野生型水平的16.0%以下,且只观察到极少量的半融合事件,半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5%；而V264A、L285A和Q292A这3个突变体的合胞体形成能力略微降低,分别为野生型水平的64.7%、69.1%和68.5%,内容物混合的能力仍维持在野生型水平的85%左右,介导半融合能力轻微降低,半融合的速率分别为野生型的88.8%、87.6%和85.0%,半融合的程度分别为野生型的85.5%、87.2%和83.1%；此外,L278A突变体的合胞体形成能力约为野生型水平的38.1%,内容物混合的能力只有野生型的一半,半融合的速率和程度分别为野生型水平的52.8%和60.6%；剩下的叁联突变体丧失了合胞体形成能力,内容物混合能力仅为野生型的2.2%,也没有观察到半融合事件的发生,半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5%。3.HPIV3 F蛋白亮氨酸拉链类似结构的各丙氨酸取代株在细胞表面的蛋白表达水平均与野生型近似,差别无统计学意义(P>0.05)。4.所有的突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白在细胞表面的相互作用能力均降低,其中叁联突变体没有检测到与HN蛋白的相互作用；3个二联突变体与HN蛋白的相互作用能力约为野生型的一半；L257A.L271A和I299A突变体与HN蛋白的相互作用能力低于野生型水平的30%:V264A.L278A.L285A和Q292A突变体与HN蛋白的相互作用能力分别为野生型水平的63.3%、65.1%、64.3%和66.7%。结论：HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区的亮氨酸拉链类似结构对膜融合活性有重要影响；其中叁联突变体对膜融合活性的影响最大；该结构的完整性是完成膜融合过程必不可少的。背景：HPIV3F蛋白属于Ⅰ型病毒膜融合蛋白,通常先合成非活化的前体蛋白F0,然后在宿主细胞蛋白水解酶的作用下裂解为二硫键连接的F1和F2。已有研究表明F1亚单位上的FP、HRA和HRB能够在细胞融合过程中发挥重要作用。值得注意的是,Yin等发现在副流感病毒5型(parainfluenza virus 5, PFIV5) F蛋白融合前构象的X射线晶体结构中HRB的N-端有一段电子密度较弱的区域,即HRB连接区。对新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) F蛋白HRB连接区的第454位谷氨酰胺(glutamine, Q)进行氨基酸突变分析后发现其对膜融合活性有重要影响。Russell等在猴病毒5型(Simian virus 5, SV5) F蛋白HRB的N-端靠近HRB结构域的连接区内构建突变体发现第447位亮氨酸(leucine, L)和第449位异亮氨酸(isoleucine, I)是影响F蛋白融合功能和形成六螺旋束(6HB)的关键氨基酸,提示HRB连接区域可能具有类似“开关”F蛋白构象折迭的作用；目前对HPIV3F蛋白HRB连接区对膜融合功能的影响尚不清楚。目的：确定HPIV3F蛋白HRB连接区对膜融合功能的影响,探讨该区域影响膜融合功能的机制。方法：采用定点突变和体内同源重组相结合的方法将HRB连接区内的T429、E432、1443和N446位氨基酸进行单点突变,应用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬时表达系统于BHK-21细胞内进行蛋白表达,之后采用吉姆萨染色法、指示基因法、染料转移法检测突变对膜融合活性的影响；采用SPSS17.0软件进行数据处理,应用Student's t-检验对突变体和野生型F蛋白的实验数据进行分析比较,P<0.05被认为差别具有统计学意义。