（1.广东医科大学顺德妇女儿童医院 佛山市顺德区妇幼保健院 儿童重症监护病房（PICU） 广东佛山 528300；2.广州金域医学检验中心科研部 广东广州 520000）
摘要：目的 通过建立川崎病（KD）冠状动脉炎的鼠动物模型，观察小鼠冠状动脉损伤（CAL）p53、p21蛋白基因表达及意义。方法 将48只川崎病冠状动脉炎小鼠分为实验组（KD模型组）及正常对照组，采用免疫组化SP三步法检测川崎病冠状动脉损害p53、p21蛋白基因表达。结果 p53及p21蛋白在正常对照组心肌细胞的胞质中均为弱阳性（±）表达（为无意义表达），在KD实验组心肌细胞的胞质中均为中度阳性++表达，两组间差异有统计学意义（P<0.01）。结论 川崎病CAL的发病与p53、p21蛋白过度表达密切相关，p53、p21蛋白是导致川崎病CAL病理变化的重要风险易感因子。
关键词：川崎病；冠状动脉损害；小鼠；p53蛋白；p21蛋白
Expression and significance of p53 and p21 for coronary artery injury in kawasaki disease mice.Deng minghong 1，Lin chunwang 1，Huang guochun 1，Zeng xianglin 1，Liu ziguang 1，Wu haiyan 1，Wu xiaofeng 2，Liu fengzhi 1，Zhang jianping 1.The Women and children's Health Hospital of Shunde，Foshan 528300，China.
[abstract] Objective To establish a mouse model of kawasaki disease（KD）whith coronary artery injure（CAL）and observe the expression and significance of p53 and p21 protein genes in mice.Methods 48 mice with kawasaki disease were divided into the experimental group（KD model group）and the normal control group.The gene expression of p53 and p21 was detected by immunohistochemical SP method.Results Both p53 and p21 proteins were weakly positive（±）expression（insignificant expression）in the cytoplasm of cardiac cells in the normal control group and moderately positive（++）expression in the cytoplasm of cardiac cells in the KD test group，and between the two groups the difference was statistically significant（P<0.01）.Conclusion The incidence of CAL in kawasaki disease is closely related to the over-expression of p53 and p21 proteins，which are important risk susceptibility factors leading to the pathological changes of CAL in kawasaki disease.
[key words] kawasaki disease；Coronary artery injure；Mice；P53 protein；P21 protein
川崎病（Kawasaki disease，KD）是儿科常见自身免疫性疾病，近年来发病率有逐年增高趋势。川崎病主要病理改变为全身性非特异性血管炎，可发生冠状动脉损害（coronary a rtery lesion，CAL），常见冠状动脉扩张，其中一部分发展为冠状动脉瘤破裂而致死，亦可因冠状动脉狭窄致缺血性心脏病而致心肌梗死和猝死。因此早期发现川崎病的CAL及早期干预意义重大。然而，川崎病病因及发病机理至今不明，因此，建立冠状动脉炎的动物模型，深入进行川崎病伴发CAL的病理机制研究至关重要。本项目拟于通过免疫组化测定川崎病冠状动脉炎动物模型小鼠p53、p21蛋白基因的表达，分析CAL的发病机制与p53、p21蛋白基因表达的相关性，明确p53、p21蛋白CAL的发病的重要易感因子，为研究川崎病CAL的发病机制提供了新的视野和实验依据。
1.对象和方法
1.1 对象 观察对象为佛山市顺德区妇幼保健院儿童重症监护病房（PICU）及广州金域医学检验中心科研部2015年6月-2018年6月完成的48例KD合并CAL的小鼠动物实验。48例小鼠随机分为实验组（KD模型组，n=24）及正常对照组（n=24）.48只健康清洁级成年C57BL/6小鼠雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供[许可证号：SCXK（粤）2008-0002 ]，置入22-26℃通风的动物饲养室内适应性饲养一周，每日喂饲的普通级饲料由广东省医学实验动物中心提供。
