天津市血液中心 天津 300110
随着血液制品病毒核酸检测技术的不断进步，输血导致的病毒感染风险显著降低。血液的细菌污染比输血传播的病毒感染致病性和致死性更强，加上一些容易细菌污染的成分如：从400ml全血分离血小板并汇集的浓缩血小板使用的增加，输血相关细菌污染越来越受到重视。
1 细菌污染的发生率
由于许多因素，血液成分是包含各种感染因子风险的病毒和细菌.尽管已经显著减少输血相关病毒感染的风险，但在供血机构和医院，细菌污染仍然是血液的持续存在的问题，特别是血小板浓缩物（PC）在所有血液成分中的风险最高，每年输入数百万血小板浓缩（PC）细菌污染率高达1/1000?3000单位.，而红细胞为500，000单位中只有1例或更少。冷沉淀和新鲜血浆传播的细菌感染更加少见.所以许多患者因此面临诸如败血症等危及生命的输血相关疾病的危险[1]。多人份制备的血小板比单采血小板细菌污染的几率要多。一项研究表明，保存5天的多人份血小板制品和单采血小板细菌污染比例分别为0.7%和0.4%。接受多人份血小板制品发生细菌污染的机率，美国报道4，200例输注患者中有1例，香港为2，100次输注中发生1例。因此，血小板输注相关的细菌污染应引起大家的重视[2-3]。
2 容易细菌污染的成分种类
血小板储存的温度（22±2℃）利于细菌的生存和生长。尤其是从全血分离的浓缩血小板，来源于多人份，穿刺进入细菌的几率比单采血小板要高很多。相反，红细胞储存在4℃，此温度对绝大多数细菌不利于生长[4]。
3 细菌污染的来源
（1）内源性污染：内源性污染来自于免疫功能正常的献血者无症状或低水平的菌血症，如献血者近期内患皮肤局限性或广泛性炎症、拔牙或做小手术、急性泌尿道感染、肺炎、痢疾、伤寒等疾病，正处于恢复期，身体内可能存在少量无症状菌血症。如果不幸采到无症状菌血症的献血者时，血制品将受污染。一旦肿瘤患者、血液病或骨髓移植等免疫抑制患者，输入受细菌污染的血液成分，将导致严重败血症。Bryant 等报告2例无症状P .multocida 菌血症的血小板献血者。其中1 例献血者被猫咬伤后数小时即捐献血小板，招募人员没有询问是否发生动物咬伤情况，而献血者也没有意识到告知此经历的必要，以致日后含高细菌载量和内毒素的血小板输入患者后造成死亡。虽然献血者无症状菌血症所引起的血液污染不为常见，但一旦污染所造成后果是致命的，应予以重视。
表1 红细胞悬液和血小板输注相关的细菌污染
（2）外源性污染：最常见的血小板制品细菌污染。抗凝剂、血袋、采血器具和输血器具、机采耗材的连接处不密闭、微孔、夏天冷凝水造成的血袋渗透性增强、离心杯破损受污染而致。曾有报道血袋受黏质沙雷菌污染所致输注血小板脓毒血[5]。献血时由于静脉穿刺针穿刺前被空气污染，或穿刺部位被空气污染后皮瓣随针头进入血袋污染血液，献血者采血的前肘凹的结痂、深层皱纹、毛囊、皮脂腺中，可能有一定的皮肤定植菌，通过常规皮肤清洗消毒不能完全清除所有细菌，细菌在采血过程中可经针头进入血袋污染血液。400ml全血分离血小板并汇集的浓缩血小板是单采血小板的重要补充，可以节约大量的血液成分。随着全血成分分离机的推广，全血分离血小板的质量和稳定性的提高，其制备量不断升高。但由于比单采血小板穿刺次数的增加（6-8人份全血分离的血小板相当于一个治疗量的单采血小板）其细菌污染的风险限制了其发展。
4细菌污染的种类
5减少污染的措施
（1）加强献血者筛选：排除处于菌血症状态的高危献血员人群，尤其是那些24h内接受口腔科治疗的人群。加强献血者筛选过程中的问讯，排除处于菌血症状态的献血者，就可以有效减少细菌污染血液的发生。然而，目前献血员问讯中的一些问题并不能排除患有小肠结肠炎耶尔森氏菌等感染的人员，因为这些细菌感染的症状没有特异性。（2）重视采血过程：注重皮肤消毒的细节，采血者应尽量避开有明显疤痕的部位进行静脉穿刺。此外，去除献血者最先流出的20～30mL血液，或者应用一些专门设计的带有附加小袋的塑料采血袋来收集献血者最先流出的血液。研究表明，这些措施可减少细菌污染的发生[6]。（3）控制血液成分保存的时间：血小板中细菌增殖一般发生在采集后24～48h，保存3d后的血小板发生细菌污染的几率会逐渐增加。