结果：1.成功构建了HRB连接区的6个突变体T429A、T429L、E432A、I443A、N446A和N446S。2.各突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白共表达时,膜融合活性表现为两种类型。T429A、T429L和N446A这3个突变体形成的合胞体不仅个数少,而且面积也比较小,内容物混合的能力也降低,只有野生型水平的36.6%、42.3%和15.2%,同时半融合活性只有野生型水平的34.8%、42.7%和12.4%；而E432A、I443A和N446S这3个突变体的膜融合活性均比野生型略增强,分别相当于野生型的109.4%、113.2%和118.6%,但半融合活性差别无统计学意义。结论：HPIV3 F蛋白HRB连接区内的氨基酸突变对细胞融合活性有重要影响,其中N446为关键氨基酸位点。
曲昱蓉[6]2014年在《泛素—蛋白酶体系统对新城疫病毒复制的影响》文中进行了进一步梳理新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是副黏病毒科、禽腮腺炎病毒属的唯一成员,可以导致家禽养殖业巨大的损失。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system, UPS)是真核生物中主要的蛋白质降解途径,参与多种细胞功能调控。近年来关于UPS参与病毒感染各个过程的分子机制逐渐成为研究热点。为了确定泛素-蛋白酶体系统在NDV感染中的作用,本文开展了一些列试验研究。一、新城疫病毒对宿主细胞泛素化蛋白和26S蛋白酶体活性的影响本研究使用针对泛素的抗体以检测NDV感染对DF1和HeLa细胞内泛素化蛋白的影响,发现NDV对DF1细胞内泛素化蛋白水平的影响不明显,但可以使HeLa细胞内泛素化蛋白水平逐渐降低。之后又比较了相同感染条件下,两种细胞26S蛋白酶体活性的变化,发现与正常未感染细胞中的26S蛋白酶体活性相比,NDV可以引起DF1细胞内26S蛋白酶体叁种活性位点活性都升高,在HeLa细胞中26S蛋白酶体活性升高的程度更加显着。二、泛素-蛋白酶体系统相关抑制剂对新城疫病毒复制的影响本研究首先选取叁种蛋白酶体抑制剂MG-132、Bortezomib、Lactacystin和一种泛素活化酶抑制剂PYR-41用以研究对NDV增殖的影响。通过WST-1法确定每种抑制剂的工作浓度,再通过抑制剂的添加验证NDV感染细胞时是否需要利用UPS。结果显示四种蛋白酶体抑制剂都可以不同程度抑制NDV在DF1和HeLa细胞上的增殖。初步表明泛素-蛋白酶体系UPS参与NDV复制。进一步通过在NDV感染不同阶段加入MG-132,结合使用蛋白酶K试验以确定UPS参与到NDV感染的阶段。阶段性加入试验结果显示UPS参与到新城疫感染的早期阶段,蛋白酶K试验结果显示该系统并未参与到NDV入侵细胞的阶段而是入侵细胞之后复制的早期阶段。最后通过蔗糖密度梯度离心试验分离细胞内体,并通过绝对荧光定量法比较MG-132处理的细胞内体中病毒含量与正常细胞中的差异,发现使用抑制剂处理的细胞在内体所在层中病毒含量较高,据此我们推测蛋白酶体抑制剂有可能使NDV滞留于细胞内体中。本试验首次证明泛素-蛋白酶体系统参与到NDV感染的过程中,并确定并未参与新城疫病毒入侵细胞的过程而是进入细胞后早期复制的过程。这一研究结果将加深对病毒与宿主细胞互作过程的认识,将对发现新型抗NDV病毒药物起一定作用。