2.2 动物实验方法 将24只C57BL/6小鼠建立川崎病冠状动脉炎模型鼠：分别在第1和第4周连续5天腹腔注射白色念珠菌提取物（candida albicans-derived substances，CADS）0.5 mL/100g，模拟川崎病的冠状动脉炎，再采用以上方法饲养14天后牺牲性（were sacrificed）处死小鼠。KD模型组观察心脏根部冠状动脉中膜增厚，血管壁成纤维细胞增生，弹力纤维断裂，炎症细胞浸润，心肌细胞溶解及坏死以判断KD模型建立成功与否。
2.3 组织标本采集 选取心脏冠状动脉根部以外的左右冠状动脉，洗涤去除血细胞后，投入到4%多聚甲醛0.1M PBS（PH 7.1～7.4）中进行常规固定、脱水、石蜡包埋，横断面平行连续作6μm病理切片，进行免疫组化检测。
2.4 p53、p21蛋白基因免疫组化检测 免疫组织化学染色技术按SP三步法说明书进行［1，2］。P53 和P21蛋白表达结果的观察：光镜下，细胞浆呈棕黄色或棕褐色染色的即为阳性，呈淡黄色为弱阳性（无意义表达），不染色者为阴性。结果判断参照文献标准［3］。正常对照组实验检测方法与观察组相同。
2.5 实验试剂：免疫组织化学检测心肌组织p53、p21蛋白表达试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
2.6 统计学处理：应用SPSS 20.0统计软件将测得的p53、p21蛋白基因表达数据进行分析。采用χ２检验和校正χ２检验进行率差别的检验，检验水准P值< 0.05为差异有显著性。
2．结果
2.1 川崎病合并CAL（实验组）及对照组p53、p21蛋白基因表达的阳性率
24只川崎病合并CAL小鼠p53、p21蛋白基因呈中度阳性（++）表达分别为23只及24只，弱阳性（±）表达分别为1只及0只；24只健康对照组小鼠p53蛋白、p21蛋白基因呈中度阳性（++）表达均为0只，呈弱阳性（±）表达分别为24只及22只（为无意义表达）。两组p53、p21蛋白基因表达阳性率（++）分别为95.83%、0.00%及100%、0.00%，经统计学处理χ２值分别为8.95，9.99，P<0.01。见表1，图1，图2。
表1 川崎病合并CAL实验组与对照组p53、p21蛋白基因表达的阳性率（++）比较（χ２）
注：弱阳性（±）为在无意义表达在免疫组化检测结果判断视为无意义表达，故不进行统计学处理。
图2 结果显示，P53蛋白在对照组心肌细胞的胞质中有弱阳性（±）表达，在KD模型组心肌细胞的胞质中有中度阳性++表达，两组差异有显著性（P<0.01）。
3.讨论
川崎病是一种以全身性中、小动脉炎性病变为主要病理改变的急性发热性疾病。最严重的危害是CAL所引起的冠脉扩张和冠状动脉瘤的形成，是儿童后天性心脏病的主要病因之一［4］。然而川崎病具体的发病原因及机制到目前为止尚未明确，普遍认为易感人群在受到感染因素作用后发生的免疫系统异常活化是川崎病血管炎发生的基础［5-7］。缺乏导致CAL病理变化的风险易感因子的认定，从而很难揭示CAL的本质。
研究证明，细胞DNA损伤时，常有p53、p21蛋白表达升高［8］。p53通过调控p21表达执行p53的部分功能，并通过抑制cyclin-CDK复合物及PCNA导致G1期停滞，一旦p53失去对p21表达的调控作用，便会失去对细胞DNA的稳定［8，9］，从而失去对细胞DNA免受损伤的保护作用。研究报道，在缺氧或致炎因素诱导的中层血管平滑肌细胞凋亡的相关研究中，结果显示p53蛋白的表达可明显促进血管平滑肌细胞的凋亡［10，11］。腹主动脉瘤发生机制的研究显示，动脉壁中层弹力纤维的广泛断裂和退化、胶原纤维所占百分比相对过多、免疫及炎性细胞的慢性透壁浸润、免疫球蛋白沉积、动脉中层平滑肌细胞（SMC）数量减少是腹/主动脉瘤的病理改变，p53蛋白是腹主动脉瘤SMC凋亡的分子标记物，凋亡的发生与SMC内p53蛋白过量表达相关［12］。
然而，迄今未见川崎病导致冠状动脉SMC损伤的风险易感因子认定的研究。本研究通过免疫组织化学检测川崎病冠状动脉根部组织p53、p21蛋白表达，结果显示24只川崎病合并CAL小鼠中23只p53蛋白基因呈中度阳性（++）表达，1例呈弱阳性（±）表达；全部川崎病合并CAL小鼠p21蛋白基因均呈中度阳性（++）表达表达。表明p53、p21蛋白可能是川崎病导致CAL的风险易感因子，为川崎病导致CAL通过p53调控p21的发病机制提供了线索及实验依据。对照组均呈弱阳性（±）表达，根据免疫组织化学检测结果判断参照文献标准［3］视为无意义表达。
李艳春等的研究报道，正常主动脉的中层组织检测不到p21蛋白，p21蛋白仅限于腹主动脉瘤的SMC中，表明腹主动脉瘤中SMC的凋亡与p53和p21的过量表达有关［13］。而本研究结果显示24只健康对照组小鼠23只冠状动脉根部组织p53蛋白、p21蛋白基因呈弱阳性表达，表明正常冠状动脉中是可以检测到微量的p21蛋白，微量的p21蛋白只要不被激化是不足以对动脉SMC造成损伤。
本研究得出以下结论：通过川崎病建立川崎病冠状动脉炎鼠动物模型，观察小鼠CAL p53、p21基因表达，首次证实CAL的发病与p53、p21蛋白过度表达密切相关，p53、p21蛋白是导致川崎病CAL病理变化的重要风险易感因子，为研究川崎病CAL的发病机制提供了新的视野和实验依据。
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[基金项目]：佛山市科学技术局2015年攻关项目（No：2015AB002413）.
论文作者:邓明红1 林春旺1 黄国淳1 曾祥林1 刘自光1 吴海燕1
论文发表刊物:《航空军医》2018年21期
论文发表时间:2018/12/24
标签：蛋白论文; 川崎论文; 小鼠论文; 冠状动脉论文; 冠状论文; 基因论文; 细胞论文; 《航空军医》2018年21期论文;