血小板保存袋生产工艺的革新使得美国血小板保存时间延长到5～7d，但是与细菌污染相关的严重输血反应的发生也急剧上升，使得血小板保存又回复为5d，这个风险在从全血分离汇集血小板中更为突出，现在其保存时间一般不超过制备后24小时。对红细胞悬液而言，小肠结肠炎耶尔森氏菌是主要的污染菌。现在的保存液和塑料袋使得红细胞悬液可以保存35d或者42d。小肠结肠炎耶尔森氏菌增殖一般发生在保存21d后。如果将红细胞悬液的保存时间控制在21d，将明显减少这种情况。（4）血液成分的保存温度：22℃保存的血小板最容易细菌增殖，血小板在较低温度下保存将显著降低它们的活力和功能。采用新的保存液、保存方式等方面来降低保存温度等需要深入研究。（5）去除白细胞：：白细胞的吞噬细菌功能对消除血液中活细菌起重要作用。但是保存在全血中的白细胞很容易死亡并释放出细菌。因此，为了减少血液发生细菌污染的机会，提倡滤除白细胞。血液采集后滤除白细胞的时间并非越早越好。研究表明，过滤应该是血液采集8h后才有效，因为8h吞噬细菌过程才能完成。
6检测细菌污染的方法
由于上述措施不能杜绝细菌污染，许多专家尝试各种方法来去除血制品中的细菌污染，如使用密封袋、高频热合器、抑制细菌生长法、或用8 -甲氧基补骨脂素加长波紫外线灭活法、转移技术、光化学病原体灭活等。但技术自身缺陷和人为因素，没有一种方法是绝对有效。由于细菌污染的主要成分是血小板，所以需要合适的血小板的细菌检测方法。目前国外的一些血液中心已经将血小板制品的细菌污染检测纳入到常检测项目中检测细菌的方法有很多，包括直接涂片法、生化试纸检测法、细菌培养法、全自动细菌培养系统、抗原抗体检测系统、核酸杂交法、抗生素探针、内毒素探针、双向电泳法、替代物标志法。完美的测试应该有非常高的诊断灵敏度和特异性，价格便宜，可靠快速。到目前为止，没有一个评估的方法能够满足所有这些要求[7]。
除了传统的微生物学方法或替代标记，在很长一段时间内，用纤维试纸条测量葡萄糖浓度改变和pH值，来判定细菌污染（如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、仙人掌杆菌、肺炎沙雷伯杆菌、沙雷菌属等检出率95 %，敏感度>107cfu/ml）。但并不是所有的菌株在生长时引起pH 值的变化（如阴沟肠杆菌对pH 测定不敏感），而且革兰阳性菌也无法通过葡萄糖浓度的改变来检测，因此，这种方法灵敏度低，对某些菌种并不适用，不能为常规方法检测。显微镜检查是PC中细菌检测的常用方法，早期采用的涂片染色方法简便、快速，但灵敏度低（104 ～105cfu/ml），且菌株不同着色不同，亮度也有差别，显微镜观察时存在人为误差；已被证明在临床使用中无效，而且导致由于假阳性结果造成浪费。当今全自动细菌培养系统是相对比较理想的检测方法[8]。
7全自动培养系统在血小板细菌筛选的应用策略：
一般来说，检测细菌的诊断方法在浓缩血小板中可以分为：（1）使用培养与早期抽样策略相结合；（2）使用培养结合晚期抽样策略的方法；（3）使用快速直接检测与晚期采样策略相结合的方法；（4）使用快速间接检测细菌与晚期采样策略相结合的方法[9]。表2中提供了现有市售细菌筛选方法的概述。
表2 常用的细菌筛选方法
7.1使用培养与早期抽样策略相结合，遵循“到期阴性”的原则
（1）全自动培养系统：许多国家应用全自动培养系统来筛选PCs细菌污染（到期阴性原则）细菌培养需要时间，所以要在PCs保存期早期取样（一般在采血后24小时内）。培养7天，如果阴性，PCs发出，但是继续进行培养。如果结果状态从阴性转为阳性，则必须立即通知产品需要召回。早期取样的抽样误差很（1：14，000–1：50，000），这是由于污染的细菌量很少，特别是生长缓慢的细菌。随着PCs的保存，抽检误差逐渐减少。检出率从第一天的14.9%到第七天的100%。一般培养法有着最高的灵敏度（<10CFU/ml）但是到期阴性的原则使得灵敏度降低，因为有一定百分比的PCs在阳性检出时已经被输注。目前三种自动化培养方法已经在日常使用中或已经验证了血小板质量控制：BacT /ALERT系统（法国BioMérieux），Bactec（BD Diagnostics，USA）和VersaTrek系统（Trek Diagnostics，USA）[10-11]。
（2）Haemonetics eBDS（（原名Pall eBDS）