张轶岭[7]2014年在《BmCPV受体蛋白的筛选鉴定及家蚕翅原基发育的分子机制研究》文中提出家蚕细胞质型多角体病毒(BmCPV)感染家蚕中肠细胞，从而导致家蚕发生中肠型脓病。为了查明BmCPV的受体，探讨BmCPV入侵家蚕细胞的分子机制，本研究用抗BmCPV病毒粒子、结构蛋白VP7和病毒基因组S1节段编码的sORF抗体，综合采用Co-IP、VOPBA、pull-down等3种常用的病毒受体筛选方法以及PVDF膜上蛋白相互作用的方法，筛选了与BmCPV相互作用的中肠组织细胞(膜)蛋白，通过质谱鉴定结合生物信息学分析，初步筛选出10种候选受体蛋白，分别是受体型鸟苷酸环化酶(Receptor type guanylyl cyclase, Gcy)，阿片结合蛋白(opioid-bindingprotein, OBP)，衔接蛋白(Adaptor protein, AP)，BMKETTIN(BMKT)，钙网蛋白(Calreticulin, CRT)，网格蛋白(Clathrin, CLAT)，核输入蛋白(Importin alpha, IPOA)，整合素β (Integrin beta, ITGB)，酪氨酸蛋白激酶(tyrosine-protein kinase Src64B-like,BmSRC)，激活蛋白激酶受体(Receptor for activated protein kinaseC, RACK)。BmCPV特异性地感染家蚕中肠组织，受体基因组织特异性表达可能与病毒组织特异性感染有关。因此，本研究调查了筛选出的10种候选受体蛋白基因在5龄家蚕不同组织中的表达。结果显示：选取的10个基因在家蚕5龄幼虫各组织中均有表达，不同组织中的基因表达水平存在较大差异，而且不同的受体候选基因在同一组织中的表达水平也不尽相同，其中OBP基因在中肠组织中特异性高水平表达，推测BmCPV感染组织特异性不仅受受体组织特异性影响，也受到其他一些因素的作用。为进一步鉴定BmCPV候选受体蛋白基因的功能，本研究根据每个基因的序列分别设计、合成了3种序列特异性siRNA，在家蚕BmN培养细胞和家蚕个体水平研究了沉默候选受体基因对BmCPV水平的影响，结果显示：在BmN培养细胞中，通过转染siRNA沉默AP、CRT、CLAT、ITGB和RACK基因后，BmCPV VP1基因的相对表达水平与对照相比均下调90%以上；在家蚕幼虫中，通过注射siRNA抑制BMKT、CLAT、IPOA、ITGB和BmSRC基因表达，感染BmCPV48h后，BmCPVVP1基因的表达水平与对照相比均下调90%以上。由此推测上述基因的编码产物可能为BmCPV受体复合物的成员之一，在BmCPV入侵过程中承担重要作用。为了进一步鉴定候选受体，构建了AP、CLAT、ITGB和RACK候选受体基因原核表达重组载体，用诱导表达的重组蛋白，分别制备了多克隆小鼠抗体；抗体封闭实验结果显示，在BmN培养细胞中，相对于对照组，100μg/mL和300μg/mL浓度的抗候选受体蛋白抗体，均能使BmCPV VP1基因的相对表达水平显着下调，进一步证实了上述4种候选受体蛋白为BmCPV受体复合物的成员之一的可能性。翅原基是研究昆虫器官发育的模式器官。为了探讨家蚕器官发育的调节机制，本研究通过比较蛋白组学和比较转录组学的方法，同时开展了家蚕翅原基发育的分子调控研究。采用shotgun蛋白组学研究和MS测序的方法测定了家蚕幼虫，蛹和成虫期翅原基的蛋白组；分别从家蚕幼虫、蛹和成虫叁个时期的翅原基或翅中鉴定出241、218和223种蛋白，其中139个为叁个时期共表达蛋白。此外，在这叁个时期还分别有55、37和43个特异表达的蛋白。对叁个时期鉴定出来的蛋白进行的基因本体(GO)富集分析表明它们可能参与了细胞组分，分子功能和生物过程等几大功能类。通过对叁个时期翅原基鉴定出来的蛋白表达异同的分析，进一步加深了我们对家蚕翅原基发育的分子调控的理解。为了进一步了解家蚕翅原基生长、发育的分子机制，对家蚕幼虫(5龄第5天)和蛹(化蛹第7天)翅原基及成虫期(羽化第1天)的翅进行了RNA-Seq测序分析。对原始数据去除低值序列后的的叁个不同发育时期的clean data分别为35973346、41374988和37243758个reads，每个reads的平均长度为89.25bp，数据有效率为72.14%。叁个不同发育时期的表达基因数量分别为11563、11414和11642个。GO富集(P≤0.05)分析显示，与幼虫期相比，蛹期、蛾期上(下)调表达基因主要富集在229(220)、251(225)个GO term上；与蛹期相比，蛾期上(下)调表达基因主要富集在238(198) GO term上。差异基因KEGG富集(P≤0.05)分析结果显示，与幼虫期的翅原基相比，蛹期、蛾期上(下)调基因主要富集在72(34)、94(35)个KEGG通路上(P≤0.05)；与蛹期相比，蛾期上(下)调表达基因主要富集在113(24) KEGG通路上。RNA-seq结果中随机选取9个基因，用qRT-PCR检测其在家蚕幼虫，蛹和成虫翅原基中的相对表达水平，结果显示，被测基因差异变化倍数与RNA-Seq数据结果略有差异，但总体的趋势一致，表明本次高通量测序结果是可靠的。以上研究结果为进一步揭示家蚕翅原基生长发育的分子机制提供了新的线索。
田志革[8]2015年在《野生水禽副粘病毒的分离鉴定及Ⅴ蛋白对抗宿主细胞先天免疫机制的研究》文中提出新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种烈性传染病,发病急,感染率和死亡率高(有时高达100%),它主要危害禽类。该病分布广泛,对养殖业危害极大。针对新城疫病毒的分子流行病学研究主要集中于家禽和水禽,而作为新城疫病毒的天然宿主,野生鸟类在病毒传播过程中所起到的作用并未引起足够的重视。野生鸟类作为许多病原携带者和自然宿主,可潜在传播人和动物的重要传染病。随着候鸟的迁徙,携带某些病毒的候鸟可能会将病毒传播到不同的地方而导致疾病的爆发和流行。因此,对野生鸟类进行常见病原的分子流行病学监测,具有重要的指示意义。为研究野生鸟类感染或携带新城疫病毒的情况,本研究对2011年10月至2013年5月期间收集自吉林省向海自然保护区的野生鸟类粪便拭子共计1002份,进行新城疫病毒的分子流行病学调查。一方面调查新城疫病毒的携带情况,进行病毒的分离与鉴定,并选取有代表性的毒株进行基因克隆和序列的分子遗传特征分析；另一方面,首次分离到6型禽副粘病毒(avian paramyxo virus virus type 6,APMV6),并对其进行全基因组测序。1、野生鸟类粪便拭子的PCR检测将粪便拭子按常规方法无菌处理后,接种SPF鸡胚,72h后收集尿囊液,提取尿囊液中的病毒RNA,用特异性的检测新城疫病毒和禽副粘病毒的PCR方法进行初步检测。实验结果表明野鸟存在NDV以及APMV6的感染。所有野生鸟类样品的NDV PCR阳性检出率为4.19%,APMV6 PCR阳性检出率为0.2%。野生鸟类新城疫病毒携带情况不具明显的季节性,不同年份野鸟的NDV检出率有一定差别,其中2011年NDV阳性检出率最高,为14.02%。2、野鸟源NDV的分离鉴定及F基因遗传演化分析将用NDV PCR检测引物初筛为阳性的尿囊液经适当处理后接种鸡胚成纤维细胞(CEF)培养增殖,进行蚀斑纯化。经特异性PCR、血凝试验及血凝抑制试验鉴定,确定共分离到42株野鸟源NDV。对42株病毒的毒力基因F基因进行部分克隆和序列测定,与GenBank上已发表的NDV参考株进行序列比对和分析。测序结果显示42株分离株均为弱毒株,其中3株属于class Ⅰ genotype2,另外39株属于class Ⅱ genotype Ⅰ。序列分析结果显示：3个class Ⅰ分离株F基因核苷酸序列相似性为97.5%-98.9%；核苷酸遗传进化分析表明,这3株野鸟源NDV分离株与南方家禽分离株亲缘关系较近。