另一个由FDA批准的被引入日常实践的是Pall eBDS系统（美国Pall Corporation）现在是 Haemonetics eBDS，它监测在37℃下孵育袋的顶部空间中的氧浓度。这个系统是基于不断增长的有氧和兼性厌氧菌消耗血浆中的氧气而样品袋的空气中的氧气和血浆相平衡。收集3 ml样品后，自动培养系统应运行至少24小时，然后将袋子热封，并在35℃下恒温搅拌并随后测量氧气浓度。如果O2读数小于12.5％，则为细菌污染。这种技术不能检测绝对厌氧菌，有假阴性风险。
Pall eBDS系统的灵敏度类似于BacT / ALERT系统为1CFU /ml
（3）微量热技术（Microcalorimetry）
测量培养中复制微生物的热量已被用于检测PC中的细菌。使用微量热计温控器来测量热流曲线。样品产生或吸收的任何热量都是随着时间不断测量。然而，由于培养步骤，该方法需要与早期抽样策略相结合，因此，采样误差的风险相对较高[12]。
7.2培养与晚期抽样策略相结合
使用培养与晚期抽样策略相结合目前正在讨论中。Sireis等人提出了利用BacT / Alert作为可能的快速筛选方法。但基本上所有其他基于培养的方法也是适用的[13]。
自动化培养是提高血液成分细菌安全性的里程碑，但是到目前为止，培养方法一直与早期抽样结合，因此呈现出高抽样误差的风险。解决这个风险，只有进行晚期采样，快速方法可以推迟取样并最小化采样误差，所以快速检测方法是细菌筛选的重点。
7.3使用快速检测直接检测PC中的细菌结合晚期采样方法
（1）实时PCR（NAT系统）：已经使用2个靶区域16SrDNA和23S rDNA中的保守核酸序列来开发实时PCR检测。分析灵敏度从5到50不等CFU /毫升。然而DNA的提取和扩增试剂也存在痕量污染细菌DNA；而且有些细菌（如嗜水生或大肠杆菌）是用于PCR扩增的酶原。因此，在PCR中出现的非特异性信号可能会降低本系统的灵敏度[14]。
（2）PGD：PGD检测系统是首个对提取自全血的混合血小板制品进行输注前快速检测细菌污染的系统，不需要培养过程，在60s内即可显示有无细菌。原理是制备靶向编码革兰阳性菌的脂磷壁酸（LTA）和革兰阴性菌的脂多糖（LPS）的保守基因序列的单克隆抗体，与细菌细胞壁表面大量表达的抗原反应［15-16］。该系统的检测限较高（约为103CFU/ml），不能用作血小板质量控制检测方法。
（3）BacTx肽聚糖测定：该系统是通过革兰阳性菌和革兰阴性菌的细胞壁共有成分肽聚糖启动酶反应发出可见光，BacTx阅读器和软件自动根据可见光颜色强度变化，提供细菌污染动力学结果，该系统能够标志任何污染的血小板，测试时间不到1h，敏感性阈值为104CFU/ml。但这个检测方法还是没能克服对革兰阴性菌特异性不强的问题[17]。
目前，3种快速方法，BactiFlow，NAT和PGD系统，对PCs的细菌筛选是可行的，PGD测定的性能最接近床边测试；然而灵敏度相对较低>103CFU/ml。
7.4使用快速检测方法间接检测PC中的细菌与储存或晚期取样中的连续采样相结合
（1）血小板聚集（2）非侵入性pH测量（3）氧气测量
这些间接检测方法需要评估其在常规筛选中的适用性及其对不同细菌菌株的表现，但连续无创的方法监测避免了抽样错误的风险。
综上所述，血小板制品细菌污染的问题不容忽视，也是血小板输注中细菌污染一个急需解决的难题。美国血库协会（AABB）22 版标准正式增加5.1 .5 .1 条款中，要求血站和血库采取措施减少血小板制品的细菌污染，并要求对血小板制品做细菌检测[18]。目前，我国大部分采供血机构未将血小板制品细菌污染检测纳入常规检测项目。因此我们应该研究成本低、灵敏度高、特异性好、快速的试剂，对血小板制品进行常规项目检测，有效防止血小板细菌污染的输入，最大限度地降低输血反应发生率，保证输血安全。
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论文作者:康娜
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第12期
论文发表时间:2017/9/14
标签：细菌论文; 血小板论文; 血液论文; 方法论文; 菌血症论文; 系统论文; 灵敏度论文; 《中国误诊学杂志》2017年第12期论文;