39株classⅡ分离株F基因核苷酸序列相似性为96.4%-100%,核苷酸遗传进化分析表明,毒株NEFU1301,NEFU1302, NEFU1102, NEFU1104, NEFU1113表现出高度的序列相似性,与2004-2006年间南方家禽分离株和远东及日本野鸟分离株亲缘关系较近。另外34株classⅡ分离株亲缘关系较近,处于另一个相对独立的集簇,但这39株分离株均与疫苗株亲缘关系较远。结果说明我国野生鸟类中存在NDV的感染,分离株均为弱毒株,提示强毒株在野鸟中并未广泛流行；弱毒株在远东地区、日本地区及中国东海岸线可能已经发生广泛交流；经免疫的家禽可能无法抵御来自野鸟所携带病毒的感染。本研究选择NDV代表株NEFU1106和NEFU1136进行全基因组序列,获得的GenBank登陆号分别为KF361507和KC894391。本研究既丰富了东北地区NDV的流行病学资料,又警示我们要对野生鸟类在NDV传播中所起的作用引起重视,为深入研究NDV的传播、遗传、进化等奠定基础。3、野鸟源APMV6的分离及其全基因组测序通过副粘病毒通用引物PCR检测及电镜观察,确定共分离到2株野鸟源APMV6,分别命名为JL190及JL127。设计特异性引物分16段扩增这两株病毒的基因组,通过软件拼接获得它们的全长基因组序列。其基因组全长为16236nt,获得的GenBank登录号分别为JX522537和KF267717；基因组结构为3'leader-NP-P-M-F-SH-HN-L-Trailer5',根据JL217的F基因及HN基因氨基酸序列构建系统发育树,结果表明,JL127株病毒与TW和FE株亲缘关系较近,与HK株亲缘关系较远。4、副粘病毒V蛋白对抗宿主细胞先天免疫机制的研究扩增新城疫病毒强毒株、弱毒株以及APMV6的V基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建真核表达质粒,分别与IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/Ⅰ-Luc、AP-1-luc报告质粒共转染HEK-293T细胞,接种仙台病毒刺激细胞后,测定细胞内萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果表明,新城疫病毒强弱毒株的V蛋白均能抑制宿主细胞干扰素p的产生,但强毒株V蛋白抑制PRDⅢ/Ⅰ启动子转录的作用要强于弱毒株V蛋白,构建的强弱毒株V蛋白嵌合体表明,强毒株V蛋白C末端在此过程中发挥重要作用；APMV6的V蛋白能通过降低NF-κB的活性显着抑制宿主细胞产生IFN-β。
马旭升[9]2015年在《小反刍兽疫病毒V蛋白拮抗干扰素介导的先天性免疫系统功能位点的确定》文中认为小反刍兽疫(Peste Des Petits Ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste Des Petits Ruminants Virus,PPRV)感染引起的一种高感染性、高致死率疾病。PPRV感染严重损伤宿主动物靶器官,导致巨大的经济损失。目前对于PPRV的发病机制、感染损伤机制以及免疫抑制机制研究不多。本文利用荧光素酶检测发现,过表达西藏毒株PPRV V蛋白能够抑制干扰素的产生和干扰素的信号转导。通过缺失突变技术发现,V蛋白C端对于干扰素的产生起到关键作用。为探明V蛋白的C端抑制干扰素产生的分子机理,进一步采用PPRV V蛋白、V蛋白缺失和单位点突变体共沉淀RLRs通路中的MDA5、RIG-I模式识别受体。结果表明,PPRV V蛋白能够通过其C端的半胱氨酸残基结合MDA5,但对于RIG-I介导的IFN的产生没有影响,同时利用荧光素酶检测发现,V蛋白的C端可利用LGP2模式识别受体的协助,抑制RIG-I介导的IFN的产生。实验研究发现,PPRV V蛋白能够抑制IFN介导的信号转导,利用V蛋白及其突变体,通过荧光素酶检测、免疫共沉淀、pull-down、VSV-GFP感染复制等实验手段,证实PPRV V蛋白的C端抑制STAT2介导的干扰素的信号转导,而PPRV V蛋白的N端却抑制STAT1介导的干扰素的信号转导。深入研究还发现,PPRV V蛋白的C端利用其Cys残基和Trp残基结合STAT2,进而改变STAT2的亚细胞分布;PPRV V蛋白的N端利用Y110位氨基酸残基结合STAT1进而改变STAT1的亚细胞分布。本文深入研究了PPRV V蛋白引起宿主细胞先天性免疫抑制的分子机制,阐明了V蛋白在PPRV抑制RLRs介导的干扰素产生和干扰素介导的信号转导中的作用,为深入了解PPRV感染引起的免疫抑制提供重要的研究基础。
贠炳岭[10]2016年在《禽偏肺病毒F蛋白介导膜融合及抑制β-干扰素机制研究》文中进行了进一步梳理禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV)属于副黏病毒科肺病毒亚科肺病毒属。aMPV感染火鸡引起火鸡鼻气管炎(Turkey rhinotracheitis,TRT),感染鸡引起肿头综合征(Swollen head syndrome,SHS),aMPV感染对养禽业造成经济损失和严重威胁。aMPV入侵宿主细胞需要病毒囊膜和细胞膜融合,这一过程是由融合蛋白(Fusion,F)介导的。然而,aMPV F蛋白介导膜融合的机制尚不清楚。另外,aMPV感染造成继发感染病毒或细菌,但这种免疫抑制效应尚不清楚。本研究旨在阐述aMPV F蛋白介导膜融合机制和aMPV免疫机理。aMPV和人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)都属于肺病毒属。对于hMPV,胰酶和低pH诱导F蛋白介导膜融合呈现毒株依赖性。本研究中发现叁个亚型的aMPV(aMPV/A,aMPV/B和aMPV/C)F蛋白介导细胞融合不需要胰酶。添加胰酶可以促进aMPV/C F蛋白融合活性。通过突变F蛋白100或101位点的氨基酸,发现胰酶调节aMPV F蛋白的融合活性是由100和101位点决定。另外,低pH环境不能促进aMPV/A和aMPV/B F蛋白融合活性,但能促进aMPV/C F蛋白融合活性。突变F蛋白294位点的氨基酸,发现低pH调节aMPV F蛋白的融合活性是由残基294G决定的。剖析aMPV F蛋白介导细胞融合所需基本条件有助于理解aMPV入侵机制。aMPV F蛋白裂解不依赖外源性的胰酶,意味着内源性的蛋白酶就可以裂解aMPV F蛋白,但是宿主中的裂解酶尚未确定。我们发现跨膜丝氨酸蛋白酶(Transmembrane serine protease 12,TMPRSS12)有助于裂解aMPV/B F蛋白。过表达TMPRSS12提高aMPV/B F蛋白的裂解程度、融合活性和aMPV/B复制。干扰TMPRSS12降低aMPV/B F蛋白的裂解程度、融合活性和aMPV/B复制。另外,我们发现aMPV/B F蛋白的100和101位点被TMPRSS12识别,并证实HDS(组氨酸,天冬氨酸,丝氨酸)叁联体是TMPRSS12催化核心。重要的是我们发现TMPRSS12的mRNA在aMPV的靶器官存在。以上结果说明TMPRSS12有助于裂解aMPV/B F蛋白,为aMPV的预防与治疗提供技术支持。裂解的aMPV F蛋白介导膜融合的前提是与细胞表面的受体结合,但是aMPV F蛋白受体尚不清楚。已知的aMPV/B F蛋白含有保守的RDD基序。我们假设RDD与细胞表面的整合素结合启动F蛋白介导膜融合。为验证我们的假设,首先我们证实封闭整合素的多肽降低了aMPV/B F蛋白融合活性和病毒复制。同时我们通过抗体阻断,干扰试验和过表达确定是aMPV/B F蛋白融合活性和病毒复制所需的是整合素αv和β1。其次,过表达整合素αv和β1使得aMPV/B F蛋白和aMPV能在非允许细胞系分别吸附和感染。最后突变RDD成RAE,aMPV/B F蛋白吸附能力和融合活性显着下降。以上结果说明整合素αvβ1是aMPV/B F蛋白受体,促使aMPV/B F蛋白介导膜融合和aMPV/B感染。临床观察aMPV感染引起免疫抑制,但是免疫机理尚未阐明。I型干扰素(Type I interferons,IFN-I)像β-干扰素(Interferon-β,IFN-β)是机体防御的重要组分,在抵抗病毒和细菌感染中发挥重要作用。本研究发现aMPV/B感染的鸡和DF-1细胞后,IFN-β的表达降低。我们进一步证实是aMPV/B F蛋白抑制IFN-β的产生。突变aMPV/B F蛋白的100,101,93位点发现aMPV/B F蛋白裂解水平决定aMPV/B F蛋白抑制IFN-β程度。干扰试验和多肽阻断证实aMPV/B F蛋白下调IFN-β通过Toll样受体3(Toll-like receptors 3,TLR3)和Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)途径,干扰试验和流式分析证实aMPV/B F蛋白下调IFN-β与簇分化抗原14(Cluster of differentiation 14,CD14)有关。重要的是aMPV/B F蛋白降低脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的免疫效应。以上结果说明aMPV/B引起鸡的免疫抑制好像是通过F蛋白与CD14结合从而降低IFN-β的产生。aMPV F蛋白介导膜融合需要经过裂解和结合受体的过程,剖析这些过程有助于了解aMPV的入侵和感染。上述研究证实,aMPV F蛋白的100,101和294位点决定胰酶和低pH调节F蛋白融合活性。我们进一步揭示aMPV/B F蛋白裂解不需要胰酶的原因是TMPRSS12可以裂解aMPV/B F蛋白。而且发现整合素αvβ1是aMPV/B F蛋白和aMPV/B感染的受体。另外,我们证实aMPV/B F蛋白裂解程度决定IFN-β表达量,同时发现CD14参与aMPV/B F蛋白下调IFN-β。本研究阐明了aMPV F蛋白介导膜融合机制和aMPV免疫抑制机理,有助于理解aMPV的发病机制。
参考文献：
[1]. 犬瘟热病毒、犬冠状病毒入侵宿主细胞机制研究[D]. 柏亚铎. 中国农业大学. 2005
[2]. 副粘病毒入侵宿主细胞的机制研究[D]. 王晓佳. 中国农业大学. 2004
[3]. 小反刍兽疫病毒N75-1株入侵宿主细胞的途径研究[D]. 陈志杰. 西北农林科技大学. 2017
[4]. 禽副粘病毒囊膜蛋白研究进展[C]. 宋战昀, 韩文瑜, 丁壮. 全国人畜共患病学术研讨会论文集. 2006
[5]. 人副流感病毒3型融合蛋白连接区对膜融合功能的影响及机制研究[D]. 谢文艳. 山东大学. 2016
[6]. 泛素—蛋白酶体系统对新城疫病毒复制的影响[D]. 曲昱蓉. 中国农业科学院. 2014
[7]. BmCPV受体蛋白的筛选鉴定及家蚕翅原基发育的分子机制研究[D]. 张轶岭. 苏州大学. 2014
[8]. 野生水禽副粘病毒的分离鉴定及Ⅴ蛋白对抗宿主细胞先天免疫机制的研究[D]. 田志革. 东北林业大学. 2015
[9]. 小反刍兽疫病毒V蛋白拮抗干扰素介导的先天性免疫系统功能位点的确定[D]. 马旭升. 中国农业科学院. 2015
[10]. 禽偏肺病毒F蛋白介导膜融合及抑制β-干扰素机制研究[D]. 贠炳岭. 中国农业科学院. 2016
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